이 프로토콜은 신경(면역)학 연구를 위해 배아 17일 마우스 뇌에서 중추 신경계 세포 배양을 생성하는 독특한 방법을 제시합니다. 이 모델은 RT-qPCR, 현미경, ELISA 및 유세포 분석을 포함한 다양한 실험 기술을 사용하여 분석할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
중추신경계(CNS)의 모델은 생체 내에서 발견되는 상호 연결된 세포의 복잡한 네트워크를 요약해야 합니다.중추신경계는 주로 뉴런, 성상교세포, 희소돌기아교세포 및 미세아교세포로 구성됩니다. 동물 사용을 대체하고 줄이기 위한 노력이 증가함에 따라 선천성 세포 특성을 탐색하기 위해 다양한 시험관 내 세포 배양 시스템이 개발되어 CNS 감염 및 병리에 대한 치료제를 개발할 수 있습니다. 특정 연구 질문은 (유도된) 만능 줄기 세포와 같은 인간 기반 세포 배양 시스템으로 해결할 수 있지만 인간 세포로 작업하는 것은 가용성, 비용 및 윤리와 관련하여 고유한 한계가 있습니다. 여기에서는 배아 마우스 뇌에서 세포를 분리하고 배양하기 위한 고유한 프로토콜을 설명합니다. 그 결과 혼합 신경 세포 배양은 생체 내 뇌에서 발견되는 여러 세포 집단과 상호 작용을 모방합니다. 현재의 동등한 방법과 비교할 때, 이 프로토콜은 뇌의 특성을 더 밀접하게 모방하고 더 많은 세포를 확보하므로 임신한 마우스 한 마리에서 더 많은 실험 조건을 조사할 수 있습니다. 또한, 프로토콜은 비교적 쉽고 재현성이 높습니다. 이러한 배양은 96웰 기반 고처리량 스크리닝, 24웰 현미경 분석, 유세포 분석 및 역전사 정량 중합효소 연쇄 반응(RT-qPCR) 분석을 위한 6웰 배양을 포함하여 다양한 규모로 사용하도록 최적화되었습니다. 이 배양 방법은 시험관 내 방법의 편리함과 함께 CNS의 일부 복잡성의 맥락에서 감염 및 면역을 조사하는 강력한 도구입니다.
서론
중추신경계(CNS)에 대한 이해를 높이는 것은 많은 신경염증 및 신경퇴행성 질환에 대한 치료 옵션을 개선하는 데 중요합니다. 뇌, 척수, 시신경 내에서 상호 연결된 세포의 복잡한 네트워크인 CNS는 뉴런, 희소돌기아교세포, 성상교세포 및 이들의 선천성 면역 세포인 미세아교세포로 구성됩니다1. 체외 접근법은 종종 의미있는 연구를 수행하는 데 필요한 마우스의 수를 크게 줄일 수 있습니다. 그러나 CNS의 복잡한 특성으로 인해 세포주를 사용하여 생체 내 상황을 요약하는 것은 불가능합니다. 혼합 신경 세포 배양은 3Rs(Replacement, Reduction and Refinement) 원칙 2,3에 따라 관련 모델에서 신경(면역학) 문제를 조사하는 데 매우 유용한 연구 도구를 제공합니다.
Thomson et al.은 앞서 언급한 모든 주요 CNS 세포 유형으로 분화하는 태아기 척수 세포를 이용한 세포 배양 방법을 설명했다4. 이 시스템은 또한 시냅스 형성, 수초 축삭 및 Ranvier의 노드를 가지고 있습니다. 이 배양 방법의....
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프로토콜
모든 동물 실험은 동물 사용에 대한 현지 법률 및 지침을 준수했으며 글래스고 대학의 지역 윤리 검토 위원회의 승인을 받았습니다. 동물은 영국 내무부 프로젝트 라이센스의 후원하에 1986년 영국 동물 과학 절차법에 따라 특정 병원체가 없는 조건에서 사육되었습니다. 이 연구에서는 사내에서 사육된 성인 C57BL/6J 마우스를 사용했습니다. 젊은 여성 (8-12 주)의 사용은 임신 성공률이 높기 때문에 권장됩니다. 수컷은 여러 차례의 번식에 재사용 할 수 있습니다. 그림 1 은 혼합된 뉴런 및 신경교 배양을 생성하는 설명된 방법의 개략도를 나타냅니다.
1. 조직 배양 소모품의 제조
- Class 2 안전 캐비닛 내부에 현미경 커버슬립이 들어 있는 접시 및/또는 접시를 준비합니다. 배양 기간 동안 무균 상태를 보장하기 위해 모든 시약 또는 오토클레이브를 멸균하십시오.
- 적절한 부피의 BA-PLL(붕산 완충액[BA][50mM 붕산, 12.5mM 사붕산나트륨, pH 8.5] 중 13.2μg/mL 폴리-L-라이신하이드로브로마이드[PLL])을 각 웰(6웰 플레이트에서 1,000μL/웰, 96웰 플레이트에서 100μL/웰, 부피는 ....
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결과
현미경 검사 법
유리 커버슬립에서 자란 배양액은 현미경으로 분석하는 데 이상적입니다. 배양의 발달을 시각화하기 위해 커버슬립을 DIV0(세포가 부착된 후)부터 DIV28까지 여러 시점에서 4% 파라포름알데히드(PFA)에 고정했습니다. 배양물은 앞서 설명한5 와 같이 신경교 마커로서 NG2(미성숙 희소돌기아교세포) 및 네스틴(신경줄기/전구 세포), 신경 표지자로서 SMI31(축삭), MBP(미엘린) 및 NeuN(뉴런 세포체) 또는 신경교 마커로서 CNP(희소돌기아교세포), GFAP(성상교세포) 및 Iba1(미세아교세포)의 세 가지 염색 조합을 사용하여 면역형광 이미징을 위해 염색되었습니다(그림 2).
다양한 세포 유형은 CellProfiler 파이프라인('6-diamidino-2-phenylindole-positive(https://github.com.......
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토론
중추신경계는 뇌에서 척수까지 이어지는 복잡한 네트워크로, 주로 뉴런, 희소돌기아교세포, 성상교세포, 미세아교세포 등 다양한 세포 유형으로 구성되어 있다1. 각 세포는 항상성을 유지하고 CNS 9,10,11의 문제에 대한 적절한 반응을 생성하는 데 중요한 역할을 하기 때문에 이러한 모든 세포 유형을 포함하는 배양 시스템은 뇌가 자극에 어떻게 반응하는지 조사하는 데 유용하고 다재다능한 도구입니다. 시험관 내 맥락에서 이러한 세포와 그 상호 작용을 연구할 수 있다는 것은 다양한 실험 문제를 쉽게 조사하기 위해 매우 다양한 기술을 사용할 수 있음을 의미합니다. 우리는 태아기 뇌에서 주요 CNS 세포 유형을 얻고 배양하는 빠르고 효율적인 방법을 설명했으며, 이는 성인 마우스 뇌에서 개별 세포 집단을 모방할 수 있습.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
Edgar 및 Linington 연구소 구성원, 특히 Chris Linington 교수, Diana Arseni 박사 및 Katja Muecklisch 박사에게 이러한 문화를 설정하는 동안 문화에 대한 조언, 유용한 의견 및 지원에 감사드립니다. Cell Profiler 파이프라인의 시작점을 제공한 Dr Muecklisch에게 특별한 감사를 전합니다. 이 작업은 MS Society (보조금 122)와 Yuri and Lorna Chernajovsky 재단의 지원을 받았습니다. JC 및 MP에 대한 글래스고 대학교 자금 지원; 및 Wellcome Trust(217093/Z/19/Z) 및 Medical Research Council(MRV0109721)을 GJG에 제공합니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 10x Trypsin | Sigma | T4549-100ML | 조직을 소화하려면 |
| 140mm TC 접시 | Fisher | 11339283 | 1 140mm 접시 당 8 개의 35mm 접시를 넣으십시오 |
| 15 mL Falcon | Sarstedt | 62554502 | 도금 매체에서 재현탁액을 위해 세포를 펠렛으로 수집하려면 |
| 18 G 바늘 | Henke Sass Wolf | 4710012040 | 샘플 |
| 21 G 바늘 | BD의 분쇄 용 | 304432 | 시료 분쇄용 |
| 23G 바늘 | Henke Sass Wolf | 4710006030 | 시료 분쇄용 |
| 35mm TC 접시 | Corning | 430165 | 플레이트 아웃 1 35mm 접시당 3개의 PLL 코팅 커버슬립 |
| 5mL 주사기 Fisher | 15869152 | 시료 분쇄용 | |
| 6웰 플레이트 | Corning | 3516 | RT-qPCR용 세포 플레이트를 플레이트아웃하고 유동 cytometry |
| 7 mL Bijoux | Fisher | DIS080010R | To put brains intp |
| 96 well plate | Corning | 3596 | To plate-out cells for high-throughput testing |
| ACSA-2 Antibody, anti-mouse, PE | Miltenyi | 130-123-284 | 성상세포의 유세포 분석 염색용 |
| Angled ypedges | dumont | 0108-5/45-PO | 해부용 |
| 비오틴 | Sigma | B4501 | For DM+/- |
| Boric Acid | Sigma | B6768-500G | 붕산 완충액 |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse CD24 항체, clone M1-69 | Biolegend | 101825 | 뉴런 및 성상세포의 유세포 염색용 |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD45 항체, clone 30-F11 | Biolegend | 103139 | 마이크로아교세포 |
| 의 유세포 분석용Brilliant Violet 785 안티 마우스 / 인간 CD11b 항체, 클론 M1 / 70 | Biolegend | 101243 | microglia |
| BSA Fraction V | Sigma | A3059-10G | SD 억제제 |
| CNP | Abcam | AB6319 | 성숙 희소 돌기아 교 |
| Coverslip | VWR | 631-0149 | 용 세포 플레이트아웃 |
| S3146-1EA | |||
| DMEM 고포도당, 피루브산나트륨, L-글루타민 | Gibco | 21969-035 | DM+/- 및 도금 매체 |
| DNase I | Thermofisher | 18047019 | SD 억제제의 경우 이 Dnase 또는 다른 Dnase를 사용할 수 있습니다 |
| DNase I | Sigma | D4263 | Dnase를 사용할 수 있습니다 |
| eFluor 780 | Thermofisher | 65-0865-14 | 라이브 / 데드 스테 |
| 파인 펜치 | Dumont | 0102-SS135-PO | 해부용 |
| GFAP | Invitrogen | 13-0300 | Astrocytes |
| HBSS w Ca Mg | Sigma | H9269-500ML | 도금 매체용 |
| HBSS w/o Ca Mg | Sigma | H9394-500ML | |
| 말 혈청 | 에 추가할 뇌용Gibco | 26050-070 | 도금 매체 |
| 용 Hydrocortisone | Sigma | H0396 | DM +/- |
| Iba1 | Alpha-Laboratories | 019-1971 | Microglia |
| Insulin | Sigma | I1882 | DM + |
| Leibovitz L-15 | GIbco | 11415-049 | SD 억제제 |
| MBP | Bio-Rad | MCA409S | Myelin |
| 마우스 CCL5/RANTES DuoSet ELISA 키트 | BioTechne | DY478-05 | ELISA 키트, 96웰 플레이트의 상등액에서 CCL5의 농도를 정량화하기 위한 |
| 키트, N1 매체 보충제 | Sigma | N6530-5ML | , DM+/- |
| Nestin, | Merck | MAB353 | |
| NeuN | Thermofisher | PA578499 | 신경 세포체 |
| NG2 | Sigma | AB5320 | 미성숙 희소돌기아교 |
| O4 항체, 항인간/마우스/쥐, APC | Miltenyi | 130-119-155 | 희소돌기아교세포의 유세포 염색용 |
| 펜/연쇄상구 | 그마 | P0781-100ML | DM+/- 및 도금 매체 |
| Poly-L-Lysinehydrobromide | Sigma | P1274 | 코팅용 붕산/폴리-L-라이신 용액 |
| 커버 슬립 SMI31 | BioLegend | 801601 | 축삭 |
| 사붕산 나트륨 | 시그마 | 221732-100G | 붕산 완충액 |
| 용 Trizol | Thermofisher | 15596026 | RT-qPCR 용 용해 세포 용 |
| 신 억제제 | Sigma T9003-100MG | SD 억제제 용 |
참고문헌
- Kovacs, G. G. Cellular reactions of the central nervous system. Handbook of Clinical Neurology. 145, Elsevier. 13-23 (2018).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Techniques. 1, Methuen. (1959).
- Hubrecht, R. C., Carter, E.
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재인쇄 및 허가
