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방법 논문

Porcine Normothermic 격리 간 관류

2K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/65336

⸱

2023년 6월 9일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Immunology and Transplantation, Laboratory of Abdominal Transplantation, KU Leuven, 2Department of Abdominal Transplant Surgery and Coordination, University Hospitals Leuven

이 논문에서

요약

여기에 설명된 간 정상열 기계 관류(NMP)의 돼지 모델은 보존 전략, 생존력 평가 도구 및 장기 복구를 위한 플랫폼으로서 NMP를 연구하는 데 성공적으로 사용될 수 있습니다. 이는 높은 번역 가치를 지니고 있지만 기술적으로 까다롭고 노동 집약적입니다.

초록

간 제자리 정상온열 기계 관류(NMP)의 돼지 모델은 이식 연구에서 점점 더 많이 사용되고 있습니다. 설치류와 달리 돼지 간은 해부학적으로나 생리학적으로 인간과 비슷하며 장기 크기와 담즙 구성이 비슷합니다. NMP는 간 혈관 구조를 통해 따뜻하고 산소가 공급되며 영양이 풍부한 적혈구 기반 관류물을 재순환하여 생리학적 조건에 가까운 상태로 간 이식편을 보존합니다. NMP는 허혈-재관류 손상을 연구하고, 이식 전 간 사후 보존, 이식 전 간 기능을 평가하고, 장기 복구 및 재생을 위한 플랫폼을 제공하는 데 사용할 수 있습니다. 또는 전혈 기반 관류액이 포함된 NMP를 사용하여 이식을 모방할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 이 모델은 노동 집약적이고 기술적으로 까다로우며 높은 재정적 비용을 수반합니다.

이 돼지 NMP 모델에서는 따뜻한 허혈성 손상된 간(순환기 사망 후 기증에 해당)을 사용합니다. 먼저 기계 환기를 통한 전신 마취를 시작한 다음 흉부 대동맥을 60분 동안 고정하여 온열 허혈을 유도합니다. 복부 대동맥과 문맥에 삽입된 캐뉼러는 냉 보존 용액으로 간을 씻어낼 수 있도록 합니다. 씻겨 낸 혈액은 농축된 적혈구를 얻기 위해 세포 보호기로 씻어냅니다. 간 절제술 후 캐뉼러를 문맥, 간동맥 및 하부 대정맥에 삽입하고 혈장 확장기와 적혈구로 프라이밍된 폐쇄 관류 회로에 연결합니다. 중공사 산소공급기는 회로에 포함되어 있으며 38°C에서 70-100mmHg의 pO2를 유지하기 위해 열교환기에 연결됩니다. NMP는 동맥을 직접 통과하고 문맥을 통한 정맥 저장소를 통해 연속적인 흐름에 의해 달성됩니다. 유량, 압력 및 혈액 가스 값을 지속적으로 모니터링합니다. 간 손상을 평가하기 위해 관류액과 조직은 미리 정의된 시점에서 샘플링됩니다. 담즙은 총담관의 캐뉼라를 통해 수집됩니다.

서론

간 이식은 말기 간 부전에 대한 유일하고 확실한 치료법입니다. 그러나 대기자 명단에 있는 환자와 잠재적인 기증자 장기의 가용성 간의 지속적인 불균형으로 인해 성공이 제한됩니다1. 기증자 풀을 늘리기 위해 지난 10년 동안 기증자 연령, 간 지방증, 순환기 사망 후 기증(DCD)을 포함한 기증자 기준이 점진적으로 확대되었습니다2,3. DCD 시술 중 간은 연명요법 중단, 사망 선언, 현장 냉각 및 보존, 악화되는 허혈-재관류 손상(IRI) 사이에 항상 따뜻한 허혈 기간을 겪습니다4. 그 결과, DCD 간은 초기 동종이식 기능 장애 및 담즙 합병증의 발병률 증가와 관련이 있다 5,6.

이러한 고위험 기증자 간의 경우, 정적 냉장 보관을 통한 기존의 보존은 IRI에 대한 충분한 보호를 제공하지 못합니다. 이에 따라 NMP(normothermic machine perfusion)와 같은 대체 보존 전략이 상당한 견인력을 얻었습니다. 정상온열 기계 관류 동안, 간은 고립된 회로에 제 자리 에서 연결되고 체온에서 산소와 영양이 풍부한 관류물로 관류됩니다. 임상시험에 따르면 NMP는 간세포 손상을 감소시키는 것으로 나타났으며, 이는 트랜스아미나제 방출 피크 감소와 초기 동종이식 기능 장애감소에 의해 반영된 것으로 나타났습니다 7. 그러나 NMP8 동안 간 세포 생물학에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다.

동물 모델은 간 이식의 발전에 중추적인 역할을 해왔습니다. 설치류 모델과는 대조적으로, 돼지는 돼지 간이 해부학적으로나 생리학적으로 인간과 가깝고 장기 크기와 담즙 구성이 비슷하기 때문에 번역 가치가 더 높은 것으로 간주됩니다. 그럼에도 불구하고 돼지 간 이식 모델은 노동 집약적이고 표준화하기 어려우며 재정적 비용이 훨씬 더 많이 듭니다.

돼지 간 NMP는 다양한 용도로 사용할 수 있습니다. 전혈 기반 관류액을 사용할 때 이식 모방, 백혈구 고갈된 적혈구 기반 관류액으로 보호 환경에서 기증자 간을 보존하기 위해, 이식 전 간 기능을 현장에서 예측하는 잠재적인 바이오마커를 평가하기 위해, 또는 재생 요법을 조사하기 위한 플랫폼으로 적용할 수 있습니다 9,10,11.

돼지 간 NMP 모델의 채택은 까다롭고 수술 및 관류 관련 기술적 측면은 거의 설명되지 않았습니다. 우리 연구실에서는 Butler et al.12 이 처음 설명한 NMP 설정을 채택하여 이식을 위한 간 이식편을 보존하고 이식을 모방하는 데 사용할 수 있는 24시간 돼지 현장 격리 간 관류 모델을 개발하고 검증했습니다. 여기에서는 단계별 프로토콜에 대해 설명합니다. 방법론적 틀과 잠재적 함정은 다른 곳에서 발표되었다9.

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프로토콜

모든 실험은 KU Leuven 동물 관리 위원회의 승인 후 유럽 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 동물 정보

참고: 이 연구 프로토콜에는 체중이 약 30kg이고 간 무게가 600-700g인 3개월 된 수컷 TOPIGS TN70 돼지가 사용됩니다.

  1. 동물들을 12시간의 낮과 밤 리듬 이하로 한 우리에서 먹이와 수돗물을 자유롭게 이용할 수 있게 하고 동물들 사이의 시각적, 후각적, 청각적 접촉을 하게 합니다.
  2. 동물들이 주변 환경에 익숙해지기 위해 수술 최소 2일 전에 도착하도록 합니다. 수술 전 12시간 동안 돼지를 금식시키고 물을 자유롭게 마실 수 있도록 합니다.
    참고: 마취는 이소플루란으로, 진통제는 펜타닐로 유지됩니다. 마취 전반에 걸쳐 심전도, 맥박 산소 측정, 카프노그래피 및 혈압이 지속적으로 모니터링됩니다. 실험은 말기입니다. 돼지는 피를 흘려 안락사시키며, 지속적인 전신 마취와 진통제 하에 간을 조달합니다.

2. 관류 설정 준비

  1. 일회용 관류 키트 설치
    1. 저장소를 간 용기보다 약 15cm 높은 고정 높이에 고정합니다.
    2. 펌프 헤드를 원심 펌프의 지정된 슬롯에 연결합니다. 산소 튜브를 산소 공급기에 연결합니다. 히터/쿨러의 유입 및 배출 튜브를 산소공급기의 지정된 슬롯에 연결합니다.
    3. 저장소 아래의 유출 튜브에 하나의 핀치 밸브를 설치합니다. Y-연결 후 저장소로 유입 튜브에 두 번째 핀치 밸브를 설치하면 다른 튜브가 간 동맥에 공급됩니다.
      알림: 첫 번째 핀치 밸브는 문맥으로의 유입을 제어합니다. 두 번째 핀치 밸브를 닫으면 유량이 증가하므로 간 동맥의 압력도 증가합니다.
    4. 저장소 유출 튜브의 첫 번째 핀치 밸브에서 원위부에 유량 센서를 설치합니다. 펌프 헤드의 유입 튜브에 두 번째 유량 센서를 설치합니다.
      알림: 첫 번째 유량 센서는 문맥으로의 흐름을 측정합니다. 두 번째 유량 센서는 대정맥의 유출을 측정합니다.
    5. 산소공급기에서 유출 튜브를 절단하고 동맥 필터를 올바른 방향으로 삽입합니다.
      알림: 산소공급기 후 튜브를 2cm 이하로 자릅니다. 너무 오래 방치하면 37°C의 관류액으로 관류될 때 튜브가 부드러워질 때 꼬일 수 있습니다. 그래도 꼬이면 동맥 필터를 저수지 지지대에 묶어 지지하십시오.
  2. 누출 재순환 튜브의 설치
    1. 관류 키트에는 3/16 말단과 1/16 말단이 있는 두 개의 튜브가 포함되어 있습니다. 1/16 끝을 3/16 끝에 삽입하여 두 튜브를 서로 연결합니다. 3/16 끝을 저장소에 연결합니다.
    2. 회전 방향을 고려하여 롤러 펌프에 튜브를 설치하십시오. 올바른 튜빙 직경을 설정하고 속도를 분당 15-18회전(rpm)으로 설정합니다. 1/16 끝을 간 용기에 넣고 필요한 경우 고정합니다.
  3. 지속적인 인라인 혈액 가스 분석 보정
    1. 가스 분석기를 켜고 보정을 선택합니다.
    2. 센서 패키지에서 올바른 일련 번호를 확인하고 OK를 누릅니다.
    3. 카세트에서 동맥 센서 홀더를 꺼내고 위쪽에 파란색 캡, 아래쪽에 흰색 필터를 사용하여 센서를 연결합니다.
    4. 필터 아래의 흰색 캡을 풀고 제거하십시오. 필터 자체의 나사를 풀지 마십시오. 상단의 파란색 통풍 캡을 풀고 제거하지 마십시오. 센서와 센서 홀더를 보정 카세트에 단단히 삽입합니다.
    5. 보정을 시작합니다. 보정이 완료되면 보정 카세트에서 센서와 센서 홀더를 제거합니다. 하단의 흰색 필터를 제거하고 상단의 파란색 통풍 캡을 조입니다.
    6. s에 센서를 삽입하십시오.amp관류 키트의 링 라인. 관류 회로가 프라이밍될 때까지 가스 분석을 시작하지 마십시오.
  4. 회로의 프라이밍
    1. 500mL 혈장 확장기 백에 주입 라인을 삽입하고 저장소에 부착합니다. 저장소 유출 라인에 튜브 클램프를 놓고 저장소에 300mL의 플라즈마 확장기를 채웁니다.
    2. 튜브 cl을 제거하십시오.amp 플라즈마 확장기가 회로를 채우도록 합니다.
    3. 펌프 헤드와 산소 공급기의 공기를 제거하십시오. 이제 회로가 준비되었습니다. 히터/쿨러를 켜고 38°C로 설정합니다.
  5. 주입 라인의 준비
    1. 5 U/mL 헤파린 용액 5 mL(25.000 U)를 50 mL 주사기에 넣습니다. 추가로 25mL의 0.9% NaCl 용액을 추출하여 총 부피 30mL의 헤파린 용액을 얻습니다(주입 속도: 1mL/h).
    2. 타우로콜산나트륨 50g을 0.9% NaCl 50mL에 용해시키고 0.9% NaCl 450mL에 넣어 1% 농도에 도달합니다. 총 168mL의 부피가 필요합니다(주입 속도: 7mL/h).
    3. 100 U/mL 인슐린 용액 2 mL(200 U)를 50 mL 주사기에 주입합니다. 추가로 28mL의 0.9% NaCl 용액을 추출하여 총 부피 30mL의 인슐린 용액을 얻습니다(주입 속도: 1mL/h).
    4. 글리신 완충액(희석제) 10mL를 추출하여 에포프로스테놀 0.5mg 바이알에 넣습니다. 에포프로스테놀 키트에 제공된 미생물 필터를 사용하여 50mL 주사기에 글리신 완충액으로 재구성된 에포프로스테놀이 들어 있는 바이알에서 5mL를 추출합니다. 추가로 25mL의 0.9% NaCl 용액을 추출하여 총 부피 30mL의 에포프로스테놀 용액을 얻습니다(주입 속도: 1mL/h).

3. 마취 유도

  1. 진정
    1. 자일라진 2mg/kg 및 졸레틸 8mg/kg(틸레타민 4mg/kg 및 졸라제팜 4mg/kg)이 함유된 주사기, 0.9% NaCl 10mL가 함유된 주사기, 삼원 밸브, 연장선, 근육 주사 바늘 21G를 준비합니다.
    2. 둔근에 바늘을 넣고 자일라진과 틸레타민 혼합물을 주입한 다음 0.9% NaCl로 연장선을 씻어냅니다. 15분 후 돼지를 진정시킵니다.
    3. 돼지의 무게를 측정하여 수술실로 운반합니다.
  2. 마취
    1. 인공호흡기를 켜십시오.
    2. 돼지를 수술대에 누운 자세로 놓고 사지를 고정합니다.
    3. 1.5L의O2, 1.5L의 공기 및 1% 이소플루란이 포함된 환기 마스크로 사전 산소화합니다.
    4. 꼬리나 귀에 채도 프로브를 부착합니다. 지속적인 모니터링을 위해 3개의 심전도 리드를 연결합니다.
    5. 22G 카테터를 귓정맥에 삽입하고 삼방향 판막에 연결한 다음 400mL/h의 속도로 정맥(IV) 수액(Plasmalyte)을 점적하기 시작합니다.
    6. 50μg/mL 펜타닐이 함유된 60mL 주사기를 자동 주사기 드라이버에 넣습니다. 1mL의 볼루스를 투여하고 0.16mL/kg/h의 속도로 연속 주입을 시작합니다.
    7. 인공호흡 마스크를 제거하고 후두경을 삽입하여 후두개를 들어 올립니다. 기관내관을 기관에 삽입하고 풍선을 팽창시켜 공기 누출을 방지합니다. 테이프로 튜브를 돼지의 주둥이에 고정합니다.
      알림: 인공호흡 마스크를 제거할 때 이소플루란을 닫으십시오.
    8. 기관내관을 인공호흡기에 연결합니다.
      알림: 인공호흡기 설정: 0.4L 일회 호흡량; 0.5kPa 평균 기도 압력; 2.5kPa 기도 압력; 0.5kPa 양극단 호기 압력; 15/min 주파수; 4.7-5.3 kPa 호기말 CO2.
    9. 카프노그래프를 기관내관에 연결합니다.

4. 수술

  1. 깊은 정맥 카테터와 동맥선
    1. 베타딘으로 수술 부위를 소독하고 정중선 양쪽에 커튼을 놓습니다.
    2. 흉골 상단 왼쪽에서 흉쇄유돌근 측면으로 7cm 길이의 절개를 하고 기립성 견인기를 놓습니다.
    3. 근육에서 피하 조직을 측면 방향으로 절개하고 외부 경정맥을 확인합니다. 정맥을 절개하여 분리하고 곁가지가 있는 경우 결찰합니다.
    4. 외부 경정맥 주위에 두 개의 2/0 결찰을 놓고 두개골 결찰을 묶습니다.
    5. 묶인 결찰에서 꼬리 정맥을 잘라내고 12 프랑스 정맥 카테터를 삽입합니다.
      알림: 삽입하기 전에 정맥 카테터가 헤파린 식염수로 씻겨져 있는지 확인하십시오.
    6. 두 번째 결찰자로 카테터를 고정합니다. 귓정맥의 정맥 카테터가 약하거나 너무 작은 경우 IV 수액과 펜타닐 라인을 심부 정맥 카테터로 전환합니다. 그렇지 않으면 세포 보호기에 혈액을 채취할 때까지 사용하지 마십시오.
    7. 흉쇄유돌근의 내측 가장자리를 절개하고 기립성 견인기를 교체하여 측면의 흉쇄유돌근과 내측의 기관 사이의 평면을 엽니다.
    8. 경동맥을 노출시키기 위해 흉선을 제거하십시오. 동맥에 대해 4.1.4단계를 반복합니다.
    9. 경동맥의 동맥선을 꼬리 방향으로 삽입하고 고정합니다. 동맥선을 압력 모니터의 라인에 연결합니다.
  2. 대동맥과 대정맥의 해부
    1. xipoid에서 치골까지 정중선 개복술을 수행합니다.
      참고: 수컷 돼지의 경우 음경에서 꼬리를 자르고 피하 요도 손상을 방지하기 위해 정중선에서 1cm 옆으로 절개합니다.
    2. 탯줄 인대를 횡절합니다. 복부 견인기를 놓습니다. 장을 왼쪽의 두개골 옆으로 당겨 대동맥과 대정맥을 시각화합니다.
      참고: 돼지 창자는 회전되지 않습니다. 그러므로, 후복막에 접근하기 위해 결장 동원이 필요하지 않습니다.
    3. 장골 분기점의 두개골 바로 옆에있는 대동맥의 약 3cm를 절개하고 대동맥 주위에 두 개의 합자를 놓습니다.
      참고: 대동맥 근처에 큰 림프관이 있습니다. 수술 부위가 흐려지고 해부를 복잡하게 만들 수 있으므로 손상시키지 않도록 주의하십시오.
    4. 대동맥과 같은 높이에서 대정맥을 해부하고 두 개의 결찰을 배치합니다.
  3. 위십이지장 인대 박리
    1. 위십이지장 인대의 측면에서 박리를 시작하고, 총담관을 해부하고, 혈관 고리로 둘러쌉니다.
    2. 담관을 내측으로 후퇴시켜 문맥을 노출시킵니다. 문맥의 측면에 있는 큰 림프절을 제거합니다.
    3. 췌장을 향하는 문맥을 확보하십시오. 위와 췌장에는 종종 결찰하고 절제해야 하는 가지가 있습니다. 간 측면에 혈관 고리와 췌장 측면에 합자로 문맥을 둘러쌉니다. 문맥을 측면으로 후퇴시키고 닫히지 않도록 합니다.
    4. 총동맥을 확인하고 혈관 고리로 둘러쌉니다.
  4. 흉부 대동맥 박리
    1. 간 꼬리를 당기고 상간대정맥에서 횡격막의 중앙 힘줄 부분을 복부로 엽니다. 식도를 오른쪽으로 후퇴시켜 흉부 대동맥을 노출시킵니다.
    2. 주변 조직을 자유롭게 절개하고 접합자 정맥이 손상되지 않도록 주의하십시오.
      참고: 흉부 대동맥을 둘러쌀 필요는 없습니다. 절개는 혈관 클램프를 배치할 수 있을 만큼 충분히 확장되어야 합니다.
  5. 세포 보호기의 준비
    1. 저장통을 검은색 링에 걸고 어댑터의 단일 다리에서 캡을 제거한 다음 튜브를 채혈 저장통 하단의 3/8인치 배출 포트에 연결합니다.
    2. 흡입/항응고제 튜브의 뚜껑을 풀고 채혈 저장소의 상단 가장자리에 있는 1/4인치 혈액 주입구 중 하나에 연결합니다.
    3. 뒤집어서 세탁 키트의 그릇을 삽입하십시오. 딸깍 소리가 들리는지 확인하십시오.
    4. 롤러 펌프와 튜브 디바이더에 튜브를 놓습니다.
    5. 구연산염 인산염 포도당 아데닌(CPDA)-1 혈액 채취 백을 기둥에 걸고 단단히 연결되어 있는지 확인합니다.
      참고 : CPDA-1 혈액 백 조성 (63mL) : 2.99g / L 무수 구연산; 26.3 g/L 이한대 구연산 나트륨; 2.22 g/L 모노히스레이트 인산나트륨; 31.9 g/L 포도당 일수화물; 0.275g/L 아데닌.
    6. 쓰레기 봉투를 세탁기 측면에 걸고(제대로 닫혀 있는지 확인) 세탁 키트(노란색 캡)에 연결하세요.
    7. 두 Y자형 튜브(흰색 캡)를 3L 0.9% NaCl 백에 연결합니다.
    8. 파란색 캡이 있는 튜브를 채혈 저장소 바닥에 있는 어댑터 튜브에 부착합니다. 자가수혈 시스템을 켭니다.
  6. 대동맥과 대정맥의 캐뉼레이션
    1. 헤파린 500IU/kg을 투여하고 2분 동안 순환시킵니다. 대동맥 주위에 꼬리 결찰을 묶고 대동맥에 20개의 프렌치 캐뉼라를 삽입하고 고정합니다. 대정맥에 대해서도 동일한 절차를 반복합니다.
  7. DCD 절차를 모방하기 위해 흉부 대동맥을 일정 시간(이 경우 60분) 고정하여 온열 허혈을 유도합니다.
    참고: 온열 허혈 중에는 충치와 경정맥 배액이 열리고 세포 보호기에 대한 혈액 수집이 시작됩니다. 이것은 돼지의 출혈을 초래합니다.
  8. 간 세척
    1. 따뜻한 허혈이 끝나면 대동맥 캐뉼라를 통해 2L의 얼음처럼 차가운(4-6°C) 보존 용액으로 콜드 플러시를 시작하고 슬러시 아이스의 국소 도포로 복부를 식힙니다.
      참고: 콜드 플러시 중에는 남아 있는 모든 혈액이 씻겨 나와 세포 보호기로 수집됩니다.
    2. 처음 2L이 세척되면 대동맥에서 캐뉼라를 제거하고 문맥에 결찰을 묶고 문맥을 캐뉼레이트합니다. 그런 다음 용기 루프로 고정하십시오.
    3. 문맥을 통해 간을 얼음처럼 차갑게(4-6°C) 보존 용액 2L로 씻어냅니다.
  9. 간절제술
    1. 복부에서 얼음을 제거합니다. 담관을 췌장 가까이로 절제합니다.
    2. 문맥 캐뉼라를 제거하고 문맥을 나눕니다. 장을 왼쪽으로 후퇴시켜 간하정맥을 노출시킵니다.
    3. 후복막에서 대정맥을 절개하고 신장 정맥에서 두개골만 분리합니다. 총간동맥을 셀리악동맥까지 절개하고 대동맥에서 기원합니다.
      알림: 올바른 다이어프램 크러스를 절단하면 노출을 개선할 수 있습니다.
    4. 위십이지장 동맥을 나누고 대동맥 패치로 셀리악 동맥을 잘라냅니다. 위에 가까운 작은 망막을 두개골적으로 식도까지 절제합니다.
    5. 왼쪽 삼각형 인대를 절단하여 왼쪽 간을 움직이십시오. 대정맥의 왼쪽에 있는 횡격막을 자릅니다.
    6. 복부에서 등쪽까지 오른쪽 횡격막을 잘라내어 오른쪽 간을 동원하고, 간하정맥 절편에서 꼬리 쪽으로 끝납니다.
    7. 간상대정맥을 절단하고 남아 있는 부착물을 절단합니다. 간은 이제 자유롭습니다. 그것을 제거하고 얼음물이 담긴 그릇에 넣으십시오.
  10. 백테이블 프로시저
    1. 간의 무게를 잰다. 25 프렌치 캐뉼라로 문맥을 캐뉼라하고 합자로 고정합니다. 14 개의 프랑스 강화 캐뉼라로 간 동맥을 캐뉼러하고 합자로 고정합니다.
    2. 간하정맥(infrahepatic vena cava)을 캐뉼레이트하고 캐뉼라(canuula)의 끝을 간정맥(hepatic veva)이 대정맥(vena cava)에서 배출되는 높이에 위치시킵니다. 합자로 고정하십시오.
    3. 횡격막 가장자리에 지갑 끈을 두어 횡격막 정맥에서 출혈이 발생하지 않도록 하고 간상정맥을 묶습니다.
    4. 문맥 캐뉼러의 공기를 제거하고 250mL의 저온 혈장 확장기로 문맥의 백테이블 플러시를 수행합니다. 누출이 있는지 확인하십시오.
      알림: 캐벌 캐뉼라를 통한 적절한 유출을 확인하십시오.
    5. 포털 플러시 후 튜브 cl을 놓습니다.amp 포털 캐뉼라에 공기가 캐뉼러와 포털 정맥으로 들어가지 않도록 합니다.
    6. 동맥 캐뉼라의 공기를 제거하고 간 동맥을 통해 250mL의 차가운 혈장 확장기를 세척합니다. 누출이 있는지 확인하고 옆 가지를 자릅니다. 동맥 및 기강 캐뉼라에 튜브 클램프를 놓습니다.

5. Normothermic 기계 관류

  1. 관류물
    1. 백테이블 준비 중에 세포 보호기에서 생산되고 세척된 적혈구를 회로에 추가하여 원하는 30%의 헤마토크릿을 얻습니다. 적혈구를 혈장 확장기와 혼합하기 위해 펌프를 시작하십시오. 연속 가스 분석기를 시작합니다.
      참고: 원하는 헤마토크릿을 얻기 위한 적혈구 부피 공식: (간 중량 + 프라이밍 볼륨) x 세척 후 원하는 헤마토크릿/헤마토크릿. 또한 연속 가스 분석기는 관류 온도에 대한 피드백을 제공하며, 이는 일반적으로 38°C에서 히터의 설정과 일치합니다.
    2. 10% 칼슘 글루코네이트 10mL, 헤파린 2mL(10.000IU), 750mg의 세푸록심 10mL를 0.9% NaCl 10mL에 퍼퓨세이트에 추가합니다. 수동 가스 블렌더를 0.5L/min FiO 2/21 %로 설정합니다.
  2. 관류 시작
    1. 누출 재순환을 위해 압력 센서, 유량 센서 및 롤러 펌프를 켭니다.
    2. 간을 용기에 넣습니다. 튜브 cl을 놓습니다.amps는 회로의 포털과 동맥 유입 튜브 및 캐벌 유출 튜브에 있고 Y 커넥터를 잘라냅니다.
    3. 캐뉼러를 각각의 유입 및 유출 튜브에 연결하고 그 사이에 T-연결 조각을 연결합니다. 공기가 회로로 유입되는 것을 방지하십시오.
    4. T-커넥션 피스에 3방향 탭을 설치하고 압력 라인을 연결합니다. 라인에 압력을 가하지 않고 지속적인 압력 모니터링을 시작합니다.
    5. 핀치 밸브를 거의 완전히 닫아 설정하여 초생리학적 흐름과 내피 스트레스를 방지합니다.
    6. 포털 유입에서 튜브 클램프를 제거하여 관류를 시작합니다. 포털 유입이 시작된 직후 기병 유출에서 클램프를 제거하고 펌프를 시작하십시오. 펌프 속도는 압력으로 제어되므로 -5mmHg에서 -2mmHg 사이의 기병 유출 압력을 목표로 합니다. 0.75mL/min/g 간의 포털 흐름을 목표로 합니다.
    7. 문맥 관류가 안정적이고 기강 압력이 적절하면 동맥관에서 클램프를 제거합니다. 약 55-60mmHg의 압력과 약 0.25mL/min/g의 간을 목표로 합니다.
  3. 안정적인 관류 혈류역학 유지
    1. 간을 유리 돔이나 플라스틱 랩으로 덮어 표면의 열 손실을 방지하십시오.
    2. 포털 흐름이 너무 높으면 포털 유입 튜브의 핀치 밸브를 닫으십시오.
    3. 기강압이 너무 음수가 되면 대정맥 내부에 진공이 생길 위험이 높아집니다. 과도한 음압은 펌프 속도를 늦춰 상쇄할 수 있습니다. 또는 문맥을 통한 유입을 증가시키면 대정맥에 더 많은 부피를 제공하여 음의 유출 압력을 줄일 수 있습니다.
    4. 동맥압이 너무 낮으면 펌프 속도를 높이거나 핀치 밸브를 포털 저장소 쪽으로 닫아 동맥 유입 튜브를 통해 더 많은 흐름을 밀어 넣어 동맥압을 높일 수 있습니다.
  4. 견본 추출
    1. 캐벌 유출 3방향 밸브 또는 산소공급기와 포털 저장소 사이의 지정된 샘플링 라인에서 관류액 샘플을 얻습니다.
    2. 관류 전반에 걸쳐 바늘 생검을 받습니다. 바늘 구멍은 회로의 간화로 인한 응고가 없으므로 봉합해야 합니다.
    3. 담관에 8 프렌치 캐뉼라를 고정하여 담즙을 수집합니다. 낭포관을 접합해야 합니다.

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결과

제시된 관류 프로토콜은 간 혈류의 자체 조절을 사용하여 최대 24시간 동안 안정적인 혈류역학적 상태를 달성하고 문맥 및 간 동맥에서 혈류의 생리학적 분포를 시뮬레이션합니다. 그림 1 은 관류 회로의 개략도를 나타냅니다. 그림 2A 는 문맥과 간동맥이 각각 총 간흐름의 약 75%와 25%를 차지하는 혈류의 일관된 분포를 보여줍니다(하대정맥 수준에서 측정). 도 2B 는 안정적인 간내 혈관 저항을 보여줍니다. 문맥은 간동맥에 비해 저항력이 낮으며 정상적인 생리학적 상태와 유사합니다.

적절한 산소화와 함께 안정적이고 일관된 관류는 24시간 동안 간 기능을 보존할 수 있습니다. 그림 3A 는 관류액에서 아스파르테이트 트랜스아미나제(간 손상 지표)의 방출이 관류 후 6-12시간...

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토론

여기에서는 돼지 간 NMP에 대한 경험을 자세히 설명했습니다. 이 기술의 장점으로는 높은 번역 가치와 다양성을 들 수 있습니다. 돼지 간 NMP는 이 향상된 보존 기술에 대한 조사를 하고 이해를 높이기 위해 또는 이식을 모방하기 위해 적용할 수 있습니다. 이 설정을 통해 관류의 모든 측면을 수동으로 제어할 수 있으므로 다양한 방법으로 문맥압과 동맥압을 모두 조정할 수 있습니다.

임상 실습을 가능한 한 가깝게 시뮬레이션하기 위해 돼지의 간 절제술은 인간 기증자에서 수행되는 것과 유사하게 수행되며, 이는 일부 백테이블 준비가 필요하다는 것을 의미합니다. 그것은 폐쇄 회로이기 때문에, 간을 뒤에서 씻어내는 동안 세심한 지혈에 주의를 기울여야 합니다. 재순환관은 약간의 누출을 허용하지만 과도한 문턱 출혈은 용혈을 증가시킬 수 있습니다. 준비의 또 다른 핵심 단계는 대정맥 내 유출 캐뉼라의 위치인데, 차선의 배치는 대정맥의 붕괴...

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공개 사항

저자는 공개할 내용이 없습니다.

감사의 글

저자는 이 실험에 참여한 KU Leuven 의과대학의 모든 연구생에게 감사의 뜻을 전합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Alaris GH Plus 주사기 펌프BD 케어 퓨전80023 유엔 01-G
마취 장치박사ä 게르딛
동맥 카테터 Cavafix CertoBraun, Melsungen, 독일BRAU4152557
혈액 가스 분석기라디오미터ABL815
글루콘산칼슘 10%Braun, Melsungen, 독일570/13596667/1214
카프노그래프박사ä 게르사이오
셀 세이버메드트로닉자동 로그
원심 펌프 Biomedicus메드트로닉85315 개정판 3.0
원심분리기 Rotina 420R HettichVWR521-1156
맞춤형 관류 회로메드트로닉M323901C
일회용 세트 셀 세이버메드트로닉ATLS24
DLP 1단 정맥 캐뉼라, 스트레이트 20F메드트로닉66120
에포프로스테놀GlaxoSmithKline Belgium, Wavre, 벨기에플로란
펜타닐-얀센 0.05 mg/mL얀센HK-08700
유량 센서 BioPro TT엠텍12271
포름알데히드 4%VWRVWRK4078.9005
냉동고 -80 &g; C뉴브런즈윅 사이언티픽U570-86
냉장고립헤르컵 3513
겔로플라즈마Fresenius-Kabi, 바트 홈부르크, 독일프리플렉스
히터 쿨러Stö ckert-shiley, 소린 그룹16-02-1950
헤파린 5000 IE/mLLeo Pharma, 발레루프, 덴마크헤파린레오
간동맥 캐뉼라메드트로닉바이오 메디커스 12층
IGL-1 장기 보존 솔루션조르주 로페즈 연구소IGL-1/1000/D
인라인 혈액 가스 분석기테루모교정기 3MCDI 540/CDI 500
인슐린 200 IU ActrapidNovo Nordisk, Dagsvaerd, 덴마크메디-00018
이소플루란 1000 mg/g 흡입 증기샤넬 파마아이소 베트
IV 카테터 BD Insyte-W 20GBD381334
액체 질소 탱크KGW 등온선S22 시리즈
Mersilene 250CM M3 USP2/0 비 니들 리가팍JNJ 메디컬F4503
Mersilene 250CM M3.5 USP0 비니들 리가팍JNJ 메디컬F4504
Mersilene 5X70CM M3.5 USP0 비 니들JNJ 메디컬EH6935H
Mersilene 6X45CM M3 USP2/0 비 니들JNJ 메디컬EH6734H
마이크로 피펫 1000 & micro; L소코렉스82,51,000
모니터링지멘스SC 8000
플라즈마 라이트 비아플로백스터플라즈마 라이트 비아플로
문맥 캐뉼라차분한 실험실18층 RV-40018
압력 센서Stö ckert-shiley, 소린 그룹22-06-2000
압력 서보 레귤레이터메드트로닉BM 9505-2
프롤렌 4-0JNJ 메디컬EH7151H
롤러 펌프코브 센추리 미국468048-000 개정 C
중탄산나트륨 8.4%Braun, Melsungen, 독일362 2339
타우로콜산나트륨시그마 알드리치, 미국 벌링턴86339
수술용 메스 nr 24스완 모튼0211
정맥 카테터, 3루멘; 12FR화살AK-12123-F
Vicryl Vio 250CM M2 USP3/0 비 니들 기가팍JNJ 메디컬V1205G
자일라진 2%VMD 축산 제약자일-M 2%
지나세프 세푸록심 750mgGlaxoSmithKline Belgium, Wavre, 벨기에NDC 0173-0353-32
졸레틸 100버박졸레틸 100

참고문헌

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  2. Monbaliu, D., Pirenne, J., Talbot, D. Liver transplantation using donation after cardiac death donors. Journal of Hepatology. 56 (2), 474-485 (2012).
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  5. Meurisse, N., et al. Outcomes of liver transplantations using donations after circulatory death: A single-center experience. Transplantation Proceedings. 44 (9), 2868-2873 (2012).
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