전기량 미세호흡계를 사용한 초파리 멜라노가스터의O2 소비량 측정

요약

전기량 호흡 측정법은 작은 유기체의 신진대사율을 측정하는 데 이상적입니다. 본 연구에서 Drosophila melanogaster에 대해 적응시켰을 때, 측정된_O2 소비량은 이전 연구에서 야생형 D. melanogaster에 대해 보고된 범위 내에 있었습니다. 더 작고 덜 활동적인 CASK 돌연변이의 플라이당 O₂ 소비량은 야생형보다 현저히 낮았습니다.

초록

전기량 미세호흡계는 안정적인 환경을 유지하면서 작은 유기체의_O2 소비량을 측정하기 위한 간단하고 저렴한 방법입니다. 전기량 마이크로 호흡계는 O 2 가 소비되고 유기체에 의해 생성 된 CO₂ 가 흡수 매체에 의해 제거되는 밀폐 챔버로 구성됩니다. 결과적인 압력 감소는 전해 O2 생성을 유발하고, 생성된_O2의 양은 이를 생성하는 데 사용된 전하량을 기록하여 측정됩니다. 본 연구에서 이 방법은 장치의 감도와 높은 안정성을 위해 최적화된 환경 조건으로 소그룹으로 테스트된 Drosophila melanogaster에 적용되었습니다. 이 장치에서 야생형 파리가 소비하는_O2의 양은 이전 연구에서 측정한 양과 일치합니다. 크기가 작고 덜 활성화되는 것으로 알려진 CASK 돌연변이에 의한 질량 특이적_O2 소비는 동종 대조군과 다르지 않았습니다. 그러나, CASK 돌연변이의 크기가 작기 때문에 플라이당 O₂ 소비가 현저히 감소하였다. 따라서 미세 호흡계는 D. melanogaster에서 O₂ 소비량을 측정 할 수 있으며 유전자형 간의 적당한 차이를 구별 할 수 있으며 대사율을 측정하기위한 다목적 도구를 추가합니다.

서론

신진대사율을 측정하는 능력은 환경적 맥락에서 유기체를 완전히 이해하는 데 매우 중요합니다. 예를 들어, 신진대사율이 수명¹에서 차지하는 역할, 신진대사에서 식이요법의 역할² 또는 저^{산소 스트레스3}의 역치를 이해하기 위해서는 신진대사율을 측정할 필요가 있다.

신진대사율을 측정하는 방법에는 두 가지가 있다⁴. 직접 열량계는 열 생산을 측정하여 에너지 소비를 직접 측정합니다. 간접 열량계는 종종 O 2 소비 (V_O2), CO₂ 생산 또는 둘 다의 호흡 측정 측정을 통해 다른 수단을 통해 에너지 생산을 측정합니다. 직접 열량계는 Drosophila melanogaster⁵를 포함한 작은 외온에 적용되었지만 호흡 측정법은 기술적으로 더 간단하고 일반적으로 사용됩니다.

야생형 및 돌연변이 D. melanogaster의 대사율을 측정하기 위해 여러 형태의 호흡 측정법이 성공적으로 사용되었으며, 체온

프로토콜

1. 파리 사육 및 수집

1. 파리를 25°C에서 표준 초파리 먹이가 들어 있는 좁은 유리병에 보관합니다.
   참고: 각 유전자형의 샘플 크기는 최소 9개의 복제로 구성되어야 하며, 각 복제는 아래에 설명된 대로 15-25마리의 파리를 포함하는 단일 호흡계 챔버로 구성됩니다.
2. 2-3일마다 파리를 옮깁니다.
3. 파리를 CO₂로 마취하고, 각 유전자형의 15-25 남성 그룹을 수집하고, 각 그룹을 신선하고 효모가 없는 식품 바이알에 넣습니다.
   참고: 수컷은 생식 상태로 인한 변동성을 줄이기 위해 사용되었습니다. 이 방법은 남녀 모두에게 적용됩니다.
4. 파리가 25 ° C에서 최소 24 시간 동안 회복되도록하십시오.
   참고: 실험 시점까지 파리는 1-4일 된 상태여야 합니다. 1.3단계에서 설명한 수집 빈도는 파리의 연령 범위를 좁히기 위해 설정할 수 있습니다.

2. 호흡계 챔버 설치 및 조립

1. 수조를 켜고 실험에 원하는 온도로 설정합니다.
   참고: 아래 실험은 50mL 슐렝크 튜브를 챔버로 사용하여 25°C에서 수행되었습니다. 구성 요소는

결과

호흡계 컨트롤러의 압력 및 전류 출력은 그림 3A의 한 실험에서 하나의 챔버에 대해 표시됩니다. 첫 번째 긴 전류 펄스는 주변 압력(약 992hPa)에서 사전 설정된 OFF 임계값인 1017hPa까지 챔버를 가압했습니다. 파리가 O 2 를 소비하고 CO 2 가 흡수됨에 따라 압력은 O₂ 발생기를 통해 전류를 활성화하는 1016hPa의 ON 임계값에 도달할 때까지 천천히 감소했습니다. 표시된 예에서 각 펄스의 평균 진폭은 50.1mA이고 지속 시간은 16.1초이며 펄스당 약 0.81쿨롱(C)의 전하 전달을 생성합니다. 이 챔버의 총 전하 전달은 총 240.0분 동안 3.28C였습니다. 파리의 질량 및 수(총 14.9mg의 무게가 되는 파리 23마리)에 대한 절차에 기술된 계산을 사용하여, 이 챔버 내의 그룹에 대한_O2 소비량은 3.19 mL h-1 g-1 또는 2.07 μL h-1.......

토론

위의 절차는 전자 전기량 미세 호흡계를 사용하여 D. Melanogaster에서_O2 소비량을 측정하는 방법을 보여줍니다. 야생형 D. melanogaster에서의_O2 소비에 대한 결과 데이터는 다른 사람들에 의해 보고된 것보다 다소 낮지만(표 1) 다양한 방법을 사용하여 대부분의 이전 간행물에서 기술된 범위 내에 있었다 ^3,6.

중요한 단계는 이 방법의 두 가지 절대적인 요구 사항인 기밀 밀봉과 환경 안정성을 해결했습니다. 기밀 환경을 유지하는 것은 간단하지만 주의가 필요합니다. Schlenk 플라스크와 튜브는 호흡 측정 챔버로 이상적입니다. 유리 구조는 많은 유형의 플라스틱(¹⁹)에 존재하는 가스 투과성을 방지하며, 이는 장기간의 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
19/22 온도계 어댑터	Wilmad-Labglass	ML-280-702	센서 플러그
2 ml 스크류캡 튜브	Fisher	3464	O2 발전기
2핀 커넥터	Zyamy	40PIN-RFB10	O2 발전기: 2핀
4핀 여성 커넥터	TE Connectivity	215299-4	센서 플러그
5 ml 폴리프로필렌 튜브	팔콘	352063	5.5cm로 자르고 구멍이 뚫려 있습니다
50ml Schlenk Tube 19/22 조인트	Laboy	HMF050804	챔버
6-도체 케이블	Zenith	6-Conductor 26 ga	케이블
6-Pin 암 벌크헤드 커넥터	Switchcraft	17982-6SG-300	컨트롤러
6-Pin 암 커넥터	Switchcraft	18982-6SG-522	센서 플러그
6-Pin 수 커넥터	Switchcraft	16982-6PG-522	케이블
800 ul 원심 분리기 튜브	Fisher	05-408-120	소다 라임 카트리지
ABS 플라스틱 인클로저	버드 산업	PS-11533-G	컨트롤러
Arduino Nano Every	Arduino LLC	ABX00028	컨트롤러
BME 280 센서	DIYMall	FZ1639-BME280	센서 플러그
회로 기판	Lheng	5 X 7 cm	컨트롤러
구리 황산염	BioPharm	BC2045	O2 발전기
컴퓨터	Azulle	Byte4	데이터 수집
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