방법 논문

Ultrastructural Expansion Microscopy in Three In Vitro Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi(트리파노소마 크루즈 의 3가지 체외 수명 주기 단계에서의 초구조 확장 현미경)

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DOI:

10.3791/65381

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2023년 5월 12일

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1Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR), CONICET, 2Area Biología, Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario (UNR), 3Area Parasitología, Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario (UNR), 4Unidad de Microscopía, Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR), CONICET

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 연구는 샤가스병의 원인이 되는 병원체인 트리파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi)의 3가지 체외 수명 주기 단계에서 초구조 확장 현미경 검사를 수행하기 위한 상세한 프로토콜을 보여줍니다. 당사는 세포골격 단백질(cytoskeletal proteins) 및 범단백질체(pan-proteome) 라벨링에 최적화된 기술을 포함합니다.

초록

여기에서는 현미경 이미징을 위해 세포 또는 조직의 공간 해상도를 높일 수 있는 기술인 Trypanosoma cruzi에서 초구조 확장 현미경(U-ExM)의 적용에 대해 설명합니다. 이는 기성품 화학 물질 및 일반적인 실험실 장비로 샘플을 물리적으로 확장하여 수행됩니다.

샤가스병은 T. cruzi에 의해 발생하는 광범위하고 시급한 공중 보건 문제입니다. 이 질병은 라틴 아메리카에 널리 퍼져 있으며 이주 증가로 인해 비풍토병 지역에서 심각한 문제가 되었습니다. T. cruzi 의 전염은 Reduviidae 및 Hemiptera 과에 속하는 조혈성 곤충 매개체를 통해 발생합니다. 감염 후, T. cruzi amastigotes는 포유류 숙주 내에서 증식하여 비복제 혈류 형태인 트리포마스티고테스(trypomastigotes)로 분화합니다. 곤충 매개체에서 트리포마스티고테스(trypomastigotes)는 후성마스티고테스(epimastigotes)로 변형되어 이분법(binary fission)을 통해 증식합니다. 수명 주기 단계를 구별하려면 세포골격의 광범위한 재배열이 필요하며 다양한 세포 배양 기술을 사용하여 실험실에서 완전히 재현할 수 있습니다.

여기에서는 세포골격 단백질의 면역 국소화 최적화에 중점을 두고 Trypanosoma cruzi의 3가지 in vitro 수명 주기 단계에서 U-ExM을 적용하기 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 또한 다양한 기생충 구조를 표시할 수 있는 범단백질체 라벨인 N-Hydroxysuccinimide ester(NHS)의 사용을 최적화했습니다.

서론

확장 현미경(ExM)은 2015년 Boyden et al.1에 의해 처음으로 설명되었습니다. 이는 기존 현미경이 회절 한계 이하의 공간 해상도를 달성할 수 있는 이미징 프로토콜입니다. 이 더 높은 해상도는 샘플의 물리적 확대로 인해 얻어집니다. 이를 달성하기 위해 형광 표지된 분자는 하이드로겔에 가교결합되어 물과 등방성으로 팽창합니다. 이러한 확장의 결과로, 신호는 3차원 모두에서 거의 등방성으로 분리됩니다. 이 방법은 저가의 화학 물질을 사용하며 기존(컨포칼) 현미경을 사용하여 약 65nm의 공간 해상도를 가능하게 하며, 이는 컨포칼 현미경의 표준 해상도(약 250nm)1보다 약 4배 우수합니다.

많은 생물학 분야에서 확장 현미경을 사용할 수 있게 된 다음 이정표는 기존 항체에 면역형광 표지를 적용한 것입니다2. 초기에 발표된 ExM 프로토콜의 또 다른 적응은 단백질체(MAP)의 확대 분석입니다3. 이 방법은 단백질 내 및 단백질 간 교차결합을 방지하기 위해 시료 하이드로겔 침지 전에 고농도의 아크릴아미드와 파라포름알데히드를 사용하여 시료의 단백질 함량과 세포 내 구조를 더 잘 보존할 수 있도록 했습니다. 이 대안 프로토콜은 더 낮은 농도의 고정제(포름알데히드/파라포름알데히드 및 아크릴아미드)를 활용하여 분리된 소기관의 전체 미세 구조의 향상된 보존을 얻기 위해 최적화되었습니다. 이 접근 방식을 초구조 확장 현미경(U-ExM)4이라고 합니다.

더 높은 해상도를 얻기 위해 유도 방출 파괴 현미경 또는 단일 분자 국소화 현미경을 포함한 초고해상도 현미경 기술과 ExM의 조합이 20nm 미만의 해상도에 도달하는 것도 보고되었습니다5.

ExM의 사용은 신경과학 및 세포골격 연구 분야에서 널리 보고되었지만6 기생 원생생물에 대한 연구는 소수에 불과하다. 본 연구실은 T. cruzi7에 U-ExM을 적용한 사실을 최초로 보고했습니다. 파운데이션 프로토콜은 주로 Toxoplasma gondii, Plasmodium ssp. 및 Trypanosoma brucei 8,9,10,11의 이전 U-ExM 보고를 기반으로 합니다.

ExM의 가장 큰 장점 중 하나는 모듈식 특성으로 다양한 생물학적 시료에 적응할 수 있는 유연성이 뛰어나다는 것입니다. 프로토콜은 사용자가 실험 요구 사항을 충족하기 위해 쉽게 조정할 수 있는 단계(예: 고정, 가교 결합 방지 또는 겔화)로 나눌 수 있습니다. 또한 이 파이프라인을 수정하여 모델 유기체와의 호환성을 향상시키거나 특정 해상도를 달성할 수 있습니다. 결과적으로 ExM은 고급 및 비고급 광학 시스템 모두에 엄청난 잠재력을 제공하여 향후 더 광범위한 응용 분야를 보장합니다.

미국 트리파노소마증이라고도 하는 샤가스병은 원생동물 기생충인 트리파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi)에 의해 발생하는 라틴 아메리카의 풍토병입니다. 기생충의 생애 주기는 복잡하며 포유류의 경우 두 가지 발달 단계와 이 질병의 생물학적 매개체인 곤충 숙주(Triatominidae 계통의 구성원)에서 두 개의 발달 단계를 포함합니다. 샤가스병은 세계보건기구(WHO)가 지정한 소외열대질병 그룹에 속하며 라틴 아메리카에서 심각한 경제적, 사회적 문제를 나타냅니다. 역학 연구에 따르면 전 세계적으로 800만 명이 샤가스병을 앓고 있으며 매년 10,000명 이상이 사망하는 것으로 추정됩니다. 이 수치는 전 세계적으로 공중 보건 문제로서 샤가스병의 중요성을 보여줍니다. 샤가스병의 지리적 분포는 최근 수십 년 동안 변화해 왔으며, 원래 샤가스병이 발견되었던 라틴 아메리카의 주로 시골 지역과 달리 현재 많은 감염자가 이주 증가로 인해 전 세계적으로 대도시 지역에 거주하고 있습니다12.

T. cruzi의 발달 단계는 수명 주기 전반에 걸쳐 다르며 이는 시험관에서 완전히 복제될 수 있습니다. epimastigotes는 곤충 매개체의 복제 형태이며, 세포체의 중앙 영역에 구형 핵이 있고 핵에 대한 전방 영역에 막대 모양의 kinetoplast(kinetoplastids에 고유한 미토콘드리아 DNA 함유 구조)가 있으며 자유 편모가 있습니다. 트리포마스티고테스(Trypomastigotes)는 감염성, 비복제성 형태이며, 길쭉한 핵, 둥근 후방 키네토플라스트(posterior kinetoplast) 및 기생충의 전체 길이를 따라 원형질막에 부착된 편모를 가지고 있습니다. Amastigotes는 세포 내 복제 형태입니다. 그들은 중앙 영역에 핵을 가지고 있고, 세포체의 앞쪽 부분에 막대 모양의 kinetoplast를 가지고 있으며, 감소된 편모를 가지고 있습니다. 다양한 환경에 대한 기생충의 적응력은 이러한 형태학적 변이의 반영입니다. 또한 이 생명주기는 대칭적 분열과 다양한 과도기적 발달 단계를 포함한다는 점을 언급할 가치가 있다13. 분화 과정에서 트리파노소마티드의 세포골격(cytoskeleton)은 중요한 역할을 합니다. 이 구조는 원형질막 아래에 안정된 미세소관의 질서 정연한 배열로 배열된 표피하 미세소관의 코르셋에 의해 형성됩니다. 또한, paraflagellar rod는 이러한 유기체에 존재하며, 이는 평행하게 뻗어 있고 편모 axoneme14에 부착되는 격자 모양의 구조입니다. 세포주기 단계를 따른 정확한 세포골격 조직과 핵 구조 변화는 트리파노소마티드에 특이적인 고유한 유전자 조절 메커니즘을 포함하므로 세포 생물학 연구를 위한 흥미로운 모델입니다.

T. cruzi 및 기타 원생동물 기생충의 크기가 작다는 점을 감안할 때 U-ExM은 이러한 중요한 병원체의 구조적 특징을 분석하기 위한 훌륭한 도구를 제공합니다. 앞서 언급했듯이 T. cruzi에 대한 이 기술의 적용 가능성은 Alonso7 박사에 의해 처음으로 검증되었습니다. 이 보고서는 T. cruzi의 다양한 수명 주기 단계에서 세포골격 단백질의 면역 국소화에 중점을 둔 완전한 U-ExM 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 또한 다양한 기생충 구조를 표시할 수 있는 범단백질체 라벨인 N-Hydroxysuccinimide ester(NHS)의 사용을 최적화했습니다. 또한, 기생충의 3단계를 얻기 위한 시험관 내 방법론이 설명됩니다.

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프로토콜

참고: 그림 1 은 전체 실험 설계를 보여줍니다.

트리파노소마증 수명주기 다이어그램; 현미경 준비; 확장 현미경; 면역형광.
그림 1: T. cruzi의 3가지 in vitro 수명 주기 단계에 대한 U-ExM 워크플로우. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

1. poly-D-lysine-coated 커버슬립의 준비

  1. 페트리 접시에 10cm x 10cm 정사각형의 밀봉 필름을 놓습니다. 커버 슬립을 35mm 유리 페트리 접시에 절대 에탄올로 목욕시켜 씻으십시오.
  2. 에탄올 수조에서 핀셋으로 커버 슬립을 제거하고 티슈 페이퍼로 여분의 액체를 배출합니다. 밀봉 필름 위에 커버슬립을 놓습니다.
  3. 나머지 에탄올은 현미경 등급의 종이로 흡수합니다. 커버슬립 중앙에 0.1% v/v 폴리-D-라이신 용액을 추가하고 팁으로 펴서 표면의 약 80%를 덮습니다. 페트리 접시를 닫고 37 ° C에서 1 시간 동안 배양합니다.
    참고: 22mm2 커버슬립의 경우 200μL의 폴리-D-라이신 용액을 사용합니다. 12mm 원형 커버슬립의 경우 100μL의 폴리-D-라이신 용액을 사용합니다.
  4. 초순수로 커버슬립을 세 번 씻습니다. 진공 청소기로 흡인을 사용하여 각 세척 사이에 물을 제거하십시오. 최대 1주일 동안 4°C에서 유지하십시오.

2. 용액 준비

  1. 38%(w/w) 아크릴산나트륨(SA)의 원액을 준비합니다.
    1. 저으면서 뉴클레아제가 없는 물 31mL에 SA 19g을 천천히 첨가합니다.
      참고: 이 솔루션은 점성이 매우 높습니다. 파이펫팅할 때 주의하십시오.
    2. SA가 완전히 용해되면 멸균 용기에 보관하십시오. 4 °C로 유지하고 6개월마다 교체하십시오.
      참고: SA는 브랜드에 따라 폴리아크릴레이트나트륨으로 인한 오염 징후를 보이는 경우가 있으며, 이는 원액이 황색을 띠고 흐려질 때 두드러집니다. 이 경우 주의해서 사용하십시오.
  2. 40%(w/v) 아크릴아미드(AA)의 원액과 2%(w/v) N, N'-메틸렌 비스아크릴아미드(BIS)의 원액을 준비합니다. 각 화합물을 초순수에 용해시키고 0.22μm 멸균 주사기 필터로 여과합니다. 4 °C의 멸균 용기에 보관하십시오.
    주의: AA 및 BIS는 독성이 강한 물질입니다. 흄 후드 아래에서 작업하고 적절한 보호 요소(장갑, 보호복, 마스크 및 보안경)를 사용하십시오.
  3. 38μL의 37% 포름알데히드(FA) 용액과 50μL의 40% 아크릴아미드 원액(단계 2.2)을 912μL의 인산염 완충 식염수(PBS; 표 1) 1.4% 포름알데히드와 2% 아크릴아미드의 최종 농도를 얻습니다.
    알림: CP 용액은 항상 신선하게 준비하고 피펫팅할 때 매우 정확해야 합니다. 예를 들어, P1000 피펫을 사용하여 900μL의 PBS를 취하고 P20 피펫을 사용하여 나머지 12μL의 PBS를 취합니다.
  4. 단량체 용액을 준비합니다.
    알림: 준비 직후 용액을 사용하지 마십시오. 사용하기 전에 최소 24시간 동안 -20°C에서 보관하십시오.
    1. 500μL의 38% SA 용액(단계 2.1), 250μL의 40% AA 용액 및 50μL의 BIS 용액(단계 2.2)과 100μL의 10x PBS를 혼합합니다(표 1).
    2. 900μL의 최종 부피를 각각 90μL의 단량체 용액과 함께 10x 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 분취합니다. -20 °C에서 최대 2주 동안 보관하십시오.
      참고: SA 용액은 점성이 매우 높기 때문에 피펫팅 시 팁에 남아 있을 수 있습니다. 조심하고 모든 것을 분배하십시오.
  5. 변성 용액 준비
    1. 초순수에서 준비된 350mM SDS(도데실나트륨) 용액 114.3mL와 초순수에서 준비된 4M 염화나트륨 용액 10mL를 혼합합니다. 250mL 비커를 저으면서 Tris 12g을 추가합니다.
      주의: SDS는 독성이 강합니다. 장갑, 보호복, 마스크, 보안경을 착용하고 흄 후드 아래에서 사용하십시오.
    2. 농축된 염산 용액으로 pH를 9로 조정합니다. 초순수로 최대 200mL를 만들고 4°C의 멸균 플라스크에 보관하십시오.
  6. 10% 과황산암모늄(APS) 용액과 10% TEMED 용액을 준비합니다.
    1. APS 0.1g을 초순수 1mL에 녹입니다.
    2. 초순수에 10% TEMED 용액 1mL를 준비합니다.
    3. 1.5mL 마이크로 원심분리기 멸균 튜브에 두 용액의 분취액 100μL를 준비하고 -20°C에서 최대 1개월 동안 보관합니다.
  7. 파라포름알데히드 용액을 준비합니다.
    1. 60 ° C에서 교반하면서 PBS 40mL에 파라 포름 알데히드 2g을 용해시킵니다. 용액이 흰색에서 무색으로 바뀔 때까지 1M NaOH를 적가합니다.
      주의: 포름알데히드는 독성이 강합니다. 장갑, 보호복, 마스크, 보안경을 착용하고 흄 후드 아래에서 사용하십시오.
    2. 용액을 실온에서 냉각시키고 최종 부피 50mL에서 NaOH로 pH를 7.2로 조정합니다. 0.22μm 멸균 주사기 필터로 필터링하고 멸균 용기에 보관합니다.
    3. 1.5mL 멸균 마이크로 원심분리 튜브에 1mL의 부분 표본을 준비하고 -20°C에서 보관합니다.
  8. 파라포름알데히드/글루타르알데히드 용액을 준비합니다.
    1. 초순수 3.5mL에 파라포름알데히드 0.2g과 16M NaOH 용액 50μL를 첨가합니다. 용액을 60°C로 가열하여 파라포름알데히드를 용해시킵니다.
    2. 식히고 300μL의 70% 글루타르알데히드를 첨가합니다. 초순수의 경우 부피를 5mL로 늘리고 마지막으로 PBS의 경우 10mL로 부피를 높입니다.
      주의: 파라포름알데히드와 글루타르알데히드는 독성이 매우 높습니다. 장갑, 보호복, 마스크, 보안경을 착용하고 흄 후드 아래에서 사용하십시오.
    3. 1.5mL 멸균 마이크로 원심분리 튜브에 1mL의 부분 표본을 준비하고 -20°C에서 보관합니다.

3. 기생충 배양의 준비

  1. T. cruzi epimastigotes를 성장시킵니다.
    1. T-25 플라스크(25cm2 성장 영역)에서 축척 배양을 사용하고 10% 태아 혈청(FCS)이 포함된 간 주입 트립토스(LIT) 배지에서 48-72시간마다 하위 배양하여 대수 단계에서 배양을 유지합니다. 표 1).
    2. 캡이 단단히 닫혔는지 확인하고 배양을 위해 배양 플라스크를 28°C에서 수직으로 유지합니다. 각 subculture 동안 Neubauer 챔버에서 세포 계수를 통해 기생충 성장을 모니터링합니다.
      참고: 이 연구에 사용된 Dm28c 균주의 경우 로그 위상 배양에서 후성유방형성의 농도는 1-5 x 107 parasites/mL 사이입니다.
    3. 10% FCS가 보충된 LIT 배지의 로그 상 배양에서 2 x 106 epimastigotes/mL의 현탁액을 준비합니다. 실온(RT)에서 10분 동안 5,000 x g 의 현탁액을 원심분리합니다. PBS로 한 번 또는 두 번 세척하고 200μL의 PBS에 재현탁합니다.
    4. 이전에 폴리-D-라이신으로 코팅된 원형 12mm 커버슬립을 부착합니다(섹션 1). RT에서 15-20분 동안 배양합니다. 가교 방지 단계(섹션 4)를 계속 진행합니다.
      참고: 또는 기생충이 커버슬립에 부착되기 전에 상온에서 7분 동안 차가운 메탄올로 에피마스티고트를 고정하거나 파라포름알데히드/글루타르알데히드 용액(2.8단계)을 RT에서 10분 동안 고정합니다. 고정 기생충은 4 °C에서 최대 1 주일 동안 보관할 수 있습니다.
  2. 감염된 베로 세포에서 아마스티고테스를 획득한다.
    1. 12웰 조직 배양 플레이트의 바닥에 멸균 24mm 원형 커버슬립을 놓습니다. 2% 태아 송아지 혈청(FCS)이 보충된 Dulbecco의 변형 이글 배지(DMEM)에서 2 x 105 Vero cells/mL의 현탁액을 준비합니다. 웰당 현탁액 500μL를 파종합니다.
      참고: 이 연구에서는 세포가 더 느리게 성장할 수 있도록 2% FCS와 함께 DMEM을 사용합니다.
    2. 세포 부착을 보장하기 위해 37 ° C 및 5 % CO2 에서 밤새 (ON, 12-16 시간) 배양하십시오.
    3. 배양 후 500μL의 멸균 PBS를 사용하여 세포를 두 번 세척합니다. 웰당 100만 개의 트리포마스티고트에 해당하는 100μL의 DMEM과 2% FCS로 T . cruzi 트리포마스티고테를 10의 감염 다중성(MOI)으로 세포에 추가합니다. 37 ° C 및 5 % CO2 에서 6 시간 동안 배양합니다.
    4. 배양 후 PBS로 플레이트를 두 번 헹굽니다. 2% FCS가 보충된 DMEM 500μL를 추가합니다. 이 시점에서 가교 방지 단계(섹션 4)를 계속합니다.
      참고: 세포질 내 아마스티고트는 감염 후 2일 후에 도립 광학 현미경을 통해 볼 수 있습니다(보충 그림 1). 또는 -20°C에서 7분 동안 차가운 메탄올로 트리포마스티고테스를 고정하거나 RT에서 10분 동안 파라포름알데히드/글루타르알데히드로 고정한 후 기생충이 커버슬립에 부착되기 전에 고정합니다.
  3. 감염된 베로 세포에서 트리포마스티고테를 얻습니다.
    1. 트리포마스티고테스(trypomastigotes)에 감염된 베로 세포 단층(30%-40% 합류점)의 상층액을 수집한다(MOI 1:10; ON 잠복기) 감염 후 4일.
      참고: T-25 플라스크의 경우 사용되는 Vero cell의 초기 농도는 800,000 cells이고 T-75 flask의 경우 200만 cells입니다.
    2. 세포 계수를 위해 Neubauer 챔버를 사용하여 트리포마스티고테 농도를 측정합니다. 원심분리기 4 x 106 트리포마스티고테, 7,000 x g , 상온에서 10분 동안
    3. PBS로 두 번 헹구고 200μL의 PBS에 재현탁합니다. 폴리-D-라이신으로 코팅된 원형 12mm 커버슬립에 적용합니다(섹션 1). RT에서 10-15분 동안 배양합니다. 가교 방지 단계(섹션 4)를 진행합니다.
      참고: 또는 -20°C에서 7분 동안 차가운 메탄올로 트리포마스티고테스를 고정하거나 RT에서 10분 동안 파라포름알데히드/글루타르알데히드로 기생충이 커버슬립에 부착되기 전에 고정합니다.

4. 가교 방지 실시 (DAY 1)

  1. 부착된 기생충 또는 감염된 세포(위쪽을 향함)가 있는 12mm 커버슬립을 각 웰에 0.5mL의 CP 용액(단계 2.3)이 있는 24웰 플레이트에 담급니다.
  2. 증발을 줄이기 위해 빈 우물에 물을 채우십시오. 밀봉 필름으로 플레이트를 밀봉하십시오. 37 °C에서 5 시간 동안 배양합니다. 이 단계는 4°C에서 ON 배양까지 확장할 수 있습니다.
    알림: 항상 커버슬립을 용액에 담그십시오. 커버슬립 위에 고정 용액을 피펫으로 피펫하지 마십시오.

5. 시료의 겔화 수행

  1. 티슈 페이퍼 위에 밀봉 필름이 있는 페트리 접시에 습한 챔버를 조립합니다(그림 2A). 티슈 페이퍼에 물을 넣고 -20°C에서 20분 동안 배양하여 식힙니다. TEMED와 APS 부분 표본을 얼음 위에서 20분 동안 해동합니다(2.6단계).
    알림: APS를 세 번 이상 동결-해동하지 마십시오.
  2. 서늘하고 습한 챔버를 얼음 위에 놓습니다(그림 2A). 섹션 24에서 준비한 4웰 플레이트를 인큐베이터에서 꺼냅니다. 3mL 파스퇴르 피펫으로 CP 용액을 흡인하고 용액을 남겨 두지 않으면 커버 슬립을 제거하기가 어렵습니다.
  3. 핀셋으로 고정 용액에서 12mm 커버 슬립을 제거하고 기생충이 위를 향하도록 티슈 페이퍼 위에 놓습니다.
    참고: 멸균 바늘을 사용하여 커버슬립을 들어 올린 다음 핀셋으로 잡는 것이 도움이 됩니다.
  4. 90μL의 단량체 용액 분취액(단계 2.4)에 5μL의 TEMED와 5μL의 이전에 해동된 APS를 추가합니다. 와류 믹서와 2-3 초 이상 혼합하지 마십시오. 뚜껑으로 튜브를 닫을 필요는 없습니다.
    참고: 항상 TEMED를 먼저 추가하고 APS를 마지막에 추가하십시오. 단량체 용액에 APS first와 TEMED last를 추가하면 겔화 공정이 더 빨라져 조작할 시간이 없습니다.
  5. 각 커버슬립에 대해 습한 챔버의 밀봉 필름 위로 35μL를 빠르게 한 방울 떨어뜨립니다. 즉시 핀셋으로 커버슬립을 집어 들고 기생충이 아래를 향하도록 드롭(그림 2B) 위에 눕습니다.
    알림: 한 번에 최대 두 개의 커버슬립을 만드십시오. 용액이 매우 빠르게 중합되기 때문에 이 단계를 지연시키지 않는 것이 중요합니다.
  6. 습한 챔버를 얼음 위에서 5분 동안 배양한 다음 37°C에서 1시간 동안 배양합니다. 다음 단계를 위한 올바른 온도를 보장하기 위해 95°C에서 가열 블록을 켭니다.

겔에 세포 캡슐화; A-B: 얼음 위의 페트리 접시; C: 겔 아래 세포의 다이어그램, 커버슬립 설정.
그림 2: 겔화 단계 세부 정보. (A) 습한 챔버의 조립. (B) 겔화를 위해 TEMED 및 APS를 사용하여 단량체 용액에 커버 슬립을 떨어 뜨립니다. (C) 이미징을 위해 조립된 겔의 개략도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

6. 겔화된 샘플을 변성시키고 등방성 팽창을 수행합니다.

  1. 변성 용액(2.5단계)을 4°C에서 제거합니다. 침전된 경우 완전히 녹을 때까지 뜨거운 물 욕조에 넣으십시오.
  2. 변성 용액 2mL를 6웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 5.3단계의 커버슬립을 변성 용액이 있는 플레이트로 옮깁니다. RT에서 15분 동안 부드럽게 흔들어 젤이 커버슬립에서 분리되도록 합니다.
  3. 금속 주걱을 사용하여 겔을 조심스럽게 옮깁니다(12mm 커버슬립에서 제거). 캡 잠금 장치를 사용하여 튜브를 고정합니다. 가열 블록에서 95 °C에서 1 시간 30 분 동안 배양합니다.
    참고: 이 단계에서 젤이 팽창하기 시작합니다. 겔을 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브로 옮길 때는 부드럽게 이동합니다.
    주의: 배양 후 겔이 들어있는 튜브는 95 ° C이며 이는 위험 할 수 있습니다. 보호 장갑을 사용하고 튜브를 다루기 전에 식혀 화상과 돌출을 방지하십시오.
  4. 확장팩의 첫 번째 라운드를 수행합니다.
    1. P1000 피펫을 사용하여 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브의 변성 용액을 겔과 함께 흡입합니다. 작은 주걱을 사용하여 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브의 젤을 10mL의 초순수가 담긴 페트리 접시에 30분 동안 옮깁니다.
    2. 일회용 3mL 파스퇴르 피펫을 사용하여 초순수를 변경합니다. RT에서 ON으로 배양합니다.
      참고: 젤을 부드럽게 다루십시오., 배양 첫 30분 후에는 약해졌기 때문입니다.
    3. 일회용 3mL 파스퇴르 피펫을 사용하여 초순수를 한 번 더 교체합니다.
      참고: 각각 30분씩 3번의 물 배양으로 충분하지만 실용성을 위해 두 번째 배양은 켜둔 상태로 두는 것이 좋습니다.

7. 표적 단백질의 형광 표지 수행(DAY 2)

  1. 일회용 3mL 파스퇴르 피펫으로 젤을 사용하여 페트리 접시에서 물을 제거합니다. 캘리퍼로 겔의 직경을 측정하여 팽창을 계산합니다(4배에서 5배 사이).
  2. PBS 10mL로 15분 동안 두 번 세척합니다. 면도날로 젤을 원형 젤 중앙에서 약 10mm x 10mm의 정사각형으로 자릅니다. 테스트할 조건당 하나의 제곱을 사용합니다.
    참고: 겔은 PBS 배양 후에 수축합니다. 겔은 4°C의 PBS에서 최대 1주일 동안 보관할 수 있습니다.
  3. 각 사각형을 12웰 플레이트로 옮기고 2% PBS-소 혈청 알부민(BSA)에 희석된 1차 항체 500μL를 37°C에서 2시간 30분 동안 진탕하면서 배양합니다.
    참고: 대체 항체 배양은 4°C에서 ON으로 수행할 수 있습니다. 사용할 수 있는 최소 항체 부피는 24웰 플레이트에서 300μL입니다. 일반적으로 기존 면역 표지에 사용되는 항체 농도의 두 배를 사용합니다.
  4. 6웰 플레이트에서 흔드는 동안 0.1% 폴리소르베이트 20이 함유된 PBS 2mL로 10분 동안 3회 세척합니다.
  5. 겔을 12-well 플레이트로 옮기고 부드러운 쉐이킹으로 37°C에서 2시간 및 30분 동안 원하는 형광단에 접합된 DAPI 및 10μg/mL NHS-에스테르와 함께 PBS의 2차 항체 500μL로 배양합니다.
    참고: 일반적으로 기존 면역 라벨링에 사용되는 항체 농도의 두 배를 사용하십시오. 또는 이 배양을 4°C에서 ON으로 수행할 수 있습니다.
  6. 6웰 플레이트에서 흔드는 동안 0.1% 폴리소르베이트 20이 함유된 PBS 2mL로 10분 동안 3회 세척합니다.
  7. 젤을 초순수가 담긴 페트리 접시에 옮깁니다. 30분 동안 배양합니다. 6.4단계에서와 같이 일회용 3mL 파스퇴르 피펫으로 물을 두 번 바꿉니다.

8. 이미징 및 이미지 프로세싱 (DAY 3)

  1. 일회용 3mL 파스퇴르 피펫으로 페트리 접시에서 물을 제거하고 캘리퍼로 겔 직경을 측정하여 팽창 계수를 계산합니다.
  2. 면도날로 ~10mm x 10mm의 작은 조각을 잘라 35mm 유리 바닥 접시에 놓습니다.
    참고: 대안으로, 슬라이드와 커버슬립 사이에 젤을 놓습니다(폴리-D-라이신 제외). 슬라이드에는 젤 두께에 대한 챔버를 형성하기 위해 측면에 부착된 다이아몬드 나이프로 절단된 두 개의 작은 슬라이드 조각이 있어야 합니다.
  3. 10배 또는 20배 배율에서 방향을 확인합니다. 제대로 초점을 맞추기 위해서는 기생충이 커버슬립을 향하고 있는지 확인하십시오. 그렇지 않으면 젤을 뒤집어서 다시 확인해야 합니다(그림 2C).
  4. 적절한 방향을 찾으면 현미경 종이로 남은 젤을 건조시킵니다. 폴리-D-라이신으로 코팅된 커버슬립으로 젤을 덮습니다.
  5. 겔에 초순수 한 방울을 떨어뜨려 컨포칼 현미경으로 시각화합니다.
    참고: 적절한 이미징을 보장하려면 표면 근처의 세포를 포함하는 젤의 측면이 끝의 유리 바닥 접시를 향하도록 프로세스 전반에 걸쳐 겔 방향을 유지하는 것이 중요합니다. 35mm 접시를 사용할 때 바닥에 배치된 커버슬립에 폴리-D-라이신을 추가하면 이미지 획득 중 겔 이동을 줄일 수 있습니다.
  6. 이미지 획득 매개변수
    1. 63x Oil Immersion 1.4 NA(numerical aperture) 대물렌즈를 사용하여 컨포칼 현미경(재료 표)에서 샘플을 이미지화합니다.
    2. Z 스택, 각 z 단계의 너비 및 픽셀당 노출 시간을 획득하여 샘플, 신호 강도 및 수집 시간 최적화에 따라 경험적으로 결정됩니다. 원하는 경우 효과적인 확대를 위해 스캔 줌을 사용하십시오.
    3. 이미지 처리 소프트웨어(Table of materials)를 사용하여 Z 스택을 엽니다. 각 채널에 대해 그룹 Z-프로젝트 옵션을 사용하여 스택된 이미지를 그룹화합니다. 최대 강도 투영을 선택합니다.
    4. 이미지를 병합하려면 [채널 병합 ] 도구를 사용하여 각 채널의 색상을 선택합니다. 프로세싱 소프트웨어에서 Scale Bar 도구를 사용하여 스케일 바를 추가합니다.
      참고: 또는 원하는 대로 각 채널을 색칠할 수 있습니다(대표 결과의 예 참조).

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결과

프로토콜이 제대로 실행된 경우(그림 1) 샘플은 물에서 최대 4-4.5배까지 팽창할 수 있는 평면 및 반투명 겔로 표시됩니다(그림 3A). 이 팽창은 약 70nm의 유효 해상도를 제공했으며, 이는 최종 팽창 계수 및 채택된 이미징 시스템에 따라 달라질 수 있습니다. 두 번째 팽창 과정과 컨포칼 현미경에서 이미지 획득 후 약 4.5의 팽창 계수를 관찰할 수 있었습니다. 이 팽창을 정량화하기 위해 7.1단계 전후의 겔을 측정했습니다. 또한, 비확장 및 팽창된 기생충에서 α-튜불린 항체를 가진 후피유종생물을 라벨링했습니다(그림 3B).

항튜불린 항체와 같은 세포골격 마커로 염색할 때, 미세소관의 표피하 코르셋과 편모 축삭에서 이 단백질의 정확한 국소화를 관찰하여 T. cruzi의 3가지 in vitro<...

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토론

초구조 팽창 현미경은 생물학적 샘플을 원래 크기의 몇 배로 물리적으로 확장하여 고해상도 이미지를 얻을 수 있는 기술입니다. U-ExM 프로토콜에는 최적의 결과를 얻기 위해 신중하게 실행해야 하는 몇 가지 중요한 단계가 포함됩니다4. 먼저, 시료를 CP 제제로 고정하고 팽창성 하이드로겔 매트릭스에 삽입해야 합니다. CP 용액에 존재하는 포름알데히드는 아크릴아미드의 자유 공유 결합과 상호 작용하여 샘플과 원치 않는 결합이 형성되는 것을 방지합니다. 이 프로토콜에서는 확장 계수를 줄이므로 CP 단계 전에 셀을 수정하지 않는 것이 좋습니다. 그러나, 막 기반 소기관(membrane-based organelles)과 같은 일부 소기관에는 필요하다15. 때때로 화학적 고정과 관련된 인공물의 형성을 우회하는 대안은 팽창16 전에 샘플의 동결 고정이라는 보...

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공개 사항

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

Vero 세포 배양을 지원해 주신 Dolores Campos와 T. cruzi 배양을 지원해 주신 Romina Manarin에게 감사드립니다. 이 작업은 Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica, 아르헨티나의 Ministerio de Ciencia e Innovación Productiva (PICT2019-0526), Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (PIBAA 1242) 및 Research Council United Kingdom [MR/P027989/1]의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.22마이크로미터 멸균 주사기 필터 PES멤브레인 솔루션SFPES030022S
1L 비커Schott Duran10005227
1.5mL SPINWIN 마이크로 원심분리기 튜브TarsonT38-500010
10mL 일회용 멸균 seryngeNP66-32
10mL 혈청학적 피펫 멸균Jet BiofilGSP211010
12mm 커버 슬립Merienfeld GmbH01 115 20원형 커버 슬립
12웰 플레이트Jet BiofilTCP011012
22mm 커버 슬립Corning2845-22스퀘어 커버 슬립
24웰 플레이트Jet BiofilTCP-011-024
250 mL 비커Schott DuranC108.1
3 mL 파스퇴르 피펫Deltalab200037
35mm 유리 바닥 접시Matsunami 유리 indD11130H
4′,6-Diamidine-2′-phenylindole dihydrochlorideSigma AldrichD9542DAPI
5ml 혈청학 피펫 멸균Jet BiofilGSP010005
6웰 플레이트Sarstedt83.3920
AcrilamideBioRad1610101
Ammonium persulfateSigma AldrichA3678-25GAPS
ATTO 647 NHS 에스테르BOC SciencesF10-0107팬 프로테옴 라벨링
Biosafty 캐비닛TelstarBio II A / P
소 나트륨 알부민시그마 AldrichA7906BSA
CO2 인큐베이터SanyoMCO-15A
컨포칼 현미경ZeissLSM 880
일회용 PetridishTarsons460095직경 90mm
DMEM, 고포도Thermo Fisher Cientific12100046Powder
전자 디지털 캘리퍼스레이더RADAR-SLIDE-CALIPER
에탄올 절대Supelco1,00,98,31,000
태아 송아지 혈청Internegocios SAFCS FRA 500멸균 및 열 비활성화
피지 이미지 처리 패키지ImageJdoi:10.1038/nmeth.2019
포름알데히드 37%Sigma AldrichF8775FA
유리 페트리 디쉬Marienfeld SuperiorPM-340030060mm 직경
포도당 D(+)Cicarelli
글루타르알데히드 70%Sigma AldrichG7776
염소 항 마우스 IgG 2차 항체 Alexa Fluor 555InvitrogenA-21422
염소 항 토끼 IgG 2차 항체 FICTJackson Immunoresearch115-095-003
눈금 실린더Nalgene3663-1000
눈금 유리 플라스크GlasscoGL-274.202.01100mL
가열 블록IBR사내 제작
HeminFrontier ScientificH651-9
염산 36.8-38.0%Ciccarelli918110
얼음 양동이Corning1167U68
인큐베이터Tecno DalvoTOC130
간 주입Difco226920
자기 교반기 및 히터실험실 동반자HP-3000
금속 주걱SALTTECH200MM
금속 핀셋Marienfeld SuperiorPM-6633002
메탄올 절대Cicarelli897110
마이크로 원심분리기 튜브 1.5mLTarson500010-N
현미경 등급 종이 KimWipesKimtech ScienceB0013HT2QW
Milli-Q 물 sistemMerk MilliporeIQ-7003
마우스 안티 알파 튜불린 클론 DM1ASigma AldrichT9026
마우스 안티 PFR정제 항체Ariel Silber 박사가 기증 (USP)
N, N´-methylenbisacrilamideICN193997BIS (바이)
Na2HPO4Cicarelli834214
Neubauer 챔버BoecoBOE 01
p1000 피펫GilsonPIPETMAN P1000
p1000 피펫 팁TarsonTAR-521020B
p20 피펫GilsonPIPETMAN P20
p20 피펫 팁TarsonTAR-527108
p200 피펫GilsonPIPETMAN P200
p200 피펫 팁TarsonTAR-521010Y
파라포름알데히드시그마 AldrichP6148PFA
pH / ORP / ° C 미터HANNA InstrumentsHI 2211
Poly-D-Lysine 0.1%Sigma AldrichP8920
염화칼Cicarelli867212KCl
면도날PrintexBS 2982:1992
씰링 필름 "Parafilm M"BemisPM996
아크린산 나트륨시그마 Aldrich408220-25GSA
중탄산나트륨시카렐리929211NaHCO3
Sodium ChlorideCicarelli750214NaCl
Sodium Dodecyl SulfateBioRad1610302SDS
Sodium HidroxideMerk1-06498NaOH
Sorvall ST 16 CentrifugeThermo Fisher Scientific75004380
T-25 플라스크Corning430639
TEMEDInvitrogen15524-010
티슈 페이퍼Elite
TriptoseMerck1106760500
TrisBioRad1610719
Tween-20Biopack2003-07Polysorbate 20
진공 펌프SilfabN33-A
베로 셀ATCCCRL-1587
와류 믹서드래곤 랩MX-S
당 716214륨

참고문헌

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  3. Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
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