작은 절지동물에서 체림프를 수집하기 위한 정확하고 정량화 가능한 방법

동물과 식물 바이러스는 모두 절지 동물에 의해 전염 될 수 있으며,이 바이러스는 인체 건강에 심각한 위협이되며 농업에서 엄청난 경제적 손실을 초래합니다 ^1,2,3. 중요한 것은 절지동물의 순환계이자 면역계의 중요한 요소 역할을 하는 절지동물 혈림프가 아르보바이러스 전파를 조절하는 데 중요한 역할을 한다는 것입니다. 절지동물의 내장을 통해 획득된 바이러스는 불리한 혈림프 환경을 성공적으로 탈출한 후에만 다른 조직으로 운반된다 4,5,6,7. 절지 동물 혈림프에서 바이러스의 수명주기는 유체 혈장에서의 바이러스 생존, 혈구로의 진입 및 다른 조직으로의 수송을 포함하며, 다양한 바이러스 - 벡터 상호 작용 메커니즘이 혈림프에서 발생합니다 8,9,10,11,12. 예를 들어, SBPH에 의한 RSV의 수직 투과는 SBPH 비텔로제닌 단백질과 RSV(rice stripe virus) 캡시드 단백질 사이의 분자 상호작용에 의존한다(^13,14). 일부 바이러스는 특정 벡터 인자^15,16,17,18에 결합하여 체림프의 면역 반응을 피할 수 있습니다. 따라서 절지동물의 체액에서 벡터-바이러스 상호작용을 조사하는 것은 아르보 바이러스 전파에 대한 더 나은 이해를 개발하는 데 중요합니다.

planthoppers, leafhoppers 및 일부 모기와 같은 일부 작은 곤충의 체액은 크기 때문에 수집하기가 어렵습니다. 이 문제를 해결하기 위해 주사기 바늘을 곤충 몸에 직접 삽입하여 미세량의 체액을 추출하고, 끝이 가는 핀셋으로 상처 부위에서 삼출물을 수집하고, 직접 원심분리하는 등 체액을 수집하는 여러 방법이 개발되었습니다. 이러한 방법은 혈림프^내의 상대적 유전자 발현 수준 및 바이러스 역가의 측정을 가능하게 했습니다 19,20,21. 그러나 혈구 계수, 단백질 정량 및 효소 활성 분석에 필요한 체액 림프량을 정량화하는 효과적인 방법은 현재 이러한 작은 곤충에 대해 사용할 수 없습니다.

SBPH (작은 갈색 planthopper)는 몸 길이가 약 2-4 mm 인 작은 곤충 벡터의 일종입니다. SBPH는 RSV, 옥수수 거친 난쟁이 바이러스 및 쌀 검은 줄무늬 난쟁이 바이러스^22,23,24를 포함한 다양한 식물 바이러스를 전염시킬 수 있습니다. SBPH와 RSV 간의 상호 작용은 지난 10년 동안 심층적으로 연구되었습니다. SBPH 작업을 용이하게 하기 위해 우리는 혈림프를 수집하는 새롭고 간단한 방법을 개발했습니다. 모세관력의 원리를 기반으로 하는 이 방법은 눈금 표시가 있는 모세관을 사용하여 곤충의 체림프를 정확하고 정량화할 수 있는 방식으로 획득합니다. 이를 통해 작은 곤충에서 특정 부피의 체액을 효율적으로 수집하고 작은 벡터의 체액 림프 환경을 더 자세히 연구 할 수 있습니다.

1. 곤충 사육

1. 이 실험에 사용된 SBPH를 벼 묘목(Oryza sativa cv. Nipponbare)에서 올립니다. 인큐베이터(65mm x 200mm)에 벼 묘목 20그루를 심고 25°C에서 16시간 광도/8시간 어두운 광주기에서 자랍니다.

2. 체액 채취를 위한 SBPH의 해부

1. SBPH를 원심분리기 튜브에 넣고 얼음 욕조에 10-30분 동안 담가둡니다.
   알림: SBPH를 얼음 욕조에 10분 미만 두지 마십시오.
2. 냉동된 SBPH를 복부가 위를 향하도록 하여 실체현미경(재료 표 참조)으로 유리 슬라이드(재료 표 참조)에 놓습니다. 곤충의 여섯 다리에 초점을 맞추십시오.
3. 초미세 팁이 있는 두 개의 고정밀 핀셋( 재료 표 참조)을 준비합니다. 한 핀셋을 사용하여 곤충의 몸을 눌러 제자리에 고정하고 다른 핀셋을 사용하여 곤충의 다리 중 하나를 조심스럽게 잡아당깁니다.
   알림: 단단한 껍질을 가진 곤충의 경우 안과용 메스를 사용하여 다리 중 하나를 잘라낼 수 있습니다.
4. 핀셋으로 곤충의 가슴을 부드럽게 눌러 혈림프가 상처를 통해 흘러 나오도록합니다.
   참고: 체액 림프는 눈에 보이는 흰색 응집이 없는 투명한 물방울로 나타납니다. 지방체 오염을 나타내는 흰색 응집이 있으면 지질을 버리십시오.

3. 마이크로피펫을 이용한 체액 채취

1. 마이크로 피펫을 준비하십시오. 1 μL 부피의 모세관(재료 표 참조)을 피펫 전구에 넣습니다(재료 표 참조). 정확한 측정을 위해 눈금선이 보이는지 확인하십시오.
   알림: 피펫 전구 상단에 작은 구멍이 필요합니다.
2. 체액 림프를 채취 할 때 마이크로 피펫의 피펫 전구를 잡고 모세관을 곤충 상처 가까이에 놓습니다. 모세 혈관의 끝을 혈 림프에 대는 것만으로 상처에서 흘러 나오는 혈 림프를 수집하십시오.
3. 모세관 내부의 액체가 원하는 눈금선에 도달하면 흡수 과정을 중지하기 위해 손가락으로 피펫 전구 상단의 작은 구멍을 약간 막습니다.
   참고: 지질 오염 및 튜브 막힘을 방지하기 위해 1μL의 체액 림프 샘플 1개를 끊임없이 빠르게 수집하십시오.
4. 피펫 전구를 눌러 수집된 체림프를 100μL의 PBS 완충액(137mmol/L NaCI, 2.7mmol/L KCI, 4.3mmol/L_Na2HPO4, 1.4mmol/L KH 2PO4, pH 7.2-7.4)으로 배출합니다.
   알림: 모세관은 PBS 버퍼에 삽입됩니다.
5. 다른 1μL 체액림프 샘플을 수집할 때 새 모세관으로 교체하십시오.

4. 쿠마시 블루 염색

1. 3단계에서 설명한 프로토콜에 따라 3단계 유충에서 동일한 부피(1μL)의 체액림프 샘플 3개를 수집하고 수집된 체액림프를 PBS 완충액으로 배출하여 총 부피를 100μL로 만듭니다.
2. 희석된 혈림프 샘플 100μL에 5x 단백질 로딩 완충액(250mmol/L Tris-HCI [pH 6.8], 10% W/V SDS, 0.05% W/V 브로모페놀 블루, 50% W/V 글리세롤, 5% W/V β-메르캅토에탄올) 25μL를 추가하고 가열하여 단백질을 변성시킵니다.
3. 끓인 샘플 20μL를 10% SDS-PAGE 단백질 젤( 재료 표 참조)에 로드하여 단백질을 분리합니다.
4. 실온에서 1시간 동안 쿠마시 블루 용액(쿠마시 브릴리언트 블루 R-250 1g과 이소프로판올 250mL, 빙초산 100mL,_ddH2O650mL를 혼합하고 여과지를 사용하여 입자를 걸러냄)에 겔을 염색한 다음 탈색 용액(아세트산 100mL, 400 mL의 메탄올, 500 mL의_ddH2O).

5. 단백질 농도 결정

1. 10mg/mL 소혈청알부민(BSA)을 5mg/mL, 2.5mg/mL, 1.25mg/mL, 0.625mg/mL 및 0.3125mg/mL로 PBS 완충액으로 2배 희석법을 사용하여 희석합니다.
2. 5.1단계에서 PBS 완충액 5μL와 각 농도의 BSA 용액을 흡인하고 1x Bradford 염료 시약 1mL( 재료 표 참조)를 추가하고 실온에서 5분 동안 배양합니다. Bradford 염료 시약의 PBS 버퍼를 대조군으로 사용하고 OD = 595 nm에서 0을 사용합니다. 나머지 단백질 농도 각각의 흡광도 값을 측정하고 표준 곡선을 만듭니다.
3. 유충, 암컷 또는 수컷 SBPH의 체림프 1μL를 PBS 완충액 100μL에 넣은 다음 샘플을 1,000°C에서 10분 동안 4x g 로 원심분리하여 혈구를 제거합니다.
4. 새로운 원심분리기 튜브에 90 μL의 상층액을 흡인하고, 단계 5.2의 지시에 따라 상층액의 흡광도 값을 측정한다.
5. 표준 곡선의 회귀 방정식에 따라 체액 림프 샘플의 단백질 농도를 계산합니다. 실험에 3개의 기술적 반복실험이 있는 3개의 생물학적 반복실험을 포함합니다.

6. 현미경 검출

1. 마이크로피펫을 사용하여 다양한 발달 단계에서 10-15 SBPH에서 체림프를 수집합니다. 수집된 체액림프를 20μL의 4% 파라포름알데히드 용액이 들어 있는 튜브에 추가합니다( 재료 표 참조). 혼합물을 실온에서 30분 동안 배양하여 체림프를 고정시킵니다.
2. 실란으로 코팅된 슬라이드 중앙에 고정된 헤모세포 20μL를 피펫으로 만듭니다( 재료 표 참조).
3. 슬라이드 건조 랙에서 물방울을 건조시킵니다.
   알림: 과도한 건조를 피하십시오.
4. 금 변색 방지 시약인 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)로 샘플을 덮고(재료 표 참조) 도립 현미경으로 슬라이드를 검사합니다(재료 표 참조).

7. 세포 정량

1. 마이크로피펫으로 SBPH에서 1μL의 체액림프를 수집하고 20μL의 PBS 완충액에 용해합니다.
2. 체액 림프 샘플을 PBS 완충액으로 5배 희석한다.
3. 20 μL의 체림프 용액을 세포 계수 챔버의 중앙에 피펫팅합니다( 재료 표 참조). 비말을 커버슬립으로 덮습니다( 재료 표 참조).
4. 세포 계수 챔버(보충 그림 1)의 5개 사각형에 있는 세포를 도립 현미경으로 계수합니다( 재료 표 참조). 각 실험에 3개의 기술적 반복실험이 있는 3개의 생물학적 복제물을 포함합니다.
   세포/μL = 5 × × 5개의 중간 제곱의 총 개수 희석 계수 × 10⁴

8. 통계 분석

1. 해당 소프트웨어로 통계 분석을 수행합니다( 재료 표 참조). 새 파일을 만들고, 열을 선택하고, 데이터를 가져오고, 막대가 있는 산점도를 생성합니다.
2. 열 통계량을 사용하여 각 데이터 그룹에 대한 평균과 SD를 계산하고 일원 분산 분석 도구를 사용하여 그룹 간 차이의 유의성을 평가합니다. 3개의 독립적인 실험을 통해 3개의 생물학적 복제물에서 평균과 SD를 결정합니다.

마이크로피펫 모델 및 체림프 수집
우리는 모세관의 모세관력에 기초하여 작용하는 간단한 마이크로 피펫을 개발했습니다. 마이크로피펫은 모세관과 피펫 전구로 구성됩니다(그림 1A). 모세관은 1 μL에서 20 μL까지 다양한 부피 크기로 제공되며 모세관 부피는 요구 사항에 따라 선택됩니다. 부피가 작은 모세관은 부피가 작은 튜브의 매우 미세한 구멍으로 인해 체액과 같은 액체를 흡수하기 어려울 수 있으므로 권장되지 않습니다. 피펫 전구의 상단에는 체액 채취 중에 막을 수 없는 구멍이 있습니다. 이 피펫 전구는 액체 수집 중에 마이크로피펫을 고정하는 데 편리하며(그림 1B) 모세관에서 수집 버퍼로 수집된 액체를 옮기는 데도 도움이 됩니다.

체액림프를 쉽게 채취하기 위해 이 작업에서는 먼저 SBPH를 얼음이나 냉장고에 냉동했습니다. 그런 다음 이 동결된 SBPH를 실체 현미경으로 슬라이드에 국한시키고 각 SBPH의 다리 중 하나를 끝이 가는 핀셋으로 떼어냈습니다(그림 1C). 큰 상처와 최적의 체액 림프 수집을 보장하려면 뿌리에서 다리를 당기는 것이 가장 좋습니다 (그림 1Ca, b). 지방체에 의한 오염 위험을 최소화하기 위해 흰색 응집이 없는 투명한 액체 방울만 수집했습니다(그림 1Cc). 마이크로피펫은 원하는 부피의 체림프를 흡수하는 데 사용되었습니다(그림 1Cd). 1μL의 체림프를 수집하려면 약 30-40개의 유충 SBPH 또는 8-15개의 성인 SPBH를 해부해야 했습니다.

수집 된 체액 림프 분석
수집된 체액의 부피를 평가하는 방법으로서 마이크로피펫의 정확성을 평가하기 위해, 우리는 상이한 샘플의 단백질 농도를 시험하였다. 모세관 부피가 1μL인 마이크로피펫을 사용하여 유충의 체액림프를 수집하고, 3개의 단백질 샘플을 별도로 수집하여 SDS-PAGE 젤을 실행하여 테스트했습니다. 결과는 3 개의 레인에서 단백질의 양이 거의 동일하다는 것을 보여 주었다 (그림 2A). 유충의 경우 총 단백질 함량은 3.707mg/mL± 1.382mg/mL였습니다. 우리는 또한 성인 여성과 남성 SBPH에서 동일한 부피의 체림프를 수집했으며, 이들은 각각 3.515mg/mL ± 1.400mg/mL 및 3.621mg/mL ± 0.860mg/mL의 단백질 농도를 보여주었습니다(표 1). 3개의 샘플 사이에서 단백질에 유의한 차이는 없었다(도 2B).

또한, 채취한 유충 체림프 내부의 혈구를 관찰하여 체액 샘플의 품질과 순도를 평가하였다. 혈구는 2-20 nm 사이에서 크기가 다양했으며 지방체는 검출되지 않았습니다 (그림 2C). 확인된 세포의 대부분은 직경이 5-15nm인 형질세포였으며 종종 응집체25에서 나타났다. 이어서, 유충, 성체 암컷 및 성체 수컷으로부터 체액림프의 세포 농도를 계수하였고, 확인된 세포 농도는 각각 0.614 x 10 5/μL± 1.256 x 10 5/μL, 0.603 x 10 5/μL, 및 1.553 x 10 5/μL ±± 0.474 x 10 5/μL이었다(표 2). 유충, 성체 암컷 및 성체 수컷의 혈구 세포 수는 유의한 차이를 나타내지 않았다(도 2D). 이러한 결과는 마이크로피펫 수집 방법이 SBPH에서 체림프를 수집하는 신뢰할 수 있고 정확한 방법임을 나타냅니다.

그림 1: 마이크로피펫 모델 및 체림프 수집의 개략도. (A) 마이크로피펫 조성물. 마이크로피펫은 모세관과 피펫 전구로 구성됩니다. 모세관 부피 범위는 1-20 μL입니다. 피펫 전구는 상단과 하단에 작은 구멍이 있습니다. 모세관이 바닥 구멍에 삽입되고 눈금이 보입니다. (B) 마이크로피펫을 사용한 혈림프 수집의 개요 다이어그램. 다리가 분리된 상태에서 곤충 복부가 위를 향하도록 유지하고, 혈림프 유출을 유도하고, 체림프를 입체현미경으로 피펫에 채취합니다. (C) 마이크로피펫을 이용한 혈림프 수집 과정. 끝이 가는 핀셋으로 다리 중 하나를 뿌리에서 잡아당기고(a), 곤충의 몸을 눌러 체액이 흘러나오게 합니다(b,c). 상처의 체액은 모세혈관(d)으로 수집됩니다. 스케일 바 = 500 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: SBPH 혈림프 분석. (A) 수집된 유충 혈림프의 3회 복제를 보여주는 Coomassie Blue 염색. 헴은 체액 림프를 나타냅니다. (B) 유충, 암컷 및 수컷 SBPH의 혈림프의 총 단백질 농도. (C) 각각 20x 및 60x 배율에서 SBPH의 혈림프에 존재하는 세포를 보여주는 현미경 이미지. 핵은 DAPI(청색)로 염색하였다. 스케일 바 = 50μm. (D) 유충, 암컷 및 수컷 SBPH의 혈구 밀도. 평균 및 SD는 3개의 독립적인 실험으로부터 계산하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 다양한 SBPH에서 추출한 혈림프의 단백질 농도. 데이터는 3개의 생물학적 복제물에서 얻었습니다.

표 2: 상이한 SBPH의 혈림프 내 혈구의 총 농도. 데이터는 3개의 생물학적 복제물에서 얻었습니다.

보충 그림 1: 셀 수 결정. 네 모서리 사각형(1, 2, 3, 4)과 중앙 사각형(5)은 셀 계수 챔버에서 계산됩니다. 테두리 셀의 경우 두 경계(위쪽 및 왼쪽)만 계산됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.