우리는 후속 분석을 위해 작은 절지동물에서 정량화 가능한 혈림프를 효율적으로 수집하는 방법을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
절지동물은 바이러스 전파에 필수적인 혈림프를 통해 의료 및 농업적으로 중요한 다양한 바이러스를 전염시키는 것으로 알려져 있습니다. 체액 채취는 바이러스-벡터 상호작용을 연구하기 위한 기본 기술입니다. 여기에서는 이 절지동물이 벼 줄무늬 바이러스(RSV)의 주요 매개체이기 때문에 연구 모델로 Laodelphax striatellus (작은 갈색 식물 호퍼, SBPH)를 사용하여 작은 절지동물에서 체림프를 정량적으로 수집하는 새롭고 간단한 방법을 설명합니다. 이 프로토콜에서 과정은 끝이 가는 핀셋으로 얼어붙은 절지동물의 한쪽 다리를 부드럽게 꼬집고 상처에서 혈림프를 밀어내는 것으로 시작됩니다. 그런 다음 모세관과 피펫 전구로 구성된 간단한 마이크로 피펫을 사용하여 모세관 힘의 원리에 따라 상처에서 수혈 성 혈림프를 수집합니다. 마지막으로, 수집된 체액은 추가 연구를 위해 특정 완충액에 용해될 수 있습니다. 작은 절지동물에서 체림프를 수집하는 이 새로운 방법은 아르보 바이러스 및 벡터-바이러스 상호 작용에 대한 추가 연구를 위한 유용하고 효율적인 도구입니다.
서론
동물과 식물 바이러스는 모두 절지 동물에 의해 전염 될 수 있으며,이 바이러스는 인체 건강에 심각한 위협이되며 농업에서 엄청난 경제적 손실을 초래합니다 1,2,3. 중요한 것은 절지동물의 순환계이자 면역계의 중요한 요소 역할을 하는 절지동물 혈림프가 아르보바이러스 전파를 조절하는 데 중요한 역할을 한다는 것입니다. 절지동물의 내장을 통해 획득된 바이러스는 불리한 혈림프 환경을 성공적으로 탈출한 후에만 다른 조직으로 운반된다 4,5,6,7. 절지 동물 혈림프에서 바이러스의 수명주기는 유체 혈장에서의 바이러스 생존, 혈구로의 진입 및 다른 조직으로의 수송을 포함하며, 다양한 바이러스 - 벡터 상호 작용 메커니즘이 혈림프에서 발생합니다 8,9,10,11,12.
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프로토콜
1. 곤충 사육
- 이 실험에 사용된 SBPH를 벼 묘목(Oryza sativa cv. Nipponbare)에서 올립니다. 인큐베이터(65mm x 200mm)에 벼 묘목 20그루를 심고 25°C에서 16시간 광도/8시간 어두운 광주기에서 자랍니다.
2. 체액 채취를 위한 SBPH의 해부
- SBPH를 원심분리기 튜브에 넣고 얼음 욕조에 10-30분 동안 담가둡니다.
알림: SBPH를 얼음 욕조에 10분 미만 두지 마십시오. - 냉동된 SBPH를 복부가 위를 향하도록 하여 실체현미경(재료 표 참조)으로 유리 슬라이드(재료 표 참조)에 놓습니다. 곤충의 여섯 다리에 초점을 맞추십시오.
- 초미세 팁이 있는 두 개의 고정밀 핀셋( 재료 표 참조)을 준비합니다. 한 핀셋을 사용하여 곤충의 몸을 눌러 제자리에 고정하고 다른 핀셋을 사용하여 곤충의 다리 중 하나를 조심스럽게 잡아당깁니다.
알림: 단단한 껍질을 가진 곤충의 경우 안과용 메스를 사용하여 다리 중 하나를 잘라낼 수 있습니다. - 핀셋으....
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결과
마이크로피펫 모델 및 체림프 수집
우리는 모세관의 모세관력에 기초하여 작용하는 간단한 마이크로 피펫을 개발했습니다. 마이크로피펫은 모세관과 피펫 전구로 구성됩니다(그림 1A). 모세관은 1 μL에서 20 μL까지 다양한 부피 크기로 제공되며 모세관 부피는 요구 사항에 따라 선택됩니다. 부피가 작은 모세관은 부피가 작은 튜브의 매우 미세한 구멍으로 인해 체액과 같은 액체를 흡수하기 어려울 수 있으므로 권장되지 않습니다. 피펫 전구의 상단에는 체액 채취 중에 막을 수 없는 구멍이 있습니다. 이 피펫 전구는 액체 수집 중에 마이크로피펫을 고정하는 데 편리하며(그림 1B) 모세관에서 수집 버퍼로 수집된 액체를 옮기는 데도 도움이 됩니다.
체액림프를 쉽게 채취하기 위해 이 작업에서는 먼저 SBPH를 얼음이나 냉장고에 냉동했습니다. 그런 다음 이 동.......
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토론
혈림프는 절지동물의 순환계의 매개체이며, 아르보 바이러스는 적대적인 혈림프 환경에서 생존할 수 있는 경우에만 다른 절지동물 조직을 침범할 수 있습니다. 고품질 혈림프 샘플을 수집하는 것은 혈림프에서 발생하는 벡터-바이러스 상호 작용을 연구하는 첫 번째 단계입니다. 곤충 체액은 앞다리의 상처, 머리 부위의 경미한 절개 또는 복부의 찢어진 상처를 포함하여 곤충의 몸의 여러 부위에서 얻을 수 있다고보고되었습니다26,27,28,29. 특정 인수에 대해 다른 수집 방법이 작동할 수 있습니다. 두경부 관절에 작은 절개를 만드는 방법은 꿀벌과 같은 큰 곤충의 체액 림프 수집에 더 적합하다26. SBPH의 머리 부분에 상처를 만드는 것은 다른 장기를 손상시키고 다른 조직의 .......
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공개 사항
저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.
감사의 글
이 연구는 중국 국가 핵심 R&D 프로그램(No. 2022YFD1401700)과 중국 국가과학재단(No. 32090013 및 No. 32072385)의 지원을 받았습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 10% SDS-PAGE 단백질 젤 | Bio-rad | 4561035 | 단백질 분리 및 검출 |
| 4% 파라포름알데히드 | Solarbio | P1110 | 세포 또는 조직의 고정을 위해 |
| Bradford 염료 시약 | Bio-rad | 5000205 | 단백질 농도 검출 |
| Capillary | Hirschmann | 9000101 혈림프 수집 | |
| 용 세포 계수 챔버 | ACMEC | AYA0810 | 혈구 계수 |
| Glass slide | Gitoglas | 10127105A | 곤충 포착 용 |
| 실란으로 코팅 된 유리 슬라이드 | Sigma | S4651-72EA | 현미경 시료 보관용 |
| Invitrogen | P36935 | 핵 염색 | 이 포함된 금 퇴색 방지 시약 |
| 현미경 커버 유리 | Gitoglas | 10212424C | 현미경 관찰 |
| 피펫 전구 | Hirschmann | 9000101 | 혈림프 수집용 |
| Prism 8.0 소프트웨어 | GraphPad 소프트웨어 | / | 통계 분석 |
| 실체현미경 | Motic | SMZ-168 | 곤충 해부 |
| 핀셋 | Tianld | P5622 | 곤충 해부 |
| Zeiss 도립 현미경 | Zeiss | Observer Z1 | 혈구 관찰 |
참고문헌
- Hogenhout, S. A., Ammar el, D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. Insect vector interactions with persistently transmitted viruses. Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).
- Ray, S., Casteel, C. L. Effector-mediated plant-virus-vector interactions. Plant Cell. ....
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재인쇄 및 허가
