Method Article

췌장암 세포의 미토콘드리아 미세구조적 변화를 시각화하기 위한 3차원 기법

DOI:

10.3791/65290

⸱

June 23rd, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Pharmaceutical Science of Zhejiang Chinese Medical University, 2Department of Pharmacy, Zhejiang Provincial Dermatology Hospital, 3Academy of Chinese Medical Sciences of Zhejiang Chinese Medical University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 미토콘드리아 크리스타를 재구성하여 높은 정확도, 고해상도 및 높은 처리량으로 3D 이미징을 달성하는 방법을 설명합니다.

Abstract

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알려지지 않은 정보가 풍부할 뿐만 아니라 3차원(3D) 관점에서 정교한 세포 소기관 미세 구조의 동적 특징을 이해하는 것은 기계론적 연구에 매우 중요합니다. 전자 현미경(EM)은 우수한 이미징 깊이를 제공하고 고해상도 이미지 스택을 재구성하여 나노미터 규모에서도 세포 소기관의 미세 구조적 형태를 조사할 수 있습니다. 따라서 3D 재구성은 비교할 수 없는 장점으로 인해 중요성이 커지고 있습니다. 주사전자현미경(SEM)은 연속적인 슬라이스에서 동일한 관심 영역에서 큰 구조를 3D로 재구성할 수 있는 고처리량 이미지 획득 기술을 제공합니다. 따라서 세포 소기관의 진정한 3D 미세 구조를 복원하기 위해 대규모 3D 재구성에 SEM을 적용하는 것이 점점 보편화되고 있습니다. 이 프로토콜에서는 췌장암 세포에서 미토콘드리아 크리스타를 연구하기 위해 직렬 초박형 절편과 3D 재구성 기술의 조합을 제안합니다. 이러한 기술이 수행되는 방법에 대한 세부 사항은 오스뮴-티오카르보하이드라지드-오스뮴(OTO) 방법, 직렬 초박형 단면 이미징 및 시각화 디스플레이를 포함하여 단계별로 이 프로토콜에 설명되어 있습니다.

Introduction

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미토콘드리아는 세포에서 가장 중요한 세포 기관 중 하나입니다. 이들은 세포 생물 에너지와 신진대사의 중심 허브 역할을 하며1,2 암에 중요한 역할을 한다3. 췌장암(Pancreatic cancer, PC)은 급격한 확산과 높은 사망률로 인해 치료하기 가장 어려운 암 중 하나이다.4 미토콘드리아 기능 장애는 주로 미토콘드리아 형태 3,5,6,7의 변화에 의해 발생하며, PC 8의 기저에 있는 질병 기전과 관련이 있다. 미토콘드리아는 또한 매우 동적이며, 이는 네트워크 연결성과 크리스타 구조의 빈번하고 역동적인 변화에 의해 반영된다9. 크리스타 구조의 재형성은 미토콘드리아 기능 및 세포 상태에 직접적인 영향을 미칠 수 있다 10,11, 이는 종양 세포 성장, 전이 및 종양 미세환경 변화

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Protocol

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1. 재료 준비

  1. 12mL의 DMEM 배지(10% 소 태아 혈청 및 100U/mL 페니실린-스트렙토마이신)에서 2 x 106 Panc02 세포를 배양하고 48시간 동안 5% 이산화탄소 및 95% 공기의 분위기에서 37°C 및 95% 습도를 유지합니다.
  2. Panc02 세포를 수집하고 28 x g 에서 2분 동안 원심분리한 다음 상층액을 버립니다. 샘플의 크기가 적절한지 확인하십시오(1 x 107 셀), 그렇지 않으면 다음 고정 및 탈수 단계가 제대로 작동하지 않습니다.
  3. 2.5% 글루타르알데히드 1mL를 고정액으로 첨가하여 신선한 Panc02 세포를 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 4°C에서 밤새 고정합니다.
    알림: 샘플은 다음 단계(1,006-5단계)에서 1.3분 동안 1.11 x g 로 원심분리해야 합니다.
  4. 고정액을 흡인하고, 시료를 0.1 M 인산염 완충 식염수(PBS)로 2회 헹구고, 실온에서 각각 10분 동안 이중 증류수(ddH2O)로 2회 헹구었다.
  5. 1% 사산화오스뮴(OsO4)과 1.5% 페로시안화 칼륨을 포함하는 용액 50μL를 4°C에서 1:1의 비....

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Results

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세포 배양 중(그림 1A), 먼저 췌장암 세포를 완전 배양 배지로 배양한 대조군, (1S,3R)-RSL348(RSL3, 페롭토시스 활성제, 100nM) 그룹 및 RSL3(100nM)와 페로스타틴-149(Fer-1, 페롭토시스 억제제, 100nM) 그룹으로 나누었습니다. 상기의 실험 단계를 통해, 주사전자현미경은 대조군, RSL3군, 억제제군(RSL3+Fer-1기)에 대한 38(보충도 1), 43(보충도 2) 및 44(보충도 3)의 순차적 이미지를 획득하였다. 1,280 x 960 픽셀의 이미지는 8,000배 배율(해상도 12.40nm/픽셀)로 캡처되었습니다. 세포 영역의 주름과 오염은 모두 섹션 위에서 관찰되지 않았습니다. 전자 현미경 사진은 세포에서 미토콘드리아와 소포체.......

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Discussion

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여기에 제시된 방법은 직렬 초박형 섹션에서 생성된 2D 단층 촬영 이미지의 적층 및 분할에 전자 현미경 및 이미지 처리 기술을 적용하는 것과 관련된 3D 재구성 기술을 적용하기 위한 유용한 단계별 가이드입니다. 이 프로토콜은 세포 소기관 미세 구조의 3D 시각화로 해결할 수 있는 2D 이미지의 한계를 강조하며, 이는 고해상도 수준에서 구조의 강력한 재현성과 더 높은 정확도의 장점이 있습니다. 더 중요한 것은 이 3D 시각화를 종양 세포에 적용하여 병리학적 메커니즘에 대한 연구를 보다 간단하고 신뢰할 수 있게 만들 수 있다는 것입니다. 이 기술은 서로 다른 조건에서 3세트의 직렬 섹션을 비교하여 미토콘드리아 크리스타의 입체 구조를 시각화하기 위해 이 작업에서 조사되었으며, 이에 따라 암세포에서 발생하는 RSL3 유도 미토콘드리아 크리스타 막 분해를 검증했습니다(56). 이러한 결과는 항췌장암 치료제로서 RSL3의 작용 기전에 대한 통찰력을 제공합니다.

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Disclosures

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저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

Acknowledgements

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이 연구는 절강성 자연과학재단(Natural Science Foundation of Zhejiang Province) 보조금(Z23H290001, LY19H280001)의 지원을 받았습니다. 중국 국립 자연 과학 재단 보조금 (82274364, 81673607 및 81774011); Huzhou 과학 기술 보조금의 공공 복지 연구 프로젝트(2021GY49, 2018GZ24). 절강 중국 의과 대학 중국 의학 아카데미 의학 연구 센터 공공 플랫폼의 큰 도움, 기술 지원 및 실험 지원에 감사드립니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
(1S,3R)-RSL3MCEHY-100218A
아세톤SIGMA179124
AmiraVisage Imaging2020.2
아스파르트산MCEHY-42068
Dulbecco의 변형된 독수리' s 매체Gibco11995115
에탄올Merck100983
Ferrostatin-1MCEHY-100579
소 태아 혈청Gibco10437010
전계 방출 주사 전자 현미경HITACHISU8010
글루타르알데히드Alfa AesarA10500.22
리드 질산염 SANTA CRUZsc-211724
오스뮴 테트록사이드SANTA CRUZsc-206008B
Panc02유럽 인증 세포 배양 컬렉션 
페니실린-스트렙토마이신BiosharpBL505A
인산염 완충 식염수BiosharpBL302A
Pon 812 에폭시 수지SPI CHEMGS02660
페로시안화 칼맥클린P816416
티오카르보하이드라지드Merck223220
초박 절기라이카EMUC7
우라닐 아세테이트RHAWNR032929
98102213륨

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gonidi, M., et al. Mitochondrial UCP4 and bcl-2 expression in imprints of breast carcinomas: Relationship with DNA ploidy and classical prognostic factors. Pathology, Research and Practice. 207 (6), 377-382 (2011).
  2. Youle, R. J., vander Bliek, A. M.

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Mitochondrial UltrastructurePancreatic Cancer CellsThree Dimensional ReconstructionScanning Electron MicroscopySerial Ultrathin SectionMitochondrial CristaeElectron MicroscopyOrganelle MorphologyOTO MethodMitochondrial Dysfunction

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