생물학적 표준을 사용한 연구의 재현성 및 조화: 혈소판 작용제 콜라겐 관련 펩타이드의 예

우리 중 많은 사람들이 실험에서 생물학적 작용제와 길항제를 사용하며, 특정 조건에서 세포 기능에 미치는 영향을 정량화하는 생물학적 분석에서 가장 자주 사용합니다. 여기에 설명된 방법은 혈소판을 활성화하고 다양한 분석(광 투과 응집법, 현미경, 유세포 분석, Ca²⁺ 방출 등)에서 활성을 측정할 수 있는 당단백질 VI 작용제인 혈소판 작용제 콜라겐 관련 펩타이드(CRP-XL)에 대한 것이지만, 작용제 표준화 프로토콜은 모든 생물학적 작용제/길항제 및/또는 생물학적 검정에 적용할 수 있습니다. 물리학은 일상 업무 관행에서 표준물질의 사용에 정통하며, 상업 부문에서 바이오치료제를 개발하는 회사들은 참조 표준물질¹ 사용의 가치를 이해하고 있지만, 많은 생물학 과학자들, 특히 학술 연구 커뮤니티에서 표준물질의 활용도가 낮으며, 표준물질의 사용 부족은 과학적 결과물의 질에 부정적인 영향을 미친다.

CRP-XL은 1995년² 이후 혈소판 분야에서 수십 년 동안 사용되어 온 특정 GPVI 특이적 작용제로, ^3,4 이후 커뮤니티에서 GPVI의 역할을 다른 콜라겐 결합 혈소판 단백질의 역할과 구분하는 데 도움이 됩니다. 이 작용제는 다양한 상업적 출처에서 조달하거나 사내에서 생산할 수 있습니다. 펩타이드 단량체는 공급업체로부터 구매한 후 사내에서 가교하거나 공급업체가 추가 비용을 지불하고 가교할 수 있습니다. 배송 시 필요한 순도를 줄임으로써 비용을 추가로 절감할 수 있습니다(예: 70% 대 95%). 또한 CRP-XL을 보관하는 방법에 대한 합의가 이루어지지 않았으며, 일부는 냉동 보관을 선택하고 일부는 사용할 때까지 재료를 동결 건조하여 보관하고 다른 일부는 용액(선호도에 따라 물 또는 완충액)에 보관합니다. 따라서 실험실 스톡의 품질과 구성은 표준화되지 않았거나 조화를 이루지 못했습니다. 이 작용제는 활성 단위가 아닌 정의된 농도(질량/부피)로 사용되기 때문에 한 실험실에서 CRP-XL의 효능(예: 1μg/mL)은 다른 실험실과 동일하지 않습니다. 현장에서 사용되는 다른 혈소판 작용제는 이미 표준화되어 있으므로(예: 트롬빈은 질량/부피가 아닌 활동 단위로 공급 및 사용됨) 질량/부피에서 생물학적 단위로의 이동이 커뮤니티에 너무 어렵지 않아야 합니다. 또한 CRP-XL을 포함한 혈소판 작용제에 대한 환자의 반응은 작용제에 대한 민감도와 반응 능력(반응 정도) 측면에서 다양하므로⁵ 분석에서 일관된 양의 작용제 활성을 사용하는 것이 훨씬 더 중요합니다.

혈소판 작용제를 중량/부피가 아닌 정의된 활성으로 사용하여 조화시킬 수 있다면 한 실험실의 실험을 다른 실험실의 실험과 직접 비교할 수 있고 자신 있게 정확하게 재현할 수 있습니다. 현장에서 CRP-XL 활동을 저장하고 표준화하는 방법에 대한 합의에 도달할 때까지 재료가 사용되는 수개월/년 동안 일관성을 보장하기 위해 재료를 정기적으로 점검하는 것이 중요합니다.

생물학적 표준물질에 대한 활성값 할당은 협력적인 다기관 연구(예: ^6,7)를 통해 수행되어야 하며 전문 지식이 필요합니다. 혈소판 작용제에 대한 확립된 생물학적 표준의 필요성은 최근 국제 혈전증 및 지혈 학회(International Society for Thrombosis and Haemostasis, ISTH)가 지원하는 다기관 협력 연구⁸에 의해 강조되었다. 국제 CRP-XL 표준이 제공될 때까지 연구자들은 시간이 지남에 따라 일관성을 보장하기 위해 현지에서 자체 재료를 표준화할 수 있으며, 상업적 또는 사내에서 조달된 새로운 재료는 이전 준비 및 나머지 커뮤니티의 준비와 유사한 활동을 할 수 있습니다.

혈액은 동의한 건강한 지원자로부터 채취하여 현지 규칙에 따라 처리해야 합니다. 이 프로토콜은 광 투과 응집법(LTA)에 의해 혈소판 풍부 혈장(PRP)에서 작용제 유도 혈소판 응집을 측정합니다. ISTH는 PRP 준비를 위한 2013년 방법 및 LTA⁹를 포함하여 표준화된 프로토콜을 제공합니다.  지역 윤리 위원회 규칙에 따라 ISTH 권장 사항에 따라 전혈을 4% 구연산나트륨으로 수집합니다. 지난 2주 이내에 비스테로이드성 항염증제(NSAID)를 복용한 기증자는 제외합니다.

1. 분석 절차

1. 스톡 CRP-XL의 분취액을 분석(Tyrodes¹⁰) 완충액(표 1)에서 최대 응집을 유발하는 시작 농도로 희석합니다(1.3단계 아래 참고 참조).
   참고: 문헌에서 1μg/mL의 농도는 최대 응집을 유도하지만 일부 실험실에서는 동일한 효과에 도달하기 위해 더 높은 농도가 필요합니다
2. 농도가 테스트 시약과 동일하도록 표준물질(1.3단계 및 그림 1 아래의 참고 참조)과 해당 희석 시리즈를 만듭니다.
3. 분석 버퍼에서 테스트 및 표준물질에 대한 6-8점 희석 시리즈를 생성하여 응집 반응을 100%에서 0% 응집으로 가져옵니다. 8점 희석 계열 농도 곡선을 보여주는 예가 표 2에 나와 있습니다.
   참고: 일부 실험실은 총 10% 분석 부피(예: 50μL의 작용제와 450μL의 혈소판)로 작용제를 추가하여 분석에서 10배 농도를 최종 1배 농도로 희석하는 반면, 다른 실험실에서는 더 작은(더 농축된) 부피의 작용제(예: 5μL의 작용제와 495μL의 혈소판)를 추가합니다. 혈소판 농도에 영향을 미칩니다 - 다시 말하지만, 일관성을 유지하십시오. 이 예에서는 30μL의 10x 작용제를 270μL의 혈소판 풍부 혈장(PRP)에 첨가합니다.
4. 혈소판이 휴식을 취하고 사용할 준비가 되면 LTA 큐벳에 분주하고 교반 막대를 추가한 다음 홀딩 웰에서 37°C에 도달하도록 합니다.
5. 온도에 도달하면 큐벳을 응집계에 놓고 트레이스 기록을 시작합니다. 작용제(교반 포함)를 추가하고 데이터를 기록합니다.
6. 곡선을 그리는 데 필요한 데이터가 수집될 때까지 테스트 및 표준물질의 각 농도에 대해 1.4단계를 반복합니다(예: 그림 2에 표시된 곡선).
7. 표준물질과 비교하여 테스트 시약의 효능을 계산합니다. 다시 말하지만, 일관성이 있고 분석 모델이 데이터에 적절하게 맞는 한 메트릭(최대 집계 또는 곡선 아래 영역)을 사용합니다.

2. 농도 곡선 확인

1. 먼저 농도 반응 곡선이 평행한지 확인합니다. 이 작업을 수행하는 많은 소프트웨어 패키지가 있지만 여기서는 Graphpad Prism에 대한 프로세스를 설명합니다( 그림 3 참조).
   1. log(concentration)가 X축에 있고 반응(% maximum aggregation/AUC)이 Y축에 오도록 데이터를 입력합니다(그림 3A).
   2. CRP-XL 농도 변환(그림 3B)
   3. 분석 함수에서 비선형 회귀 분석을 선택하고 용량-반응 자극/억제에 대한 방정식을 사용합니다.
   4. 로그(작용제) 대 반응(가변 기울기) 선택 - 데이터에 가장 적합한 것에 따라 3-차 또는 4-차 적합치를 사용합니다.
   5. 비교 탭(그림 3C 참조)을 사용하여 곡선이 평행한지 여부를 확인하고 버튼을 클릭하여 데이터 세트를 비교하여 경사(언덕 경사)와 점근선(곡선의 위쪽 및 아래쪽)이 동일한지 확인합니다. 이 예에서 검정의 언덕 기울기는 2.279이고 표준의 언덕 기울기는 2.025로 비율은 1.125입니다.
   6. 기울기가 평행하고(예: 경사 비율의 허용 기준이 0.8-1.25 사이) 점근선이 동일한 경우 2.1.3 및 2.1.4단계를 사용하여 잠재력(EC₅₀) 계산을 진행합니다. 여기에 표시된 예에서는 2.1.5단계의 평가에서 점근선이 동일하다는 것이 확인됨에 따라 점근선이 제한되었습니다.
   7. 표준물질의 EC₅₀ 값을 테스트의 값으로 나누어 상대적 효능을 결정합니다. 여기에 표시된 예에서 test/standard (0.07259/0.1498) = 0.4846, 즉 'test'는 표준의 절반만큼 강력합니다.
   8. 효능의 차이를 설명하기 위해 질량/부피 농도를 조정합니다(예: 표준물질이 이전에 1μg/mL에서 사용된 경우 새로운 물질은 1/0.4846 = 2.063μg/mL)에서 사용되어 비슷한 양의 활성 물질이 실험에 사용되도록 합니다.

그림 1은 희석 시리즈를 도식적으로 표현한 것으로, 표준물질과 테스트 모두에 희석 시리즈가 필요하다는 것을 강조하기 위한 것입니다. 그림 2A는 표준물질에 대한 집계 트레이스를 보여주며, 테스트 데이터는 그림 2B에 나와 있습니다. 0.075μg/mL에서는 표준물질에 대한 명확한 반응이 있는 반면, 테스트의 경우 해당 농도(0.075μg/mL)는 평평합니다. 이 데이터는 EC50을 제공하기 위해 후속 그래프를 그리는 데 사용됩니다. 여기에 표시된 예에서는 그림 3과 같이 100% 최대 응집을 사용하여 농도-반응 곡선을 표시하고 EC50을 결정했습니다.

그림 1: 테스트의 두 희석 시리즈(왼쪽)와 표준물질(오른쪽)에 대한 그래픽 설명. 최고 농도(권장 농도: 10μg/mL CRP-XL)부터 시작하여 순차적 1/2 희석이 8개 지점(>3 log 단위)에 걸쳐 병렬로 이루어집니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 표준물질(왼쪽) 및 테스트 희석 시리즈(오른쪽)에 대한 응집 트레이스. 혈소판 응집이 진행되면(x축) 샘플을 통과하여 센서에 도달하는 빛의 양이 증가합니다(y축). (A) 표준. (B) 테스트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 데이터 입력 및 분석. (A) 데이터를 입력하고, (B) 변환하고, (C,D) 평행도를 분석합니다(언덕 경사와 점근선이 비교 가능한지 알려달라고 소프트웨어에 요청). (E) 곡선이 평행한 경우 비선형 회귀 곡선 피팅을 사용하여 효능(EC50)을 결정합니다. (F) 표시된 변환 데이터. 자세한 내용은 방법을 참조하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: Tyrodes 완충액의 구성.

표 2: 8점 희석 시리즈를 보여주는 예.

저자는 선언 할 것이 없습니다.