단세포 물질 특성 측정을 위한 전단 분석 프로토콜

요약

이 프로토콜은 시험관 내에서 암성 및 비암성 세포주의 기계적 특성의 정량화를 설명합니다. 암세포와 정상 세포의 역학에서 보존된 차이는 예후와 진단에 영향을 미칠 수 있는 바이오마커로 작용할 수 있습니다.

초록

불규칙한 생체 역학은 광범위한 연구 대상인 암 생물학의 특징입니다. 셀의 기계적 특성은 재료의 기계적 특성과 유사합니다. 스트레스와 긴장에 대한 세포의 저항력, 이완 시간 및 탄력성은 모두 다른 유형의 세포와 비교하고 도출할 수 있는 특성입니다. 암성(악성) 세포와 정상(비악성) 세포의 기계적 특성을 정량화함으로써 연구자들은 이 질병의 생물물리학적 기초를 추가로 밝힐 수 있습니다. 암세포의 기계적 특성은 정상 세포의 기계적 특성과 일관되게 다른 것으로 알려져 있지만, 배양 중인 세포로부터 이러한 특성을 추론하는 표준 실험 절차는 부족합니다.

이 논문은 유체 전단 분석을 사용하여 시험관 내에서 단일 세포의 기계적 특성을 정량화하는 절차를 간략하게 설명합니다. 이 분석의 원리는 단일 세포에 유체 전단 응력을 적용하고 시간 경과에 따른 세포 변형을 광학적으로 모니터링하는 것입니다. 세포 기계적 특성은 디지털 이미지 상관 관계 (DIC) 분석을 사용하고 DIC 분석에서 생성 된 실험 데이터에 적절한 점탄성 모델을 맞추는 데 사용됩니다. 전반적으로, 여기에 요약된 프로토콜은 치료하기 어려운 암의 진단을 위한 보다 효과적이고 표적화된 방법을 제공하는 것을 목표로 합니다.

서론

암성 세포와 비암성 세포 간의 생물물리학적 차이를 연구하면 새로운 진단 및 치료 기회를 얻을 수 있습니다¹. 생체역학/기계생물학의 차이가 종양 진행 및 치료 저항성에 어떻게 기여하는지 이해하면 표적 치료 및 조기 진단을 위한 새로운 길을 제시할 수 있습니다².

암세포의 기계적 성질이 정상 세포와 다르다는 것은 알려져 있지만(예를 들어, 원형질막과 핵막의 점^{탄성)3,4,5,} 살아있는 세포에서 이러한 성질을 측정하기 위한 견고하고 재현 가능한 방법은 부족하다⁶. 전단 분석 방법은 단일 세포에 유체 전단 응력을 가하고 적용된 응력 3,4,5,7,8,9에 대한 개별 반응 및 저항을 분석하여 세포의 기계적 특성을 정량화하는 데 사용됩니다.

프로토콜

1. 단세포 전단 분석을 위한 준비

1. 세포 배양
   1. 2mL의 배양 배지가 들어 있는 35mm x 10mm 페트리 접시에 약 50,000개의 현탁 단일 세포를 시딩합니다.
      참고: 파종 전에 부유 세포를 소용돌이쳐 세포 응집체를 분해합니다.
   2. 세포를 37°C에서 배양하고 세포 부착 및 완전한 세포골격 단백질 형성을 위해 10 내지 48시간 사이를 허용한다.
      참고: 세포 응집을 피하면서 적절한 세포 성장과 부착을 보장하기 위해 세포 부착 기간과 증식 및 성장 속도를 고려하십시오. 이러한 매개 변수는 셀 유형에 따라 다릅니다.

2. 전단 분석 실험

1. 전단 분석 점성 유동 매체의 제조
   1. 약간 점성이 있는 유동 배지(0.015-0.02 Pa·s)를 보장하기 위해 0.05wt%의 무독성 및 비알레르기성 메틸셀룰로오스(4Pa·s)를 측정하여 배양 배지에 추가합니다.
   2. 균일한 혼합을 보장하기 위해 마그네틱 교반기/핫 플레이트를 사용하여 ~60-70°C의 온도에서 기본 배양 배지를 ~10-20분 동안 예열합니다. 매체를 계속 교반하면서 메틸셀룰로오스 입자의 응고를 피하기 ....

결과

DIC 및 점탄성 모델을 사용한 변형 분석과 결합된 전단 분석 프로토콜은 시험관 내에서 단일 세포의 기계적 특성을 정량화하는 데 성공적입니다. 이 방법은 정상 인간 유방 세포(MCF-10A)^3,4,9, 전이성이 적은 삼중 음성 유방암 세포(MDA-MB-468)3, 삼중 음성 유방암 세포(MDA-MB-231)3, 인간 골육종 세포 ^7,8, 그리고 가장 최근에는 교모세포종 세포(그림 ³). 전단 분석 기록에서 추출한 이미지 프레임의 DIC는 점탄성 모델(그림 4

토론

세포와 주변의 기계적 미세 환경 및 기계적 응력에 대한 반응을 시뮬레이션하기 위해 유사 기계 생물학적 환경을 설정하는 것을 포함하는 전단 분석 방법은 세포 기계적 특성 카탈로그를 생성했으며, 그 패턴은 암 세포주 3,4,5,7,8 사이에서 보존 된 물리적 이형성을 보여줍니다 . 이 방법은 기본적인 유체 역학과 물리학에 대한 이해를 결합하여 세포의 고유한 기계적 특성을 특성화하고 치료하기 어려운 여러 암을 검출하기 위한 잠재적인 재료 또는 기계적 바이오마커를 제공합니다 ^3,4.

전단 분석 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
CELL CULTURE
.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x[-] sodium bicarbonate	Corning	25-053-ci	세포 배양 시 기질에서 세포 분리용
15 mL 원심분리기 튜브	Falcon by Corning	05-527-90
35 mm 페트리 접시	Corning	430165
50 mL 원심분리기 튜브	Falcon by Corning	14-432-22
균 세포 배양을 위한	모든 원심분리기
Dulbecco의 DMEM(Modification of Eagle's Medium) 1x	Corning	10-013-cv	또는 세포 배양을 위한 기타 배지. DMEM은 U87 세포 배양에 사용되었습니다
	모두		멸균 세포 배양용
Heracell Vios 160i CO2 인큐베이터	Thermo Scientific	51033770	세포 배양 중 배양용
후드	모두		멸균 세포 배양용
마이크로피펫	모든		것 무균 세포 배양용
펫 팁	모두		멸균 세포 배양용
현미경	Leica/any		멸균 세포 배양용
칼슘 및 마그네슘이 없는 인산염 완충 식염수 PBS, 1x	Corning	21-040-CM
Pipetman	모두		멸균 세포 배양용
피펫 팁	모두		멸균 세포 배양용
Precision GP 10 액체 인큐베이터	Thermo Scientific	TSGP02
T25 플라스크	코닝	430639
T75 플라스크	코닝	430641U
SHEAR ASSAY
100 mL 비커	any		DMEM + 메틸 셀룰로오스 점성 전단 매체
DMEM	Corning
생성플로우 챔버 + 고무 개스킷	Glycotech	31-001	원형 플로우 챔버 키트(35mm 조직 배양 접시용)
하이브리드 유변계	HR-2 디스커버리 하이브리드 레오미터		단 유체 점도 측정용
마그네틱 교반 막대	임의		DMEM + 메틸 셀룰로오스 점성 전단 매체 생성용
임의			마그네틱 교반 플레이트DMEM + 메틸 셀룰로오스 점성 전단 매체 생성용
메틸 셀룰로오스	모든		유동 매체에서 DMEM의 점도를 증가시키기 위해
주사기 펌프	KD Scientific Geminin 88 plus	788088	유체 주입 및 인출 프로그래밍용
주사기, 튜브 및 커넥터			전단 장치 설정
SOFTWARE
ABAQUS 소프트웨어	Simulia
Digitial Image Correlation 소프트웨어	LaVision, 독일	DAVIS 10.1.2
이미징 소프트웨어	Leica/any microscope software
MATLAB		MATLAB MATLAB_R2020B

멸. 장갑 마이크로피 전