이온 채널의 약리학적 표적화는 고형 종양을 치료하는 유망한 접근 방식입니다. 암세포에서 이온 채널 기능을 특성화하고 암 생존력에 대한 이온 채널 조절제의 효과를 분석하기 위한 자세한 프로토콜이 제공됩니다.
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이 논문에서
요약
초록
이온 채널은 세포 발달과 세포 항상성 유지에 중요합니다. 이온 채널 기능의 섭동은 광범위한 장애 또는 채널병증의 발병에 기여합니다. 암세포는 이온 채널을 활용하여 자체 발달을 유도할 뿐만 아니라 종양으로 개선되고 다양한 비암성 세포를 포함하는 미세 환경에서 동화됩니다. 또한, 종양 미세 환경 내에서 성장 인자 및 호르몬 수준의 증가는 이온 채널 발현을 향상시켜 암세포 증식 및 생존에 기여할 수 있습니다. 따라서 이온 채널의 약리학적 표적화는 원발성 및 전이성 뇌암을 포함한 고형 악성 종양을 치료하는 유망한 접근 방식일 수 있습니다. 본원에서는 암 세포에서 이온 채널의 기능을 특성화하기 위한 프로토콜과 암 생존력에 미치는 영향을 결정하기 위해 이온 채널의 조절자를 분석하는 접근법을 설명합니다. 여기에는 이온 채널에 대한 세포 염색, 미토콘드리아의 편광 상태 테스트, 전기 생리학을 사용하여 이온 채널 기능 확립, 약물 효능을 평가하기 위한 생존력 분석 수행이 포함됩니다.
서론
막 수송 단백질은 세포 간의 통신과 세포 항상성 유지에 중요합니다. 막 수송 단백질 중에서 이온 채널은 세포의 성장과 발달을 촉진하고 도전적이고 변화하는 환경에서 세포의 상태를 유지하는 역할을 합니다. 이온 채널은 또한 전신 및 중추신경계(CNS)에서 고형 종양의 발달을 유도하고 지원하는 것으로 보고되었습니다1,2. 예를 들어, KCa3.1 채널은 세포 주기 조절에 중요한 막 전위를 조절하고 세포 부피를 조절하는 역할을 합니다. 결함이 있는 KCa3.1 채널은 종양 세포의 비정상적인 증식에 기여하는 것으로 보고되었다3. 또한, 이온 채널은 암의 전이성 전파에 기여할 수 있습니다. 일시적인 수용체 전위 (TRP) 채널은 예를 들어 Ca2+ 및Mg2+ 유입에 관여하고; 이 유입은 종양을 둘러싼 세포외 기질을 조절하는 기능을 하는 여러 키나아제와 열 충격 단백질을 활성화시키며, 이는 차례로 암 전이를 시작하는 데 중요합니다4.
이온 채널은 암 발병에 기여할 수 있기 때문에 약물 관련 암 치료의 표적이 될 수도 있습니다. ....
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프로토콜
1. 배양된 세포의 면역표지 이온 채널
- 세포 준비 및 실험 설정
- 세포를 75cm2 배양 플라스크에서 활발하게 성장하는 배양물로 유지한다. 사용 중인 세포주의 배가 시간에 따라 50%-90% 합류할 때까지 세포를 한 번 계대합니다.
참고: 본 연구를 위해, 그룹 3 수모세포종 세포주인 D283 세포를 사용하였다. - 배양 플라스크에서 세포를 원심분리기 튜브(15mL 또는 50mL)에 모으고 0.25% 트립신-EDTA 2mL를 추가하여 부착 세포를 분리합니다. 실온(RT)에서 5분 동안 배양합니다. 5 분 후 플라스크를 3-5 번 두드려 세포를 분리합니다. 세포를 10% FBS와 함께 10mL의 배지에 모아 트립신의 작용을 중지시킨다.
- RT에서 480 x g 에서 5분 동안 원심분리기. 매체를 부드럽게 흡인합니다. 세포 펠릿을 방해하지 마십시오.
- 배양물의 밀도에 따라 5 mL 내지 10 mL의 배지에서 세포를 재현탁한다.
참고: 밀도는 활발하게 성장하는 세포와 일치해야 하며 플라스크 내 세포의 밀도에 따라 달라집니다. 최적의 세포 밀도를 근사화하기 위해 시각적 평가를 사용해야 합니다. 특히, 셀은 40%-90% 사이에 합류하고 고르게 분포되어야 합니다.
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- 세포를 75cm2 배양 플라스크에서 활발하게 성장하는 배양물로 유지한다. 사용 중인 세포주의 배가 시간에 따라 50%-90% 합류할 때까지 세포를 한 번 계대합니다.
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결과
위는 암세포에서 이온 채널을 특성화하는 데 사용할 수 있는 선별된 절차입니다. 첫 번째 프로토콜은 이온 채널의 염색을 강조합니다. 자세히 설명했듯이 이온 채널 또는 세포외막에 존재하는 단백질을 염색할 때 많은 어려움이 있습니다. 도 1에 나타낸 것은 펜타머 GABAA 수용체의 서브유닛에 대한 염색이다. 두 번째 프로토콜은 암세포에서 미토콘드리아의 편광 상태를 테스트한 결과를 강조합니다. 미토콘드리아는 세포 생존력과 증식, 세포 사멸에 필수적인 역할을 합니다. 포유류 세포에서 미토콘드리아는 미토콘드리아 내막과 외막 사이에서 발견되는 Bcl-2 계열 단백질의 방출을 통해 세포 스트레스에 대한 반응으로 세포 사멸을 활성화합니다. 세포질에서 Bcl-2 계열 단백질은 프로그램된 세포 사멸을 매개하는 카스파아제 프로테아제를 활성화합니다. 원형질막 이온 채널 기능의 변화는 미토콘드리아 내의 이온 수준을 포함하여 세포 내 이온 항상성의 파괴를 초래할 수 있으며, 이는 막.......
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토론
이온 채널 기능의 변화는 세포 내 신호 전달 캐스케이드를 변경하여 세포의 전반적인 기능에 영향을 줄 수 있습니다. 지난 10년 동안 이온 채널이 암세포 성장과 전이에 중요하다는 것이 점점 더 분명해졌습니다. 중요하게도, 많은 이온 채널이 광범위한 장애를 표적으로 하는 승인된 치료제의 주요 표적이다24. 연구자들은 이온 채널이 항암 표적이 될 수 있는지 여부를 조사했으며 초기 결과는 2,16,25를 약속합니다. 이 분야는 암 발병 및 치료 표적으로서 이온 채널의 역할을 조사하기 시작했으며 미래는 두 가지 측면에서 모두 밝아 보입니다.
이 연구에서는 암세포의 이온 채널을 분석하고 채널이 치료 취약성인지 여부를 결정하기 위한 자세한 절차를 제공합니다. 이러한 분석은 암세포의 이.......
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공개 사항
D.A.P.K.는 Amlal Pharmaceuticals Inc.의 공동 창립자, 사장 겸 CEO이며, Amlal Pharmaceuticals Inc.의 공동 설립자이며 Bexion Pharmaceuticals, Inc.의 의약품 안전 모니터링 위원회에 소속되어 있습니다.
감사의 글
저자는 Thomas E. & Pamela M. Mischell Family Foundation에서 S.S.에 대한 지원과 Harold C. Schott Foundation이 UC 의과 대학의 Harold C. Schott 기부 의장에게 자금을 지원했음을 인정합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
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| ABS SpectraMax 플레이트 리더 | 분자 장치 | ABS | |
| Accutase | Invitrogen | 00-4555-56 | |
| Alexa Flor 488 | Invitrogen | A32723 | 염소 항 토끼 |
| 항생제 - 항진균제 | Gibco | 15240-062 | 100x |
| B27 보충제 | Gibco | 12587-010 | 비타민 A |
| 생물 안전성 부족 캐비닛 | LABCONCO | 302381101 | Class II, Type A2 |
| 소 혈청 알부민 | Fisher Scientific | BP1606-100 | |
| CO2 인큐베이터 | Fisher Scientific | 13-998-211 | Heracell VIOS 160i |
| 염화칼슘 | Fisher Scientific | C7902 | 이수화물 |
| 세포 배양 접시, 150mm | Fisher Scientific | 12-600-004 | 세포 배양 처리 |
| 세포 배양 플라스크, 75 cm2 | Fisher Scientific | 430641U | 세포 배양 처리 |
| 세포 배양 플레이트, 6 웰 | Fisher Scientific | 353046 | 세포 배양 처리 |
| 세포 배양 플레이트, 96 웰 | Fisher Scientific | 353072 | 세포 배양 처리 |
| 원심분리기 | Eppendorf | EP-5804R | 냉장 |
| Corning CoolCell | Fisher Scientific | 07-210-0006 | |
| 커버슬립, 22 x 22 mm | Fisher Scientific | 12-553-450 | Corning 브랜드 |
| D283 Med | ATCC | HTB-185 | |
| DABCO 마운팅 미디어 | EMS | 17989-97 | |
| D-Glucose | Sigma Life Sciences | D9434 | |
| Dimethyl 설폭사이드 | 시그마 Aldrich | D2650 | 세포 배양 등급 |
| DMEM/F12, 기본 매체 | Fisher Scientific | 11330-032 | 페놀 레드 |
| DMEM/F12 포함, 페놀 레드 무료 | Fisher Scientific | 21041-025 | |
| EGTA | 시그마 Aldrich | E4378 | |
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| 글리세롤 장착 매체 | EMS | 17989-60 | with DAPI+DABCO |
| 혈구계 | Millipore Sigma | ||
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| 현미경, 광 | VWR | 76382-982 | DMiL 반전 |
| MTS - Promega One Step | Promega | G3581 | |
| 다중 채널 피펫, 0.5-10 &마이크로; L | Eppendorf | Z683914 | |
| 멀티채널 피펫, 10-100 &마이크로; L | Eppendorf | Z683930 | |
| 멀티채널 피펫, 30-300 &마이크로; L | Eppendorf | Z683957 | |
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| 비필수 아미노산 | Gibco | 11140-050 | |
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| Parafilm | Fisher Scientific | 50-998-944 | 4인치 너비 |
| 파라포름알데히드 | EMS | RT-15710 | |
| PATHCHMASTER | Heka | ||
| 페니실린-스트렙토마이신 | Gibco | 15140-122 | |
| 관류 시스템 | Nanion | 4000120 | |
| PFA | EMS | RT-15710 | |
| 인산염 버퍼 식염수 | Fisher Scientific | AAJ75889K2 | 시약 등급 |
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| 1차 항체 | Invitrogen | MA5-34653 | Rabbit Monoclonal |
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| Propofol | Fisher Scientific | NC0758676 | mL 앰플 |
| QH-II-66 | 실험 화합물 | ||
| 시약 저장용기 | VWR | 89094-664 | Sterile |
| Slides, 75 x 25 mm | Fisher Scientific | 12-544-7 | 서리로 덥은 단면 |
| 중탄산나트륨 | 코닝 | 25-035-Cl | |
| 염화나트륨 | Fisher Scientific | S271-3 | |
| 피루브산나트륨 | Gibco | 11360-070 | |
| Synth-a-Freeze 매체 | Gibco | R00550 | 극저온 보존 |
| TMRE | Fisher Scientific | 50-196-4741 | 시약 |
| TMRE 키트 | Abcam | AB113852 | Kit |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | NC0704309 | |
| Trypan Blue | Gibco | 15-250-061 | 솔루션, 0.4% |
| Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-072 | 솔루션, 0.25% |
| Vortex Mixer | VWR | 97043-562 | |
| Whatman 여과지 | 피셔사이언티픽 | 09-927-841 |
참고문헌
- Prevarskaya, N., Skryma, R., Shuba, Y. Ion channels in cancer: Are cancer hallmarks oncochannelopathies. Physiological Reviews. 98 (2), 559-621 (2018).
- Rao, R., et al. Ligand-gated neurotransmitter receptors as targets for treatment....
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