호중구 세포외 트랩(NET)은 다양한 질병과 관련이 있으며, 면역형광은 종종 시각화에 사용됩니다. 그러나 다양한 염색 프로토콜이 있으며 많은 경우 한 가지 유형의 조직만 검사합니다. 여기서는 생쥐 및 인체 조직에서 NET을 염색하는 데 일반적으로 적용 가능한 프로토콜을 설정합니다.
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정오 공지
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요약
초록
호중구 세포외 트랩(NET)은 박테리아 감염이나 외상성 조직 손상에 대한 반응으로 호중구에 의해 방출되지만 자가면역 질환 및 멸균 염증에도 중요한 역할을 합니다. 그들은 이중 가닥 DNA 필라멘트, 히스톤 및 항균 단백질로 구성된 거미줄 모양의 구조입니다. 일단 방출되면 NET은 혈액과 조직에서 세포 외 병원체를 포획하여 죽일 수 있습니다. 또한 NET은 혈소판 부착 및 응고를 자극하여 항상성 조절에 참여합니다. 그러나 NET의 생산 조절 장애는 패혈증 또는 자가면역 질환을 포함한 다양한 질병과도 관련이 있어 치료 개입의 유망한 표적이 됩니다. 전자 현미경 외에도 면역 형광 이미징을 사용하여 NET을 시각화하는 것은 현재 조직에서 NET 상호 작용을 입증하는 유일한 알려진 방법 중 하나입니다. 따라서 NET을 시각화하기 위한 다양한 염색 방법이 활용되었습니다. 문헌에는 다양한 염색 프로토콜이 설명되어 있으며, 프로토콜 간에 높은 변동성을 보이는 네 가지 주요 구성 요소, 즉 (1) 사용된 항체 유형, (2) 자가형광 환원제의 사용, (3) 항원 회수 방법, (4) 투과성을 확인했습니다. 따라서 체외 면역형광 염색 프로토콜은 이 연구에서 다양한 종(마우스, 인간) 및 조직(피부, 장, 폐, 간, 심장, 척추 디스크)에 적용할 수 있도록 체계적으로 조정되고 개선되었습니다. 고정 및 파라핀 포매 후, 3μm 두께의 섹션을 슬라이드에 장착했습니다. 이 샘플은 수정된 염색 프로토콜에 따라 골수과산화효소(MPO), 시트룰린 히스톤 H3(H3cit) 및 호중구 엘라스타제(NE)에 대한 1차 항체로 염색되었습니다. 슬라이드를 2차 항체로 염색하고 광시야 형광 현미경을 사용하여 검사했습니다. 평가 시트에 따라 결과를 분석하고, 반정량적으로 차이를 기록했다.
여기에서는 다양한 조직에 적합한 최적화된 NET 염색 프로토콜을 제시합니다. H3cit 염색을 위해 새로운 1차 항체를 사용하고 자가형광 환원제로 비특이적 염색을 줄였습니다. 또한, NET 염색에는 일정한 고온과 신중한 시료 취급이 필요하다는 것을 입증했습니다.
서론
호중구 세포외 트랩(NETs)은 2004년 Brinkmann et al.에 의해 세포사멸 및 괴사와 다른 세포 사멸 경로로 처음 시각화되었습니다1. 이 경로에서 호중구는 탈응축된 염색질을 세포 외 공간으로 방출하여 이전에 과립이나 세포질에 저장되었던 항균 단백질로 덮인 큰 거미줄 모양의 구조를 형성합니다. 이러한 항균 단백질에는 호중구 엘라스타제(ne), 골수화효소(MPO) 및 시트룰린 히스톤 H3(H3cit)가 포함되며, 이는 NET의 간접 면역형광 검출에 일반적으로 사용됩니다2. 이 방법은 이러한 단백질의 정량적 존재를 식별할 뿐만 아니라; 실제로 NET과 유사한 구조를 구체적으로 감지할 수 있다는 장점이 있습니다. NET에서 언급된 단백질은 세포외 DNA와 함께 국소화되며, 이는 각 염색된 단백질과 세포외 DNA의 형광 신호의 중첩에 의해 검출될 수 있습니다. NET에서 세포외 DNA와 단백질의 공동 국소화로 인한 중첩 신호와 대조적으로, 온전한 호중구는 공동 국소화를 나타내지 않습니다. 여기서, NET 성분은 일반적으로 과립, 핵 및 세포질3에 별도로 저장된다.
첫 번째 발견 이후 NET은 수많은 질병, 특히....
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프로토콜
이 연구에는 독일 함부르크의 Behörde für Justiz und Verbraucherschutz에 있는 함부르크 주 동물 연구국(Hamburg State Administration for Animal Research, Behörde für Justiz und Verbraucherschutz)에서 승인한 실험에서 파생된 마우스 조직이 포함되었습니다(73/17, 100/17, 94/16, 109/2018, 63/16). 사용된 조직은 패혈증 모델의 쥐 폐와 결장과 화상을 입은 피부였습니다. 우리는 8주 된 수컷과 암컷 쥐를 사용했습니다. 과학적 목적으로 사용되는 동물 보호에 관한 유럽 지침 2010/63/EU는 모든 실험에 대해 준수되었습니다. 익명화된 인간 샘플에는 신생아 장염, 화상을 입은 피부, 담도 폐쇄증, 척추 디스크염 및 심근의 조직이 포함되었습니다. 함부르크 의학 연구 윤리 위원회(Medical Research Ethics Committee of Hamburg)에 따르면, 샘플은 정보에 입각한 동의가 필요하지 않았지만, 연구는 위원회의 승인을 받았다(WF-026/21).
1. 샘플 고정
- Abu Abed 및 Brinkmann에서 파생된 다음 프로토콜을 샘플 고정, 탈수, 파라핀 임베....
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결과
프로토콜 최적화를 시작하기 전에 PubMed에서 NET의 면역 염색을 위해 FFPE 조직을 사용한 연구를 검색하고 프로토콜을 비교하여 성공적인 염색을 위한 주요 단계를 식별했습니다. 가장 유망한 프로토콜 차이는 프로토콜 최적화를 위한 핵심 단계로 확인되었으며, 대부분 서로 일치하는 단계는 변경되지 않았습니다(표 1).
표 1: NET의 FFPE 면역염색을 위한 PubMed 연구. 이 표는 조사된 연구에서 면역염색 프로토콜의 변수를 보여줍니다. 사용된 프로토콜은 필수 단계로 나눈 다음 서로 비교했습니다. 그런 다음 가장 유망한 차이점이 있는 단계를 최적화를 위한 핵심 단계로 취하고 프로토콜에 맞게 조정했습니다. 1차 항체의 배양 시간(야간, 4°C)과 같이 대부분 서로 일치하는 단계는 변경되지 않았습니다.
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토론
이 연구에서 우리는 실제 염색 과정부터 시작하여 NET을 이미징하기 위한 기존 프로토콜을 더 많은 조직 유형에 적용하고 최적화하는 것을 목표로 했습니다. 이 방법의 첫 번째 중요한 단계는 가장 적합한 항체를 선택하는 것입니다. NE의 경우, 인간 조직에 대한 쥐 숙주의 NE 항체를 시험해 보았는데, 토끼 숙주의 NE에 비해 신뢰할 수 있는 염색이 없었습니다. 또한, Thålin et al.은 H3cit(R8)를 세포외 염색을 위한 보다 특이적인 항체로 제안했습니다. 이 항체를 널리 사용되는 triH3cit(R2, R8, R17)와 비교했습니다. 우리의 연구는 H3cit(R8) 항체가 사용된 농도에서 세포외 신호에 대해서만 염색되어 슬라이드에서 NET을 더 쉽게 인식할 수 있음을 보여주었습니다. 이 발견은 H3cit (R8) 클론이 비 시트룰린 히스톤에 대한 오프 타겟 교차 반응성이 감소된 양호한 NET 신호를 제공할 수 있다는 Thålin et al.의 주장을 뒷받침한다28. 또한 MP.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 독일 연구 협회 (BO5534)에 의해 설립되었습니다. 샘플을 제공해 주신 Antonia Kiwitt, Moritz Lenz, Johanna Hagens, Annika Heuer 박사, PD Ingo Königs 박사에게 감사드립니다. 또한 저자들은 면역형광 현미경 검사를 지원해 준 UKE Microscopy Imaging Facility(핵심 시설, UKE Medical School) 팀에 감사를 표합니다.
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재료
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| SuperFrost Plus 슬라이드 | R. Langenbrinck | 03-0060 | |
| TBS Tris 완충 식염수(x10) | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| 트윈 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
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| 수조 밥솥 | reishunger | RCP-30 | |
| 습식 챔버 | Weckert Labortechnik | 600016 | |
| Zeiss 광시야 현미경 | Zeiss | Axiovert 200M |
참고문헌
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Urban, C. F., et al. Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host ....
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재인쇄 및 허가
정오
Formal Correction: Erratum: Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues
Posted by JoVE Editors on 9/29/2023. Citeable Link.
An erratum was issued for: Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues. The Authors section was updated from:
Lavinia Schöenfeld1
Birgit Appl1
Laia Pagerols-Raluy1
Annika Heuer3
Konrad Reinshagen1
Michael Boettcher1,2
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg
2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg
3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)
to:
Lavinia Schoenfeld1
Birgit Appl1
Laia Pagerols-Raluy1
Annika Heuer3
Konrad Reinshagen1
Michael Boettcher1,2
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg
2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg
3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)
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