이 프로토콜은 관심 생물학적 샘플에 대해 표준화된 장비를 사용하여 poly(A) RNA 정제, 중아황산염 변환 및 라이브러리 준비를 수행하기 위한 따라하기 쉬운 워크플로우를 제공합니다.
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이 논문에서
요약
초록
다양한 유형의 RNA 전사체에서 RNA 전사 후 변형은 진핵 세포의 다양한 RNA 조절과 관련이 있습니다. 비정상적인 RNA 5-메틸시토신 변형과 RNA 메틸전이효소의 조절 장애 발현은 암을 포함한 다양한 질병과 관련이 있는 것으로 나타났습니다. 전사체 전체 중아황산염 염기서열분석은 염기쌍 분해능에서 중아황산염 변환 RNA의 위치와 정량적 사이토신 메틸화 수준을 특성화하기 위해 개발되었습니다. 여기에서 이 프로토콜은 mRNA 5-메틸시토신 변형 부위의 전사체 전체 매핑을 허용하기 위해 2라운드의 폴리(A) RNA 정제, 3주기의 중아황산염 반응 및 라이브러리 준비 절차를 자세히 제시합니다. 주요 반응 후 RNA의 양과 질을 평가하는 것은 RNA 무결성을 모니터링하는 데 필수적이며 고품질 염기서열분석 라이브러리를 보장하기 위한 중요한 단계입니다. 이상적으로는 3일 이내에 절차를 완료할 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용하면 고품질 total RNA를 입력으로 사용하면 관심 샘플에서 차세대 염기서열분석을 위한 강력한 bisulfite-mRNA 라이브러리를 실질적으로 구축할 수 있습니다.
서론
150가지 이상의 전사 후 변형(post-transcriptional modifications)1 중 5-메틸시토신(m5C) 변형은 리보솜 RNA, 전달 RNA, 메신저 RNA, 마이크로 RNA, 긴 비코딩 RNA, 금고 RNA, 인핸서 RNA, 작은 카잘체 특이적 RNA를 포함한 다양한 유형의 RNA에서 확인되었습니다2. RNA m 5 C는 식물 뿌리 발달 조절3, 바이러스 유전자 발현4 및 암 진행5과 같은 다양한 생물학적 및 병리학적 메커니즘과 관련이 있습니다. 이 프로토콜의 목적은 다양한 발달 단계 또는 질병 환경에서 생물학적 샘플의 전사체 전체 mRNA m5C변형 프로파일을 특성화하기 위한 간소화된 파이프라인을 제공하는 것입니다. 전사체 전체 중아황산염 염기서열분석은 염기쌍 분해능 6,7,8,9에서 중아황산염 변환 RNA의 위치 및 정량적 시토신 메틸화 수준을 특성화하기 위해 개발되었습니다.....
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프로토콜
1. Poly(A) RNA 정제
참고: 폴리(A) RNA 정제를 진행하기 전에 DNase I으로 처리된 total RNA를 사용하고 모세관 또는 기존 겔 전기영동 평가를 통해 전체 RNA 품질 및 무결성을 검사합니다. 조사관은 고분자량 분야에서 28S 및 18S rRNA 리보솜 밴드를 식별하고 저분자량 필드에서 5.8S rRNA 밴드를 식별하여 전기 페로그램에서 중요한 도말 밴드를 식별할 수 있어야 합니다. 정제 단계는 기본적으로 특정 단계에 표시된 약간의 수정과 함께 제조업체의 지침을 따릅니다. 이 프로토콜에 사용된 모든 재료 및 도구와 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
- 준비
- 시약, 세척 완충액, 올리고(dT) 비드 및 용해 완충액을 실온에서 30분 동안 예열한 후 다음 절차를 수행합니다.
- 폴리(A)-농축 RNA의 분리를 위해 적절한 양의 RNA를 뉴클레아제가 없는 1.5mL 미세 원심분리 튜브로 옮겨 10-20μg의 고품질 total RNA 분취액을 출발 물질로 준비합니다. 70°C 의 열 블록에서 5분 동안 배양한 다음 얼음 위에서 2 분 동안 유지합니다.....
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결과
세포주 19로부터의 일련의 bsRNA-seq 라이브러리는 이 보고서의 절차에 따라 생성되었습니다(그림 1). 세포주 샘플에 대해 수행된 DNase 처리와 함께 전체 RNA 정제 및 겔 전기영동 및 UV-Vis 분광광도법(A260/A280)으로 품질을 확인한 후 RNA 샘플은 폴리(A) RNA 농축을 진행할 수 있습니다. 이중 정제가 리보솜 RNA의 대부분을 제거할 수 있는지 여부를 결정하기 위해 rRNA 오염 비율을 자동으로 계산할 수 있는 모세관 전기영동 총 RNA 분석으로 폴리(A) RNA의 정제 효율을 평가했습니다(그림 2). RNA 절편 피크 패턴과 rRNA 오염 비율에서 두 번 정제한 RNA 샘플은 실제로 AsPC-1 및 BxPC-3에서 리보솜 RNA의 오염이 각각 6.5%에서 2.2%로, 2.6%에서 1.1%로.......
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토론
이 프로토콜에서는 표준화된 구성 요소를 활용하여 폴리(A) 농축, 중아황산염 변환 및 라이브러리 준비의 상세한 파이프라인을 달성했습니다. 추가 염기서열분석 분석을 통해 관심 샘플에서 mRNA 5-methylcytosine을 식별할 수 있었습니다.
중요한 단계는 RNA의 분해가 poly(A) RNA 정제의 회수율에 영향을 미치기 때문에 출발 물질-총 RNA의 품질입니다. poly(A) RNA 정제 단계를 수행하기 전에 샘플을 조심스럽게 취급하고 RNase 오염을 방지해야 합니다. 절차의 또 다른 중요한 부분은 도서관 준비에 있는 PCR 주기의 수이다. 사이클 번호의 결정은 라이브러리 준비에 사용되는 중아황산염 처리된 mRNA의 양과 PCR 전 단계에서 단일 크기 선택 또는 이중 크기 선택의 사용 여부에 따라 달라집니다. 따라서 관심 샘플에 적합한 사이클 수는 동일한 세포주 또는 조직에 대한 최적의 사이클 수를 결정하기 위해 모세관 전기영동에 의한 PCR 산물 크기 분포를 평가하고 .......
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공개 사항
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 대만 국가과학기술위원회(National Science and Technology Council of Taiwan)의 지원을 받았습니다. [NSTC 111-2314-B-006-003]
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Agilent 2100 전기영동 바이오분석기 시스템 | Agilent, Santa Clara, CA | RNA 품질 검출 | |
| AMpure XP 비드 | Beckman Coulter | A63881 | 정제 |
| DNA 바이오분석기 DNA 고감도 키트 | Agilent, Santa Clara, CA | 5067-4626 | DNA 품질 검출 |
| Bioanalyzer RNA 6000 Pico kit | Agilent, Santa Clara, CA | 5067-1513 | RNA 품질 검출 |
| DiaMag02 - 마그네틱 랙 | Diagenode, Denville, NJ | B04000001 | 라이브러리 준비 |
| 지원 DiaMag1.5 - 마그네틱 랙 | Diagenode, Denville, NJ | B04000003 | assist poly(A) RNA purificaion |
| Dynabeads mRNA DIRECT purification kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 61011 | poly(A) RNA purificaion; Wash Buffer 1 및 Wash Buffer 2 |
| Ethanol | J.T.Baker | 64-17-5 | |
| EZ RNA 메틸화 키트 | Zymo, Irvine, CA | R5002 | 바이설파이트 처리 |
| Firefly luciferase mRNA | Promega, Madison, WI, USA | L4561 | 스파이크 제어 seqeunce |
| KAPA Library Quantification Kits | Roche, Switzerland | KK4824 | library quantification |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Total RNA quantity detection | |
| NEBNext multiplex Oligos for illumina (index Primer set1) | New England Biolabs, Ipswich, MA | E7335S | 라이브러리 준비 |
NEBNext Ultra  Illumina | New England Biolabs, Ipswich, MA | E7760S | 라이브러리 준비 |
| Nuclease-free Water | Thermo Fisher Scientific | AM9932 | |
| P2 피펫맨 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 4641010 | |
| Qubit 2.0 형광측정기 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | RNA 수량 검출 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Q32854 | DNA 수량 검출 |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Q32852 | RNA 수량 검출 |
참고문헌
- Boccaletto, P., et al. MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2021 update. Nucleic Acids Research. 50, D231-D235 (2022).
- Bohnsack, K. E., Höbartner, C., Bohnsack, M. T. Eukaryotic 5-methylcytosine (m5C) RNA Me....
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재인쇄 및 허가
