유전자 발현은 유전자 프로모터와 원위 조절 요소의 상호작용에 의해 조절된다. 여기서는 낮은 입력 Capture Hi-C(liCHi-C)를 통해 이전에는 측정할 수 없었던 희귀 세포 유형에서 이러한 상호 작용을 식별할 수 있는 방법을 설명합니다.
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방법 논문
희소한 세포 집단에서 프로모터 중심의 시공간 게놈 구조를 연구하기 위한 통합 워크플로우An Integrated Workflow to Study the promoter-centic spatio-temporal genome architecture in Scarce Cell Populations
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
시공간 유전자 전사는 전사를 제어하기 위해 표적 유전자 프로모터와의 물리적 근접성에 의존하는 인핸서 및 소음기와 같은 원위 조절 요소에 의해 엄격하게 조절됩니다. 이러한 조절 요소는 식별하기 쉽지만 대부분이 세포 유형에 특이적이며 선형 게놈 서열에서 수백 킬로베이스로 분리되어 다른 비표적 유전자를 건너뛰기 때문에 표적 유전자를 예측하기 어렵습니다. 수년 동안 Promoter Capture Hi-C(PCHi-C)는 원위 조절 요소를 표적 유전자에 결합시키는 데 있어 황금 표준이었습니다. 그러나 PCHi-C는 수백만 개의 세포 가용성에 의존하여 일차 조직에서 일반적으로 얻은 것과 같은 희귀 세포 집단에 대한 연구를 금지합니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 게놈의 각 유전자를 제어하는 원위 조절 요소의 레퍼토리를 식별하는 비용 효율적이고 맞춤형 방법인 저입력 Capture Hi-C(liCHi-C)가 개발되었습니다. liCHi-C는 PCHi-C와 유사한 실험 및 계산 프레임워크에 의존하지만 최소한의 튜브 변경을 사용하고 시약 농도 및 부피를 수정하고 단계를 바꾸거나 제거함으로써 라이브러리 구성 중 재료 손실을 최소화합니다. 총체적으로, liCHi-C는 발달 생물학 및 세포 기능의 맥락에서 유전자 조절 및 시공간 게놈 조직의 연구를 가능하게 합니다.
서론
시간적 유전자 발현은 세포 분화와 궁극적으로 유기체 발달을 유도하며, 그 변화는 광범위한 질병 1,2,3,4,5와 밀접한 관련이 있습니다. 유전자 전사는 조절 요소의 작용에 의해 미세하게 조절되며, 이는 근위부(즉, 유전자 프로모터) 및 원위부(예: 인핸서 또는 소음기)로 분류될 수 있으며, 후자는 종종 표적 유전자로부터 멀리 떨어져 있고 유전자 발현을 조절하기 위해 염색질 루핑을 통해 물리적으로 상호작용합니다 6,7,8.
게놈에서 원위 조절 영역의 식별은 널리 합의된 문제인데, 이 영역은 특정 히스톤 변형 9,10,11을 포함하고 특정 전사 인자 인식 모티프를 포함하여 이들에 대한 모집 플랫폼 역할을 하기 때문입니다
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프로토콜
재료 손실을 최소화하기 위해 (1) DNA 저결합 튜브 및 팁으로 작업하고( 재료 표 참조), (2) 샘플 내부에 팁을 삽입하는 대신 튜브 벽에 시약을 배치하고, (3) 가능하면 샘플을 위아래로 피펫팅하는 대신 반전으로 샘플을 혼합하고, 나중에 스핀다운하여 샘플을 회수합니다.
1. 세포 고정
- 현탁액에서 자라는 세포
- 50,000개에서 100만 개의 세포를 채취하여 DNA 저결합 1.5mL 튜브에 넣습니다.
참고: 본 연구에 사용된 세포 유형은 대표 결과 섹션에 자세히 설명되어 있습니다. - 고정각 로터 원심분리기를 사용하여 세포를 600 x g (4°C에서)에서 5분 동안 원심분리하고, 피펫팅에 의해 상청액을 제거하였다.
- 실온에서 10% 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 RPMI 1640 1mL에 세포를 재현탁합니다.
- 143 μL의 메탄올이없는 16 % 포름 알데히드를 첨가하여 2 %의 농도에 도달하고 혼합합니다.
- 세포를 고정하기 위해 실온에서 회전하면서 10분 동안 세포를 배양합니다.
알림: 10분 배양으로 가능한 한 정확하도록 노력하십시오. 세포의 과잉....
- 50,000개에서 100만 개의 세포를 채취하여 DNA 저결합 1.5mL 튜브에 넣습니다.
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결과
liCHi-C는 50,000 개의 세포로 고품질의 게놈 전체 프로모터 상호 작용체 라이브러리를 생성 할 수있는 가능성을 제공합니다53. 이는 반응 부피의 급격한 감소와 프로토콜 전반에 걸쳐 DNA 저결합 플라스틱 용기의 사용 외에도 상당한 재료 손실이 발생하는 원래 프로토콜에서 불필요한 단계를 제거함으로써 달성됩니다. 여기에는 탈가교 후 페놀 정제, 비오틴 제거, 후속 페놀-클로로포름 정제 및 에탄올 침전이 포함됩니다. 그 외에도 Hi-C 라이브러리 준비 단계(비오틴 풀다운, A-테일링, 어댑터 결찰, PCR 증폭 및 양면 상자성 비드 선택 - PCR 산물 정제이기도 함)를 재구성하면 또 다른 불필요한 DNA 정제 단계를 제거할 수 있습니다. 실험 워크플로의 개요는 그림 1A에서 찾을 수 있습니다.
라이브러리 품질을 평가하기 위해 프로토콜 전반에 걸쳐 여러 제어가 수행되며, 그 중 첫.......
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토론
liCHi-C는 PCHi-C와 유사한 실험 프레임워크를 사용하지만 세포 수가 크게 감소한 고분해능 프로모터 상호작용체 라이브러리를 생성할 수 있는 기능을 제공합니다. 이것은 페놀 정제 및 비오틴 제거와 같은 불필요한 단계를 제거함으로써 크게 달성됩니다. 고전적인 핵 내 결찰 Hi-C 프로토콜57 및 후속 파생 기술인 PCHi-C에서, 비오틴은 나중에 정보가 없는 DNA 단편을 끌어내리는 것을 피하기 위해 비결찰 제한 단편에서 제거됩니다. 이 부분과 후속 DNA 정제를 건너뛰어도 DNA 정제와 같은 잠재적인 DNA 소모 단계를 차단하면서 유효한 판독 비율이 크게 감소하지 않습니다(그림 3A). 초음파 처리 후 Hi-C 라이브러리 준비의 재구성은 정제 단계 자체로 양면 선택을 사용하여 또 다른 불필요한 정제를 건너 뛸 수 있습니다. 이 모든 것이 최소한의 튜브 변경을 사용하여 전체 프로토콜의 성능을 향상시키고, 반응 부피의 감소, 시약 .......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
원고에 대한 피드백을 주신 Javierre 연구실의 나머지 구성원들에게 감사드립니다. 제도적 지원을 해주신 CERCA 프로그램, Generalitat de Catalunya 및 Josep Carreras Foundation에 감사드립니다. 이 연구는 FEDER/스페인 과학혁신부(RTI2018-094788-A-I00), 유럽 혈액학 협회(4823998) 및 스페인 암 퇴치 협회(AECC) LABAE21981JAVI의 자금 지원을 받았습니다. BMJ는 La Caixa Banking Foundation Junior Leader 프로젝트(LCF/BQ/PI19/11690001)에서 자금을 지원하고, LR은 AGAUR FI 펠로우십(2019FI-B00017)에서 자금을 지원하며, LT-D는 FPI Fellowship(PRE2019-088005)에서 자금을 지원합니다. Universitat Autònoma de Barcelona의 생화학 및 분자 생물학 박사 과정의 지원에 감사드립니다. 자금 제공자 중 누구도 실험 설계나 원고 작성의 어느 시점에도 관여하지 않았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.4 mM Biotin-14-dATP | Invitrogen | 19524-016 | |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Invitrogen | AM9260G | |
| 1 M Tris pH 8.0 | Invitrogen | AM9855G | |
| 10x NEBuffer 2 | New England Biolabs | B7002S | 원고에서 제한 버퍼 2로 참조 |
| 10x PBS | Fisher Scientific | BP3994 | |
| 10x T4 DNA 리가제 반응 버퍼 | New England Biolabs | B0202S | |
| 16% 포름알데히드 용액(w/v), 메탄올 프리 | Thermo Scientific | 28908 | |
| 20 mg/mL 소 혈청 알부민 | New England Biolabs | B9000S | |
| 5 M NaCl | Invitrogen | AM9760G | |
| 5PRIME Phase Lock Gel Light tubes | Qiuantabio | 2302820 | 섹션 4(DNA 정제)의 페놀-클로로포름 정제용. Phase Lock Gel 튜브는 페놀-클로로포름 정제 후 DNA 회수를 극대화하는 동시에 유기상과 수성 상 사이에 침전되어 분리되는 중간 밀도의 수지를 포함함으로써 유기상에서 오염 물질의 이월을 방지하도록 특별히 설계된 상용 유형의 튜브입니다. PLG 튜브는 레진이 튜브 바닥에 잘 배치되도록 사용하기 전에 12,000 x g에서 30초 동안 회전해야 합니다 |
| 라이브러리 증폭을 위한 어댑터 및 PCR 프라이머 | 통합 DNA 기술 | - | 용 PAGE 정제와 함께 개별 프라이머로 구입 |
| Nunc | 179693 | 또는 기타 브랜드 | |
| 원심분리기(1.5mL 튜브용 고정각 로터) | 모든 브랜드 | ||
| CHiCAGO R 패키지 | 1.14.0 | ||
| CleanNGS beads | CleanNA | CNGS-0050 | |
| dATP, dCTP, dGTP, dTTP | Promega | U120A, U121A, U122A, U123A | 또는 기타 브랜드 |
| DNA LoBind tube, 1.5 mL | Eppendorf | 30108051 | |
| DNA LoBind tube, 2 mL | Eppendorf | 30108078 | |
| DNA polymerase I large (Klenow) fragment 5000 units/mL | New England Biolabs | M0210L | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 beads | Invitrogen | 65002 | for biotin pull-down of the pre-captured library in section 8 (biotin pull-down) |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 beads | Invitrogen | 65602 | 섹션 11의 포획 후 라이브러리의 비오틴 풀다운(비오틴 풀다운 및 PCR 증폭) |
| DynaMag-2 | Invitrogen | 12321D | 또는 1.5ml tubeL |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.321 | |
| , 적격 | Gibco | 10270-106 | 또는 기타 브랜드 |
| Glycine | Fisher BioReagents | BP381-1 | |
| GlycoBlue Coprecipitant | Invitrogen | AM9515 | 섹션 4 (DNA 정제)에서 DNA 공침전에 사용됨 |
| HiCUP | 0.8.2 | ||
| HindIII, 100 U/µ L | New England Biolabs | R0104T | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I8896-50ML | |
| Klenow EXO- 5000 units/mL | New England Biolabs | M0212L | |
| 저보유 필터 팁 ( 10 & 마이크로; L, 20 &마이크로; L, 200 &마이크로; L 및 1000 & 마이크로; L) | ZeroTip | PMT233010, PMT252020, PMT231200, PMT252000 | |
| M220 초점 초음파기 | Covaris | 500295 | |
| Micro TUBE AFA 섬유 프리 슬릿 스냅 캡 6 x 16 mm 바이알 | Covaris | 520045 | 섹션 6의 초음파 처리 < / strong> (초음파 처리) |
| NheI-HF, 100 U/µ L | New England Biolabs | R3131M | |
| 뉴클레아제-프리 분자 생물학 등급 물 | Sigma-Aldrich | W4502 | |
| PCR 프라이머 품질 관리 | 통합 DNA 기술 | - | |
| PCR 스트립 그리고 캡 | Agilent Technologies | 410022, 401425 | |
| Phenol: Chloroform: Isoamyl Alcohol 25:24:1, Saturated with 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA | Sigma-Aldrich | P3803 | |
| Phusion HF 완충액이 있는 High-Fidelity PCR 마스터 믹스 | New England Biolabs | M0531L | 섹션 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification) and 11(비오틴 풀다운 및 PCR 증폭) |
| 프로테아제 억제제 칵테일(EDTA 무함유) | Roche | 11873580001 | |
| Proteinase K, 재조합, PCR grade | Roche | 3115836001 | |
| Qubit 1x dsDNA 고감도 키트 | Invitrogen | Q33230 | 섹션 4 (DNA 정제)에서 침전 후 DNA 정량화용 |
| Qubit assay tubes | Invitrogen | Q32856 | |
| rCutsmart buffer | New England Biolabs | B6004S | |
| RPMI Medium 1640 1x + GlutaMAX | Gibco | 61870-010 | 또는 다른 브랜드 |
| 의 SDS - 분자 생물학을 위한 솔루션 10% | PanReac AppliChem | A0676 | |
| 아세트산 나트륨 pH 5.2 | Sigma-Aldrich | S7899-100ML | |
| SureSelect 맞춤형 3-5.9 Mb 라이브러리 | Agilent Technologies | 5190-4831 | 에 사용되는 맞춤형 설계 마우스 또는 인간 캡처 시스템 |
| Agilent Technologies | 5190-8645 | capture | |
| SureSelect Target Enrichment Kit에 사용됨 ILM PE 전체 어댑터 | Agilent Technologies | 931107 | 캡처 |
| T4 DNA ligase 1 U/µ L | Invitrogen | 15224025 | 섹션 3의 결찰(결찰 및 decrosslink) |
| T4 DNA 리가제 2000000/mL | New England Biolabs | M0202T | 섹션 9의 결찰(dATP-tailing, 어댑터 결찰 및 PCR 증폭) |
| T4 DNA 중합효소 3000 units/mL | New England Biolabs | M0203L | |
| T4 PNK 10000 units/mL | New England Biolabs | M0201L | |
| Tapestation 4200 기기 | Agilent Technologies | 섹션 9(dATP-tailing, adapter ligation 및 PCR 증폭)의 자동 전기영동및 섹션 11(비오틴 풀다운 및 PCR 증폭). 다른 모든 자동 전기영동 시스템은 유효합니다 | |
| Tapestation 시약 | Agilent Technologies | 5067-5582, 5067-5583, 5067-5584, 5067-5585, | for automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and section 11 (Biotin pull-down and PCR amplification). 분자 생물학에 대한 다른 모든 자동 전기 영동 시스템은 유효합니다 |
| Triton X-100 | PanReac AppliChem | A4975 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML |
참고문헌
- Hatton, C. S., et al. α-thalassemia caused by a large (62 kb) deletion upstream of the human α globin gene cluster. Blood. 76 (1), 221-227 (1990).
- Toikkanen, S., Helin, H., Isola, J., Joensuu, H. Pr....
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재인쇄 및 허가
