방법 논문

HeLa 세포에서 라이브 이미징을 사용한 미토콘드리아 막 전위 및 슈퍼옥사이드 수준의 형광 기반 정량화

DOI:

10.3791/65304

⸱

2023년 5월 12일

 , 
1Department of Cell Biology, Duke University Medical Center

이 논문에서

요약

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이 기술은 형광 기반 라이브 이미징을 사용하여 HeLa 세포 내의 미토콘드리아 막 전위와 과산화물 수준을 시각화하고 정량적으로 측정하는 효과적인 워크플로우를 설명합니다.

초록

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미토콘드리아는 ATP 합성을 통해 에너지 생산을 조절하여 대사 항상성에 중요한 동적 세포 기관입니다. 세포 대사를 지원하기 위해 다양한 미토콘드리아 품질 관리 메커니즘이 협력하여 건강한 미토콘드리아 네트워크를 유지합니다. 그러한 경로 중 하나는 손상된 미토콘드리아의 PTEN 유도 키나아제 1(PINK1) 및 파킨 포스포-유비퀴틴화가 리소좀 융합을 통해 세포에서 자가포식소 격리 및 후속 제거를 촉진하는 미토파지입니다. 유사분열은 세포 항상성에 중요하며 파킨의 돌연변이는 파킨슨병(PD)과 관련이 있습니다. 이러한 발견으로 인해 미토콘드리아 품질 관리의 분자 메커니즘과 역학을 이해하기 위해 미토콘드리아 손상 및 회전율을 조사하는 데 상당한 중점을 두었습니다. 여기에서 라이브 셀 이미징을 사용하여 HeLa 세포의 미토콘드리아 네트워크를 시각화하고 미토콘드리아 분리제인 카르보닐 시안화물 m-클로로페닐 히드라존(CCCP)으로 처리한 후 미토콘드리아 막 전위 및 슈퍼옥사이드 수준을 정량화했습니다. 또한, 파킨 의존성 미토파지를 억제하는 파킨의 PD 연관 돌연변이(ParkinT240R)를 발현하여 돌연변이 발현이 야생형 파킨을 발현하는 세포와 비교하여 미토콘드리아 네트워크에 어떤 영향을 미치는지 확인했습니다. 여기에 요약된 프로토콜은 미토콘드리아 막 전위와 과산화물 수준을 효과적으로 정량화하기 위해 형광 기반 접근 방식을 사용하는 간단한 워크플로를 설명합니다.

서론

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미토콘드리아 네트워크는 에너지 생산1, 선천면역2,3, 세포신호전달4,5에 중요한 역할을 하는 일련의 상호 연결된 세포기관이다. 미토콘드리아 조절 장애는 파킨슨병(PD)과 같은 신경퇴행성 질환과 관련이 있습니다6,7. PD는 전 세계적으로 거의 1,000만 명에게 영향을 미치는 흑질의 도파민성 뉴런에 영향을 미치는 진행성 신경퇴행성 장애입니다8. PD는 손상된 미토콘드리아를 선택적으로 제거하는 세포 항상성을 유지하는 데 필요한 미토콘드리아 품질 관리 경로인 미토파지와 유전적으로 연결되어 있습니다 9,10. 연구에 따르면 FUN14 도메인 포함 1(FUNDC1) 매개 미토파지, Bcl-2 상호 작용 단백질 3(BNIP3) 촉진 미토파지, NIX 의존성 미토파지 및 잘 특성화된 P....

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프로토콜

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1. 생물학적 시료의 제조

알림: 생물 안전 캐비닛에서 멸균 기술을 사용하여 다음 단계를 수행하십시오. 캐비닛 표면과 모든 재료에 70% 에탄올을 뿌립니다.

  1. HeLa 세포 배양 및 형질주입
    1. 10% 소 태아 혈청과 1% L-글루타민 용액이 보충된 4.5g/L 포도당을 함유하는 Dulbecco's modified eagle medium(DMEM)에서 30,000개의 HeLa 세포를 배양합니다(HeLa media; 표 참조). 2mL의 예열된 HeLa 배지가 들어 있는 35mm 유리 바닥 이미징 접시(T able of Materials 참조)에 세포를 플레이트합니다. HeLa 배양물을 5%CO2 및 37°C에서유지한다 26,27.
    2. 도금 다음 날 광학 현미경을 사용하여 35mm 이미징 접시를 검사하여 셀이 ~50%-60% 합류하는지 확인합니다. 일단 합류하면 빈 노란색 형광 단백질(YFP) 벡터, YFP-ParkinWT 또는 YFP-ParkinT240R

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결과

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이 프로토콜에서는 CCCP 처리 후 미토콘드리아 네트워크의 막 전위와 과산화물 수준을 측정하기 위해 형광 기반 정량화를 사용했습니다(그림 1). 이 워크플로우는 자궁경부암에서 추출한 불멸화 세포주인 HeLa 세포를 사용했습니다. HeLa 세포는 미토콘드리아 생물학을 연구하는 데 일상적으로 사용되며 비교적 평평하여 현미경을 사용하여 미토콘드리아 네트워크를 쉽게 시각화할 수 있습니다. 미토콘드리아 네트워크 건강을 유지하는 데 있어 Parkin의 역할을 조사하기 위해 HeLa 세포를 빈 대조군 벡터인 ParkinWT 또는 ParkinT240R (미토파지를 방해하는 돌연변이)21로 일시적으로 형질감염시켰습니다. HeLa 세포는 35mm 유리 바닥 이미징 접시에 도말하고 ~50%-60% 밀도에 도달하면 형질감염되었습니다(그림 1A). HeLa 세포는 .......

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토론

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여기에 요약된 워크플로우는 형광 기반 이미징을 사용하여 미토콘드리아 막 전위와 슈퍼옥사이드 수준을 강력하고 재현성 있게 정량화하는 데 사용할 수 있습니다(30). 이러한 실험을 설계할 때 고려해야 할 중요한 기술적 제한 사항이 있습니다. HeLa 세포를 빈 YFP 벡터, YFP-ParkinWT, 또는 YFP-ParkinT240R로 형질감염시켰다. 실험 결과가 파킨에 특이적인지 확인하기 위해 빈 YFP 벡터를 대조군으로 사용했습니다. 일시적 형질감염의 경우, DNA 대 형질주입 시약에 대한 1:3의 질량비를 실험적으로 측정하여 가장 높은 형질주입률을 산출하였고, 여기서 2 μg의 플라스미드 DNA를 각각의 구축물28에 사용하였다. 형광 단백질이 선천적 밝기가 다르기 때문에 모든 구축물에 대해 YFP-태그를 일관되게 유지하는 것이 중요했습니다31,32

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공개 사항

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저자는 선언 할 경쟁 이익이 없습니다.

감사의 글

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이 원고에 대한 사려 깊은 피드백을 주신 Evans 연구실 구성원들에게 감사드립니다. 이 작업은 Duke Whitehead Scholars, Duke Science and Technology Scholars 및 Howard Hughes Medical Institute(HHMI) Hanna Gray Fellowship의 지원을 받습니다. 도 1A 는 BioRender.com 를 사용하여 만들어졌다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
<강>화학물질, 펩타이드, 및 재조합 단백질
CCCP (카르보닐 시안화물 m-클로로페닐 히드라존) Sigma-AldrichC2759
DMEM (1x) with 4.5 g/L glucoseGibco11-965-084
DMSO, AnhydrousThermoFisher ScientificD12345
Fetal Bovine SerumHycloneSH3007103
FuGENE 6 (Tranfection Reagent)PromegaE2691
GlutaMAX 100x (L-Glutamine Solution) 기코 35-050-061
Hoescht 33342ThermoFisher Scientific62249
MitoSOX  빨간색 ThermoFisher ScientificM36008
MitoTracker Deep RedThermoFisher ScientificM7514
Opti-MEM (Redued Serum media)ThermoFisher scientific31985070
Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE) ThermoFisher ScientificT669
Experimental models: Organisms/Strains
HeLa-M (Homo sapiens)A. Peden (Cambridge Institute for Medical Research)N/A
Recombinant DNA
EYFP 빈 벡터N/AN/A
YFP-Parkin T240R이 논문의 부위 지시 돌연변이 유발에 의해 생성되었습니다
. PMID:19029340RRID:Addgene_23955
소프트웨어 및 알고리즘
Adobe IllustratorAdobe Inc.https://www.adobe.com/products/illustrator(Schindelin, 2012)
Excel(스프레드시트 소프트웨어)Microsoft Office 
ImageJhttps://imagej.net/software/fiji/
Leica Application Suite (LAS X)Leicahttps://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
Microsoft ExcelMicrosoft Officehttps://www.microsoft.com/excel
Prism9 (통계 분석 소프트웨어)GraphPad 소프트웨어https://www.graphpad.com
Other
35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, UncoatedMatTekP35G-1.5-20-C
케이지 인큐베이터(환경 챔버)Okolabhttps://www.oko-lab.com/cage-incubator
DMiL Inverted Microscope라이카N/A
라이트닝 디콘볼루션 소프트웨어라이카N/A
스텔라리스 8 컨포칼 현미경라이카N/A
은 YFP-Parkin, YFP-Parkin, WT, Addgenehttps://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
  2. West, A. P., Shadel, G. S., Ghosh, S. Mitochondria in innate immune responses. Nature Reviews. Immunology. 11 (....

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Mitochondrial Membrane PotentialSuperoxide LevelsLive Cell ImagingHeLa CellsFluorescence QuantificationMitochondrial NetworkTMRE StainingMitoSOX FluorescenceParkin MutationMitochondrial Quality Control

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