방법 논문

라인 스캐닝 진동 합계-주파수 생성 현미경을 사용한 다중 모드 비선형 초분광 화학 이미징

DOI:

10.3791/65388

⸱

2023년 12월 1일

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, UC San Diego, 2State Key Laboratory of Molecular Reaction Dynamics, Dalian Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences, 3Materials Science and Engineering Program, UC San Diego, 4Department of Electrical and Computer Engineering, UC San Diego

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

명시야, 2차 고조파 생성(SHG) 이미징 방식과 함께 광대역 진동 합-주파수 생성(VSFG) 이미지를 얻기 위해 다중 모드의 빠른 초분광 이미징 프레임워크가 개발되었습니다. 적외선 주파수가 분자 진동과 공명하기 때문에 대칭 허용 샘플에 대한 미세한 구조 및 중경 형태 지식이 드러납니다.

초록

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2차 비선형 광학 신호인 VSFG(Vibrational Sum-Frequency Generation)는 전통적으로 ~100μm의 공간 분해능을 가진 분광학 기술로 계면에서 분자를 연구하는 데 사용되었습니다. 그러나 분광법은 샘플의 이질성에 민감하지 않습니다. 메조스코프적으로 이질적인 샘플을 연구하기 위해 우리는 다른 사람들과 함께 VSFG 분광법의 해상도 한계를 ~1μm 수준으로 낮추고 VSFG 현미경을 구성했습니다. 이 이미징 기술은 이미징을 통해 샘플 형태를 분석할 수 있을 뿐만 아니라 이미지의 모든 픽셀에서 광대역 VSFG 스펙트럼을 기록할 수 있습니다. 2차 비선형 광학 기술인 이 선택 규칙은 생물학, 재료 과학 및 생명 공학 등에서 흔히 볼 수 있는 비중심대칭 또는 키랄 자체 조립 구조를 시각화할 수 있습니다. 이 기사에서 청중은 고정되지 않은 샘플을 이미징할 수 있는 반전된 투과 설계를 안내합니다. 이 연구는 또한 VSFG 현미경이 신경망 함수 솔버와 결합하여 개별 자체 조립 시트의 화학 물질별 기하학적 정보를 해결할 수 있음을 보여줍니다. 마지막으로, 다양한 샘플의 명시야, SHG 및 VSFG 구성에서 얻은 이미지는 VSFG 이미징에서 드러나는 고유한 정보에 대해 간략하게 설명합니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

2차 비선형 광학 기법1,2인 VSFG(Vibrational Sum-Frequency Generation)는 대칭 허용 시료 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13, 14,15,16,17,18,19,20,21,22입니다. 전통적으로 VSFG는 VSFG 활성의 요구 사항인 반전 대칭이 없는 계면 시스템 8,9,10,11(즉, 기체-액체, 액체-액체, 기체-고체, 고체-액체)에 적용되었습니다. VSFG의 이러한 응용은 매몰된 계면(12,13), 계면(14,15,16,17,18)에서의 물 분자의 구성, 및 계면(19,20,21,22)에서의 화학 종의 풍부한 분자 세부 정보를 제공하였다.

VSFG는 계면에서 분자 종과 구성을 결정하는 데 강력했지만 반전 중심이 없는 물질의 분자 구조를 측정하는 데 있어 그 잠재력은 충족되지 않았습니다. 이는 부분적으로 재료가 화학적 환경, 조성 및 기하학적 배열에서 이질적일 수 있고 기존 VSFG 분광기는 약 100μm2의 넓은 조명 영역을 갖기 때문입니다. 따라서 기존의 VSFG 분광법은 일반적인 100μm2 조명 영역에서 샘플의 앙상블 평균 정보를 보고합니다. 이러한 앙상블 평균화는 방향이 반대되는 잘 정렬된 영역 간의 신호 상쇄 및 국소 이질성의 오특성화(mischaracterization)를 유발할 수 있다 15,20,23,24.

높은 개구수(NA), 색수차가 거의 없는 반사 기반 현미경 대물렌즈(Schwarzschild 및 Cassegrain 형상)의 발전으로 VSFG 실험에서 두 빔의 초점 크기를 100μm2에서 1-2μm2로, 경우에 따라 서브미크론25로 줄일 수 있습니다. 이러한 기술 발전을 포함하여 당사 그룹 및 기타 업체는 VSFG를 현미경 플랫폼 20,23,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36으로 개발했습니다. 최근에는 반전된 광학 레이아웃 및 광대역 검출 방식(37)을 구현하여 멀티모달 이미지(VSFG, 2차 고조파 생성(SHG) 및 명시야 광학)을 원활하게 수집할 수 있습니다. 멀티 모달리티 이미징을 통해 광학 이미징을 사용하여 샘플을 빠르게 검사하고, 다양한 유형의 이미지를 상호 연관시키고, 샘플 이미지에서 신호 위치를 찾을 수 있습니다. 무채색 조명 광학 장치와 펄스 레이저 광원 선택을 통해 이 광학 플랫폼을 사용하면 형광 현미경38 및 라만 현미경과 같은 추가 기술을 향후 원활하게 통합할 수 있습니다.

이 새로운 배열에서는 계층적 조직 및 분자 자체 조립체(MSA) 클래스와 같은 샘플이 연구되었습니다. 이러한 재료에는 콜라겐과 생체 모방이 포함되며, 화학 조성과 기하학적 구성은 재료의 궁극적인 기능에 중요합니다. VSFG는 2차 비선형 광 신호이기 때문에 분자간 거리 또는 비틀림 각도와 같은 분자간 배열39,40에 특히 민감하여 화학 조성과 분자 배열을 모두 밝히는 데 이상적인 도구입니다. 이 연구는 광학 파라메트릭 증폭기(OPA)를 펌핑하는 이테르븀 도핑된 캐비티 고체 레이저, 2차원 하전 결합 장치(CCD) 검출기(27)에 결합된 자체 제작 멀티모달 도립 현미경 및 모노크로메이터 주파수 분석기로 구성된 핵심 기기의 VSFG, SHG 및 명시야 양식에 대해 설명합니다. 단계별 구성 및 정렬 절차와 설정의 전체 부품 목록이 제공됩니다. 기본 분자 소단위가 일반적인 계면활성제인 소듐-도데실 설페이트(SDS) 분자 1개와 본원에서 SDS@2 β-CD로 알려진 β-사이클로덱스트린(β-CD) 분자 2개로 구성된 MSA에 대한 심층 분석도 VSFG가 조직 물질의 분자 특이적 기하학적 세부 사항을 밝힐 수 있는 방법을 보여주는 예로 제공됩니다. 또한 MSA의 화학적 특이적 기하학적 세부 사항은 신경망 함수 솔버 접근 방식으로 결정할 수 있음이 입증되었습니다.

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프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 초분광 라인 스캐닝 VSFG 현미경

  1. 레이저 시스템
    1. 1025nm ± 5nm를 중심으로 하는 펄스 레이저 시스템( 재료 표 참조)을 사용하십시오. 레이저는 ~290fs의 펄스 폭으로 40W, 200kHz(200μJ/펄스)로 설정됩니다.
      알림: 정확한 반복률은 다를 수 있으며 일반적으로 이 VSFG 현미경에는 반복률이 높은 레이저가 더 잘 작동합니다.
    2. 시드 레이저의 출력을 상용 OPA(Optical Parametric Amplifier)로 안내하여 중적외선(MIR) 빔을 생성합니다( 재료 표 참조). MIR을 관심 주파수에 맞게 조정합니다(그림 1A).
      참고: 본 연구에서 MIR은 3450nm ± 85nm(~2900 ± 72cm-1)에 중심을 두고 있으며 펄스 지속 시간은 ~290fs이고 펄스 에너지는 ~6μJ이며 -CHx 작용기 영역의 일부를 포함합니다.
  2. 상향 변환 빔
    1. OPA의 잔류 1025nm 빔을 Fabry-Perot 에탈론(재료 표 참조)을 통과시켜 FWHM이 ~4.75cm-1인 스펙트럼적으로 좁아진 상향 변환 빔을 생성합니다.
    2. 8μm 사파이어 핀홀로 좁아진 1025nm 빔을 공간적으로 필터링합니다.
      참고: 1025nm 빔은 NIR 카드를 사용하여 시각화할 수 있습니다.
    3. λ/2 waveplate로 1025nm 펄스의 편광을 제어합니다( 재료 표 참조).
  3. MIR 빔
    1. 시간적 중첩을 미세 제어하기 위해 지연 단계를 통해 MIR 빔을 안내합니다.
    2. λ/2 waveplate로 MIR의 편광을 제어합니다.
  4. VSFG 현미경
    1. MIR에는 투과하고 NIR에는 반사되는 맞춤형 이색성 거울(DM, 그림 1B)에서 상향 변환 및 MIR 빔을 공간적으로 중첩합니다( 재료 표 참조). 두 개의 홍채를 사용하여 정렬을 안내합니다: 하나는 DM 바로 뒤에, 다른 하나는 맨 끝에 있습니다. 조리개 뒤에 파워 미터를 사용하여 MIR이 중앙에 있는지 확인하고 NIR 카드를 사용하여 NIR 위치를 찾습니다.
      참고: 겹침 후 NIR 빔을 사용하여 두 빔을 모두 안내할 수 있습니다.
    2. 통합 325Hz 단축 공진 빔 스캐너(통합 2위치 스캐너(I2PS)에 장착됨, 그림 1B)가 있는 도립 현미경으로 겹친 빔을 보냅니다( 재료 표 참조).
      알림: 공진 스캐너는 콘덴서 대물렌즈의 후면 조리개에 두 개의 겹쳐진 빔 라인을 투사합니다. 슬라이더에 장착되어 VSFG/SHG와 명시야 기법 간의 원활한 재구성이 가능합니다.
    3. 공간적으로 겹쳐진 두 개의 빔을 순수 반사 Schwarzschild 대물렌즈(SO, 그림 1B,D)를 사용하여 샘플에 초점을 맞춥니다(재료 표 참조).
    4. 무한 보정 굴절 대물렌즈(RO, 그림 1B,D)를 사용하여 샘플에서 생성된 VSFG 신호를 수집합니다(재료 표 참조).
    5. 시준된 출력 VSFG 신호를 선형 편광판을 통과한 다음 두 개의 f = 60mm 초점 렌즈(TL1 및 TL2, 그림 1B,C)로 구성된 telecentric tube lens 시스템을 통과시킵니다(재료 표 참조).
      NOTE: 튜브 렌즈의 확대 이미지는 모노크로메이터의 입구 슬릿(MC, 그림 1B,C)에 형성되며, 공간/주파수 분해 데이터는 2차원 CCD 검출기(CCD, 그림 1B)에서 감지됩니다.
  5. SHG 모드
    1. SHG 이미징으로 전환하려면 IR 빔을 차단하고 분광기의 격자를 501.5nm로 회전하여 SHG 신호를 이미지화합니다.
  6. 명시야 모드
    1. 명시야 광학 이미징으로 전환하려면 백색광 광원을 켜십시오( 재료 표 참조). 통합 슬라이더(I2PS, 그림 1B)를 움직여 역전파 방향으로 명시야 이미지를 수집하고, 이미징 대물렌즈(RO)는 콘덴서 역할을 하고 콘덴서 대물렌즈(SO)는 이미징 대물렌즈 역할을 합니다.
    2. 시중에서 판매되는 튜브 렌즈 시스템을 사용하여 RGB 명시야 카메라의 센서 평면에서 굴절 대물렌즈의 시준 출력 이미지를 형성합니다( 재료 표 참조).

figure-protocol-1
그림 1: 다중 모드 초분광 VSFG 현미경. (ᅡ) 코어 설정의 평면도입니다. 1025nm 펌프 레이저를 OPA로 보내 조정 가능한 mid-IR 펄스를 생성했습니다. 잔류 1025nm는 에탈론(E)에 의해 좁아지는 경우가 많았고 공간 필터(SFG)에 의해 가우스 빔으로 공간적으로 필터링되었습니다. Mid-IR 및 1025nm 빔은 맞춤형 이색성 거울(DM)에서 공간적으로 중첩되고 도립 현미경( A의 박스 영역)을 통해 안내됩니다. (B) 두 개의 빔은 통합 2위치 슬라이더(I2PS)에 장착된 325Hz 공진 빔 스캐너로 전송되어 명시야와 비선형 광학 기법 간의 원활한 전환이 가능합니다. 현미경 플랫폼에는 콘덴서 역할을 하는 반사 기반 무한 보정 슈바르츠실트 대물렌즈(SO)와 수직 나노포지셔닝(VNP) Z축 스테이지에 장착된 굴절 기반 무한 보정 이미징 대물렌즈(RO)가 장착되어 있습니다. SO는 RO가 신호의 VSFG 라인 섹션을 수집하는 동안 공진 빔 스캐너가 샘플에 반사하는 들어오는 빔 라인에 초점을 맞춥니다. 샘플이 고품질 이미징을 위한 최상의 초점 조건에 있도록 RO의 z축 위치를 1μm 정밀도로 미세 제어하는 것이 중요합니다. 그런 다음 VSFG 신호의 시준된 라인은 2개의 tub lens(TL1 및 TL2)로 구성된 tube lens system으로 전달되어 모노크로메이터(MC)의 입구 슬릿에서 확대된 이미지를 형성합니다. 그런 다음 주파수 분해 스펙트럼 라인은 CCD(Charge-Coupled Device)에서 초분광으로 이미지화됩니다. 각 초분광 라인을 수집한 후 NP를 사용하여 공진 빔 스캐너 스캐닝 축에 수직인 축에서 샘플을 스캔합니다. 샘플의 명시야 이미지를 수집하기 위해 I2PS를 명시야 위치로 이동하고 백색 광원(WLS)을 차단하는 미러를 설치합니다. 그런 다음 빛은 RO에 의해 초점이 맞춰지고 SO에 의해 이미징됩니다. 그런 다음 도립 현미경 상단에 있는 명시야 카메라(BC)의 센서 평면에 이미지가 형성됩니다. (C) 튜브 렌즈 영역을 통해 MC 및 CCD로 들어가는 광학 경로의 상세 보기. (D) SO와 RO 사이의 샘플 영역에 대한 자세한 보기. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2. 초분광 현미경 정렬 및 수직 CCD 축 공간 보정

  1. 15mm x 15mm x 0.170mm ± 0.005mm 커버슬립으로 코팅된 ZnO(1μm 두께) 패턴 스퍼터링의 표준 샘플을 사용하여 샘플 평면(나노 포지셔너 Z축)의 위치를 대략적으로 최적화하고 명시야 이미징 방식을 사용하여 명시야 초점으로 가져옵니다.
    알림: RO의 z 위치와 백색광의 정렬은 필요에 따라 조정해야 할 수 있습니다. 정렬 보정에 사용되는 유리 패턴의 ZnO의 대표 이미지가 그림 2에 나와 있습니다.
  2. I2PS를 다시 비선형 조명 암으로 이동하고 CCD 카메라에서 관찰된 ZnO 영역에 의해 생성된 최대 비공진 VSFG 강도에 대해 샘플 높이를 최적화합니다.
    알림: RO의 z 위치는 최대 강도를 위해 조정해야 합니다. 샘플의 최적 높이와 RO에 도달하기 전에 2.1 및 2.2 단계를 몇 번 반복해야 할 수도 있습니다.
  3. 공진 빔 스캐너를 켜고 이미지 라인을 수집합니다.
  4. 빔 스캐너 방향에 수직으로 샘플을 스캔하여 비공진 강도 이미지를 수집합니다. 이미지 데이터의 세로 슬라이스를 가져와서 픽셀:미크론 비율을 설정합니다. ( 그림 3 및 범례 참조).
    참고: 이러한 선 섹션의 도함수를 분석하여 향후 이미지에 사용할 수직 CCD 축 픽셀:미크론 비율을 생성합니다.

figure-protocol-2
그림 2: ZnO 패턴의 명시야 이미징 양식의 대략적인 정렬에 대한 대표적인 이미지 품질. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-protocol-3
그림 3: 수직 축 보정 작업 흐름. 이 그림은 CCD 픽셀을 μm 단위의 수직 공간 차원으로 변환하는 방법을 보여줍니다. (A) ZnO 패턴 커버슬립의 이미지를 수집하고 재구성합니다. 그런 다음 패턴의 한 가장자리에서 다른 가장자리까지의 픽셀 거리( A의 작은 세로 막대)입니다. ZnO 패턴 크로스는 25μm 너비를 갖도록 설계되었기 때문에 여기에서 물리적 너비 대 픽셀 너비의 비율을 사용하여 물리적/픽셀 치수 비율을 계산할 수 있습니다. 대표적인 수직 축 보정 이미지가 (B)에 나와 있습니다. (C) 마지막으로 빨간색 선으로 표시된 대로 수직 슬라이스를 취합니다. (D) 공간 분해능을 얻기 위해 수직 슬라이스의 도함수를 취합니다. 수직 슬라이스의 도함수는 공간 분해능을 얻는 데 사용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

3. 초분광 데이터 수집

  1. 스펙트럼이 수평 축을 따라 분산되고 공간 위치가 CCD의 수직 축에 기록되는 CCD에서 VSFG 신호의 수직선 스펙트럼을 수집합니다.
    참고: 이렇게 하면 한 줄 섹션에 대한 2차원 데이터 집합이 생성됩니다.
  2. 샘플의 라인 섹션을 초분광 이미지화한 후 3차원 나노 포지셔너를 사용하여 라인 스캐닝 축에 수직인 축의 샘플을 스캔합니다(NP, 그림 1).
    참고: 3D 나노 포지셔너는 샘플 영역(x-y 평면)을 찾고 샘플에 초점을 맞추는(z축) 높은 정밀도와 재현성을 위해 중요합니다.
  3. 3.1단계와 3.2단계를 반복하여 VSFG 초분광 이미지를 수집합니다.

4. 초분광 데이터 분석

  1. MatLab imaging toolbox 초분광 이미징 라이브러리 워크플로41을 사용하여 데이터를 스펙트럼 추출합니다.
    참고: 스펙트럼 불혼합은 공간 위치를 고유한 스펙트럼과 연관시킵니다. 초분광 데이터 분석을 위한 Matlab 코드는 보충 파일 1에 나와 있습니다.
    1. Matlab Image Processing Toolbox 초분광 이미징 라이브러리41의 hypercube 함수를 사용하여 4차원 하이퍼큐브(x = 공간, y = 공간, z = 주파수 종속 강도, ω = 주파수)를 만듭니다.
    2. PFA(Probability of False Alarm) 값이 10-7인 countEndmembersHFC 함수를 사용하여 고유한 스펙트럼의 개수를 식별합니다.
    3. nfindr 스펙트럼 혼합 해제 기능을 사용하여 고유한 스펙트럼을 식별합니다.
    4. 마지막으로, sid 함수를 사용하여 각 픽셀을 이전 단계에서 식별된 고유한 스펙트럼 중 하나와 연결합니다.
      참고: 추가적인 스펙트럼 언믹싱 및 매칭 방법은 MatLab Hyperspectral Imaging Library41에서 제공되는 대체 함수/알고리즘을 사용하여 수행할 수 있습니다.
  2. 각각의 분리된 시트에 대한 합 데이터를 Voigt 함수42(보충 파일 1)에 맞춥니다.
    참고 : 로렌츠 함수는 순수 균질 선 모양 한계를 나타내는 반면 가우스 함수는 불균일 한 한계에서 비롯됩니다. 실제로 시스템은 균질 및 비균질 한계의 조합에 있을 수 있으며, 이를 위해서는 VSFG를 포함한 응축 위상 분광법의 일반적인 관행인 Voigt 기능이 필요합니다.

5. 시료의 기하학적 분석

  1. 5.2-5.3단계에서 언급한 절차에 따라 샘플의 형상을 결정합니다. 본 연구에서는 SDS@2 β-CD를 예로 들었다. SDS@2 β-CD 메조 시트 샘플의 분자 소단위의 C7 대칭을 기반으로 χ(2)의 대칭 허용 텐서 요소를 도출합니다.
    참고: 허용되는 대칭 χ(2) 는 대칭에 따라 다릅니다. 대칭에 대해 허용되는 비선형 민감도를 계산하려면 참조43을 참조하십시오.
  2. 오일러 회전27 을 적용하여 실험실 프레임 측정값을 분자 프레임과 연결합니다.
    참고: SDS@2 β-CD의 경우 C7 대칭은 8개의 출력(실험실 프레임 χ(2))과 8개의 입력(6개의 독립적인 과분극성 β(2) 및 두 개의 각도: Θ, 모든 시트의 샘플 평면에 대한 기울기 각도 및 φ, 시트의 면내 회전(그림 4))과 관련된 8개의 독립 방정식으로 이어집니다. 두 시트는 두 시트의 공통 분자 정렬을 추출하는 데 사용됩니다. φ1과 φ2 사이의 관계(두 시트의 평면 내 회전 각도)는 명시야 이미지에서 추출할 수 있습니다. 현재 예에서는φ 2 = φ1 + 60°입니다. 모든 분자 단위가 같은 각도로 타일링된다고 가정하므로 Θ1 = Θ2. 그 결과 16개의 알려진 것(시트당 8개의 실험실 프레임 편광 및 2장)에 대해 11개의 미지수(6개의 독립적인 과분극성 β(2), Θ 1 및 φ1을 포함한 9개의 독립적인 것, 시트 N과 φ 2인 두 종속 각도 간의 상대적 커버리지 비율( 2 및 Θ2)이 발생합니다.
  3. 편광 분해 실험실 프레임 χ(2)와 분자 프레임 과분극성 β(2)를 신경망 함수 솔버와 연관시킵니다.
    참고: 이 접근 방식에 대한 자세한 요약은 참조27에서 찾을 수 있습니다.
    1. 200-100-50 노드 구조와 쌍곡선 탄젠트 활성화 함수로 구성된 Keras를 사용하여 Python44에서 계층화된 신경망 모델을 만듭니다.
    2. β(2), Θ 1, Θ 2, φ1, φ 2 및 N 값으로 구성된 무작위로 생성된 100000 x 11 행렬을 만듭니다. 오일러 회전에 의해 5.2에서 결정된 방정식을 사용하여 해당 실험실 프레임 16 χ(2)를 계산합니다.
    3. 계산된 χ(2) 값(총 100,000 x 16개 값)을 입력값으로 사용하고 16개의 χ(2) 값이 제공될 때 11개의 값(β(2), Θ 1, Θ 2, φ1, φ 2 및 N)을예측하는 방법을 배웁니다.
    4. 학습이 완료되면 입력과 출력이 모두 포함된 다른 1,000개 항목 집합을 사용하여 학습된 모델을 테스트합니다. 예측된 출력과 실제 출력은 기울기가 1인 선형 관계를 보여야 합니다.
    5. 마지막으로, 두 개의 시트(각 시트에는 8개의 χ(2)가 측정됨)에서 실험적으로 측정된 χ(2)를 제공하고 훈련된 모델을 사용하여 다른 속성과 함께 기울기 각도 Θ를 예측합니다.

figure-protocol-4
그림 4: 오일러 변환 그림. (A)ijk에 β 실험실 좌표(XYZ) 2차 감수성 χ(2)와 분자 좌표(XYZ) 과분극성 사이의 오일러 변환 그림. z-y'-z'' 오일러 회전은 분자 좌표에서 수행되며 φ는 평면 회전 각도, θ는 기울기 각도, ψ는 비틀림 각도입니다. ψ는 분자 축에 대한 임의의 비틀림 각도를 위해 통합됩니다. 모든 분자가 실험실 프레임에 대해 특정 각도로 회전하여 자체 조립 시트를 형성하기 때문에 φ 통합되지 않습니다. N은 두 시트의 상대적 표면 커버리지입니다. (B) 신경망 결과에 의해 결정된 시트를 형성하는 기울어진 소단위의 시각화. 이 그림은 Wagner et al.27에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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결과

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그림 5: SDS@β-CD의 분자 구조, 형태 및 전위 방향. (A) 평면도 및 (B) SDS@β-CD의 측면도 화학 구조. (C) 샘플 평면에서 중간 규모 시트의 대표적인 이종 샘플 분포. 분자 소단위체는 기질에서 다른 방향과 정렬을 가질 수 있으며, 이는 알려져 있지 않습니다. 이 그림은 Wagner et al.27에서 수정되었습니다.

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토론

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가장 중요한 단계는 1.42에서 1.44까지입니다. 광학 공간 해상도를 위해 대물 렌즈를 잘 정렬하는 것이 중요합니다. 방출된 신호를 수집하고, 릴레이하고, 스캐닝 빔을 입구 슬릿에 선으로 투사하는 것도 중요합니다. 적절한 정렬은 최상의 해상도와 신호 대 잡음비를 보장합니다. SDS@2 β-CD 100μm x 100μm 시트와 같은 일반적인 샘플의 경우 신호 대 노이즈 비율이 높은 양호한 해상도 이미지(~1μm 해상도)를 만드는 데 20분이 걸립니다. 이것은 이미 이전 버전의 기기24,26보다 빠릅니다. 데이터 수집 속도의 추가 향상은 더 높은 반복률 레이저로 실현할 수 있습니다.

현재의 한계는 공간 분해능이며, 이는 훨씬 더 높은 NA 대물렌즈 광학 및 잠재적인 비선형 광학 기반 초-해상도 기술(45)에 의해 더욱 개선될 수 있다....

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

기기 개발은 Grant NSF CHE-1828666의 지원을 받습니다. ZW, JCW 및 WX는 미국 국립보건원(National Institutes of Health), 국립종합의학연구소(National Institute of General Medical Sciences), 보조금 1R35GM138092-01의 지원을 받습니다. BY는 중국과학원(CAS, 2021183)의 청년혁신추진협회의 지원을 받습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
카메라를 현미경 또는 광학 시스템에 연결하는1x Camera PorThorlabsWFA4100
25.0mm 직각 프리즘 미러, 보호된 금ThorlabsMRA25-M01빛을 반사하고 재귀반사를 생성하여 빛을 원래 경로를 따라 3
인치 이내로 되돌립니다. Universal Post Holder-5 PackThorlabsUPH3-P5다양한 크기와 구성의 포스트를 고정하고 지지
합니다 30mm에서 60mm 케이지 플레이트, 4mm 두께ThorlabsLCP4S는 30mm 케이지 시스템과 60mm 케이지 시스템 사이를 변환합니다.
Thorlabs가 있는 500mm 높이의 Cerna Body현미경 검사
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60mm 케이지 장착 브래킷ThorlabsLCP01B는 광학 설정에서 60mm 케이지 시스템을 장착하고 배치합니다
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케이지 플레이트 마운팅 브라켓ThorlabsKCB2정확한 각도로 미러를 잡고 조정합니다.
CCDAndor TechnologiesNewton 주파수 및 공간 분해능을 위한 2D CCD
동일 선상 광학 파라 메트릭 증폭기광 변환Orpheus-One-HP조정 가능한 MID 광 발생기
염화구리Thermo Fischer ScientificA16064.30자체 조립 구성 요소
맞춤형 이색성 거울NewportCustomized는 파장 또는 편광에 따라 빛을 선택적으로 반사 또는 투과
M32 Int 어댑터Thorlabs로SM1A34호환성을 제공하고 나사산 유형이 다른 구성 요소 간의 연결을 용이하게 합니다:
Infinity Corrected Refractive ObjectiveZeiss420150-9900-000굴절 Objective
Infinity Corrected Schwarzschild ObjectivePike Technologies, Inc.891-0007반사 대물
레이저카바이드, 광 변환C18212레이저 소스
M32x0.75 외부에서 내부 RMSThorlabs현미경 대물렌즈의 나사 크기 또는 유형을 조정하거나 변환할 M32RMSS 있습니다 
M32x0.75 외부를 M27x0.75 내부 조각ThorlabsM32M27S현미경 대렌즈 또는 나사 크기를 조정하거나 변환할 수 있습니다.
수동 중간 높이 콘덴서 초점 모듈Thorlabs는광학 요소의 초점을 조정할
ZFM1030 있습니다. MonochromatorAndor TechnologiesShamrock 500i는 각 라인 스캔에 대한 주파수 해상도를 제공합니다
가장자리에 장착된 팔을 위한 1" 트래블의 전동 모듈Thorlabs
Nanopositioner 시티 랩스 Inc.MMP33D 샘플 스테이지
공진 스캐너EOPCSC-25325Hz 공진 빔 스캐너
RGB 컬러 CCD 카메라ThorlabsDCU224C명시야 카메라, 단종되었지만 다른 카메라도 잘 작동합니다
RGB 튜브 렌즈ThorlabsITL200백색광 컬렉션
직각 운동학 브레드 보드ThorlabsOPX2400두 개의 고정 위치가 있는 슬라이딩 메커니즘 통합
직각 Kinematic Mirror 마운트, 30mmThorlabsKCB1정확한 각도로 미러를 고정 및 조정
직각 Kinematic Mirror 마운트, 60mmThorlabsKCB2정확한 각도로 미러 유지 및 조정
SM2, Cerna Focusing Stage Thorlabs를 위한 60mm 케이지 암CSA2100콘덴서를 안전하게 장착하고 배치합니다.
60mm 케이지용 스냅 온 케이지 커버, 24인치 길이,ThorlabsC60L24케이지 내부의 구성 요소를 밀폐하고 보호합니다
AK자체 조립 구성 요소
1" Cerna 여행 스테이지용 Three-Chnnale 컨트롤러 및 노브 박스ThorlabsMCM3001제어 ZFM2020
튜브 렌즈ThorlabsLA1380-AB - N-BK7SFG 신호 수집
가시 LED 세트Thorlabs이미징설정에서 조명을 제공하는
Whitelight SourceThorlabsWFA1010명시야 이미징을 위한 백색광 광원
WPH05M-1030 - Ø 1/2" 제로-오더 반파장 플레이트, Ø 1" 마운트, 1030 nm ThorlabsWPH05M-1030은 통과하는 빛의 편광 상태를 변경합니다
WPLQ05M-3500 - Ø 1/2" 장착 저차 쿼터웨이브 플레이트, 3.5 &마이크로; 엠 ThorlabsWPLQ05M-3500통과하는 빛의 편광 상태를 변경합니다.
X축 Long Travel Steel Extended Contact Slide StagesOptosigmaTSD-65122CUU수평 (X) 방향으로 확장된 이동을 제공하는 포지셔닝 스테이지
XT95 4in Rail CarrierThorlabs는광학 구성 요소를 장착하고 배치할XT95RC4
X-Y 축 변환 스테이지(360도 회전)ThorlabsXYR12차원에서 물체의 정확한 이동 및 위치 지정,
중앙 SM1 스루 홀로 플랫폼 XY(1/2") 선형 변환기ThorlabsXYT12차원에서 정확한 이동 및 위치 지정을 제공합니다
Yb 도핑 솔리드 스테이트 레이저광 변환CB3-40W시드 레이저
&베타;-CyclodextrinThermo Fischer ScientificJ63161.22자체 조립 구성 요소
은 는 의 Epi Arm 는 . Air는 합니다. 확장는 , 는 .는 이미징 목표 Mad의 수직 위치를 제어할 ZFM2020 있습니다.은 는 는 .WFA1010은 회전 기능 은 .

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