방법 논문

골격근 흥분성을 연구하기 위한 천연 세포의 기능적 부위 지정 형광 측정

DOI:

10.3791/65311

⸱

2023년 6월 2일

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Maryland School of Medicine

이 논문에서

요약

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기능적 부위 지정 형광 측정법은 단백질 도메인 동작을 실시간으로 연구하는 방법입니다. 천연 세포에 적용하기 위해 이 기술을 수정하면 이제 쥐 격리 골격근 섬유의 전압 개폐 Ca2+ 채널에서 단일 전압 센서 동작을 감지하고 추적할 수 있습니다.

초록

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기능적 부위 지정 형광 측정법은 전압 개폐 이온 채널을 포함한 수많은 막 단백질의 구조-기능 관계를 조사하기 위해 선택되는 기술이었습니다. 이 접근법은 주로 이종 발현 시스템에서 멤브레인 전류, 채널 활동의 전기적 발현 및 형광 측정을 동시에 측정하여 로컬 도메인 재배열을 보고하는 데 사용되었습니다. 기능적 부위 지정 형광 측정법은 전기 생리학, 분자 생물학, 화학 및 형광을 형광 및 전기 생리학을 통해 실시간 구조 재배열 및 기능을 연구할 수 있는 광범위한 단일 기술로 결합합니다. 일반적으로 이 접근 방식에는 티올 반응성 형광 염료로 테스트할 수 있는 시스테인을 포함하는 엔지니어링된 전압 개폐 멤브레인 채널이 필요합니다. 최근까지 단백질의 부위 지향 형광 표지에 사용된 티올 반응성 화학은 Xenopus 난모세포 및 세포주에서만 수행되어 1차 비흥분성 세포에 대한 접근 범위를 제한했습니다. 이 보고서는 근육 섬유의 전기 탈분극이 근육 수축의 활성화와 연결되는 과정인 여기-수축 커플링의 초기 단계를 연구하기 위해 성인 골격근 세포에서 기능적 부위 지시 형광 측정법의 적용 가능성을 설명합니다. 본 프로토콜은 생체 내 전기천공을 사용하여 시스테인 공학 전압 개폐 Ca2+ 채널(CaV1.1)을 설계하고 성인 마우스의 굴근 손가락 브레비스의 근육 섬유로 형질감염시키는 방법론과 기능적 부위 지정 형광 측정 측정에 필요한 후속 단계를 설명합니다. 이 접근법은 다른 이온 채널과 단백질을 연구하는 데 적용할 수 있습니다. 포유류 근육의 기능적 부위 지정 형광 측정법의 사용은 특히 흥분성의 기본 메커니즘을 연구하는 것과 관련이 있습니다.

서론

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살아있는 세포에서 알려진 전기적 자극에 대한 반응으로 이온 채널 구조적 재배열을 추적하는 능력은 분자 생리학에 대한 귀중한 정보의 원천입니다1. 전압 개폐 이온 채널은 막횡단 전압의 변화를 감지하는 막 단백질이며, 그 기능도 전압 변화의 영향을 받습니다2. 지난 세기의 전압 클램프 기술의 발전으로 생리학자들은 막 탈분극에 반응하여 전압 개폐 이온 채널에 의해 전달되는 이온 전류를 실시간으로 연구할 수 있었습니다3. 전압 클램프 기술의 사용은 뉴런 및 근육과 같은 흥분성 세포의 전기적 특성을 이해하는 데 중요했습니다. 1970년대에는 전압 클램프 미세 조정을 통해 전압 개폐 칼슘(CaV) 및 나트륨(NaV) 채널 4,5에서 게이팅 전류(또는 전하 이동)를 감지할 수 있었습니다. 게이팅 전류는 세포막6을 가로지르는 전기장의 변화에 반응하여 전압 센서의 움직임에서 발생하는 비선형 용량성 전류입니다. 게이팅 전류는 이온 채널 개방7 이전 또는 수....

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프로토콜

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이 프로토콜은 메릴랜드 대학교 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다. 다음 프로토콜은 (1) 분자 구조 설계 및 시스테인 반응 염료 선택, (2) 생체 내 전기천공, (3) 근육 해부 및 섬유 분리, (4) 획득 설정 설명, (5) 강화된 녹색 형광 단백질(EGFP) 양성 섬유 전기 활성 및 시스테인 염색 평가, (6) 신호 획득 및 처리. 또한 각 섹션의 시작 부분에는 골격근 섬유에 FSDF를 적용할 때 몇 가지 관련 고려 사항이 자세히 설명되어 있습니다. 모든 프로토콜 섹션은 실험실 코트와 장갑을 포함한 적절한 개인 보호 장비를 사용하여 수행해야 합니다.

1. 분자 구조 설계 및 시스테인 반응 염료 선택

  1. 구조 설계는 실험 성공의 중요한 부분입니다. 먼저, 야생형, 형광 태깅된 CaV1.1 cDNA 구축물을 생성하고, 적절한 세포 유형에서의 그의 발현을 평가한다. 근섬유의 경우, 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터를 운반하는 플라스미드를 사용하여 강력한 형질감염 효율을 달성할 수 있다. 이 프로토콜에서, 이미 특성화된 토끼 EGFP-CaV1.1 플라스미드를 사용하였다(38).

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결과

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반복적인 자기장 자극에 대한 응답으로 전파 활동 전위가 트리거되면 특정 주파수의 탈분극에 대한 응답으로 특정 전압 센서 동작을 추적할 수 있습니다. 도 6A에 도시된 바와 같이, VSD-II-태깅된 나선의 움직임은 10Hz(즉, 100ms만큼 이격된)에서 인가된 2개의 연속적인 탈분극 각각에 응답하여 추적될 수 있다. 신호 표백은 트레이스에서 기준선을 빼서 수정할 수 있습니다(그림 6B). 첫 번째 및 두 번째 반응에 대한 추가 시간 배율(그림 6C)을 통해 빠르게 발전하는 VSD-II 나선 움직임을 정밀하게 관찰할 수 있습니다. 필드 자극 트리거의 시간 마커를 통해 10μs의 정밀도로 첫 번째 및 두 번째 응답의 상대적 시간 정렬이 가능합니다. 두 신호 모두 각각의 최소값(즉, 최소 피크)으로 정규화되어 두 응답 간의 동역학적 비교가 가능합니다(

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토론

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여기서, CaV1.1 채널에서 개별 전압 센서 운동의 연구를 위해 근섬유에서 FSDF를 수행하는 단계별 프로토콜이 설명됩니다. 이 기술에 결합된 단계의 수와 접근 방식의 다양성이 복잡해 보일 수 있지만 이러한 기술의 대부분은 종종 생물 물리학자/세포 생물학자 실험실에서 일상적으로 사용됩니다. 따라서 겉보기 복잡성은 주로 단일 통합 기술에서 모든 다양한 접근 방식의 조합에 있습니다. 종종 다단계 방법을 수행 할 때 처음에 수행 된 작은 수정의 영향은 다음 단계의 뒷부분에서만 감지 할 수 있습니다. 각 단계의 개발의 엄격함과 정확한 포함 및 제외 기준을 통해 동일한 준비 또는 동일한 섬유에서 여러 기록을 얻을 수 있습니다.

여기에 설명된 접근법은 심장 세포 및 뉴런을 포함한 다른 세포 유형에 적용될 수 있습니다. 또한 고속 카메라와 같은 다양한 감지 시스템을 사용할 수 있습니다. 현재, 전압 클램프(패치 클램프 또는 2-전극 전압 클램프)의 사용은 이들 기술(

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공개 사항

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저자는 이해 상충이 없다고 보고합니다.

감사의 글

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EGFP-CaV1.1(토끼) 야생형 플라스미드를 공유해 주신 J. Vergara 박사(University of California, Los Angeles)에게 감사드립니다. 트랙 앤 홀드 회로가 있는 포토다이오드의 설계 및 제작에 대해 Yale Department of Physiology Electronics Laboratory, 특히 Henrik Abildgaard에게 감사드립니다. 이 작업은 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 보조금 R01-AR075726 및 R01-NS103777의 지원을 받았다

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
히알루로니다아제SIGMA, ALDRICHH3884-50mg
0.5mL Eppendorf 튜브Millipore SigmaEP022363719-500EA
1mL 주사기Millipore SigmaZ683531-100EA튜버큘린 슬립 팁
1/2" 길이, 29게이지 멸균 인슐린 바늘 및 주사기,Becton Dikinson324702
35mm 비코팅 플라스틱 플레이트Falcon, Corning353001
60mm 비코팅 플라스틱 플레이트Falcon, Corning351007
알코올 채찍PDIB60307
Alexa-533 cube LPChroma49907Ex: 530/30x; 학사 : 532; Em: 550lp
아크 램프Sutter InstrumetsLB-LS 672
인공 눈물 크림AkornNDC 59399-162-35
붕규산 유리 파스퇴르 피펫 5 3/4"VWR14672-200
BTS (N-benzyl-p-toluene sulphonamide)SIGMA ALDRICH203895
콜라겐 분해효소 I 유형SIGMA ALDRICHC0130-1G
면 팁VWRVWR-76048-960-BG
이중 전극 어레이  (Electroporation를 위해)BTX 하버드 장치45-012010mm 2 바늘 배열 팁
EGFP 큐브Chroma39002AT예: 480/30x; 학사 505; Em: 535/40m
전기천공법 장치 장치BTX 하버드 장치ECM 830
EPC10HEKA Elektronik GmbH  (하버드 바이오사이언스)895000
FBS바이오텍네,  R& D SystemsRND-S11150H태아 소 세럼 - 프리미엄, 열 비활성화
유리 커버슬립 35mm 접시MatTek Life ScienceP35G-1.5-14-C
이소플루란플루리소(이소플루란) 액체 흡입용502017-250ml
등온 가열 패드Braintree scientific inc39DP
라미닌써모 피셔INV-23017015라미닌 마우스 단백질, 천연
라텍스 전구VWR82024-554
LED 530 nm셔터 인스트루메트5A-530
저결합 단백질 0.2 μ m 멸균 필터PallFG4579acrodisk  주사기 필터 0.2um supor membrane 저단백질 결합 비발열성
MEMInvitrogenINV-11380037
MTS-5-TAMRABiotium89410-784MTS-5-TAMRA
OriginPro 분석 소프트웨어OriginLab CorporationOriginPro 2022 (64비트) SR1
포토다이오드맞춤 제작
PlanApo 60x 오일  1.4 N.A/∞/0.17OlympusBFPC2
플래티넘 와이어 0.5 mm, 99.9 % 금속 기반SIGMA267228-1G필드 자극 전극
펄스 발생기WPIPulsemaster A300
셔터 드라이브 컨트롤러Uniblitz100-2B
셔틀 UniblitzVS2582T0-100
S-MEMInvitrogenINV-11380037
멸균 벤치 패드VWRDSI-B1623
멸균 식염수SIGMA ALDRICHS8776
Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 키트Dow Corning1419447-1198
마취용 기화기Parkland ScientificV3000PK
전압 발생기맞춤형NA
, , , , , , , NA

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Catterall, W. A., Wisedchaisri, G., Zheng, N. The chemical basis for electrical signaling. Nature Chemical Biology. 13 (5), 455-463 (2017).
  2. Armstrong, C. M., Hille, B. Voltage-gated ion channels and electrical excitability. Neuron. 20 (3), 371-380 (1998).
  3. Hodgkin, A. L., Huxl....

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