미토콘드리아 접촉 부위를 분리하는 개선된 방법

미토콘드리아는 진핵생물에서 다양한 기능을 수행하며, 가장 잘 알려진 것은 산화적 인산화를 통한 ATP 생성입니다. 다른 기능으로는 철-황 클러스터의 생성, 지질 합성 및 고등 진핵 생물에서 Ca 2 + 신호 전달 및 세포 사멸^유도 1,2,3,4가 있습니다. 이러한 기능은 복잡한 초미세 구조와 불가분의 관계에 있습니다.

미토콘드리아 초미세구조는 전자현미경⁵에 의해 처음 기술되었다. 미토콘드리아는 미토콘드리아 외막과 미토콘드리아 내막이라는 두 개의 막으로 구성된 다소 복잡한 세포 기관인 것으로 나타났습니다. 따라서 두 개의 수성 구획이 이러한 막에 의해 형성됩니다 : 막간 공간과 매트릭스. 미토콘드리아 내막은 더 많은 부분으로 나눌 수 있습니다. 내경막은 외막에 근접하여 유지되며 크리스타는 침범을 형성합니다. 소위 크리스타 접합부(crista junctions)는 내경막(inner boundary membrane)과 크리스타(cristae)를 연결합니다(그림 1). 또한, 삼투압으로 축소된 미토콘드리아의 전자 현미경 사진은 미토콘드리아 막이 단단히 연결된 부위가 존재한다는 것을 보여줍니다 ^6,7. 이러한 소위 접촉 부위는 두 막에 걸쳐 있는 단백질 복합체에 의해 형성됩니다(그림 1). 이러한 상호작용 부위는 미토콘드리아 역학 및 유전의 조절뿐만 아니라 세포질과 매트릭스⁸ 사이의 대사 산물 및 신호 전달에 중요하기 때문에 세포 생존력에 필수적인 것으로 생각된다.

미토콘드리아 내막의 MICOS 복합체는 아마도 가장 특징적이고 가장 다재다능한 접촉 부위 형성 복합체일 것입니다. MICOS는 2011년 효모에 기술되어 있으며, Mic60, Mic27, Mic26, Mic19, Mic12 및 Mic10의 6개 소단위 ^{9,10,1 1}로 구성됩니다. 이들은 크리스타 접합부 9,10,11에 국한되는 약 1.5 MDa의 복합체를 형성합니다. 핵심 서브유닛인 Mic10 또는 Mic60을 삭제하면 이 복잡한 ^9,11이 없어지는데, 이는 이 두 서브유닛이 MICOS의 안정성에 필수적이라는 것을 의미합니다. 흥미롭게도, MICOS는 다양한 미토콘드리아 외막 단백질 및 복합체와 하나의 접촉 부위를 형성할 뿐만 아니라 여러 개의 접촉 부위를 형성합니다: TOM 복합체 11,12, TOB/SAM 복합체 9,12,13,14,15,16, Fzo1-Ugo1 복합체 ⁹, Por1 10^, OM45¹⁰ 및 Miro ¹⁷. 이는 MICOS 복합체가 단백질 가져오기, 인지질 대사 및 미토콘드리아 초세구조¹⁸의 생성과 같은 다양한 미토콘드리아 과정에 관여한다는 것을 강력하게 시사한다. MIC10 또는 MIC60의 결실을 통해 유도된 MICOS 복합체의 부재는 일반 크리스타가 거의 완전히 결여된 비정상적인 미토콘드리아 초세구조로 이어지기 때문에 후자의 기능은 아마도 MICOS의 주요 기능일 것입니다. 대신, 내부 경계막에 연결되지 않은 내부 막 소포는^{19, 20}을 축적합니다. 중요한 것은 MICOS가 효모에서 인간에 이르기까지 형태와 기능이 보존된다는 것입니다²¹. MICOS 소단위체의 돌연변이와 심각한 인간 질병의 연관성은 또한 더 높은 진핵생물에 대한 중요성을 강조합니다^22,23. MICOS는 매우 다재다능하지만 추가 접촉 사이트가 존재해야 합니다(미공개 관찰 결과). 실제로, 미토콘드리아 특이적 인지질 카디올리핀⁽²⁷)의 생합성에 관여하는 미토콘드리아 융합 기계 Mgm1-Ugo1/Fzo1^24,25,26 또는 Mdm31-Por1과 같은 몇 가지 다른 접촉 부위가 확인되었습니다. 최근에, 우리는 외막 복합체 Por1-Om14²⁸로 형성된 새로운 접촉 부위의 일부로서 Cqd1을 식별하기 위해 MICOS의 식별로 이어진 방법을 개선했습니다. 흥미롭게도, 이 접촉 부위는 미토콘드리아 막 항상성, 인지질 대사 및 코엔자임 Q^28,29의 분포와 같은 여러 과정에도 관여하는 것으로 보입니다.

여기서는 앞서 설명한 미토콘드리아 9,30,31,32,33의 분획의 변형을 사용했습니다. 미토콘드리아의 삼투압 처리는 미토콘드리아 외막의 파괴와 매트릭스 공간의 수축으로 이어져 두 막이 접촉 부위에서만 근접하게 됩니다. 이를 통해 미토콘드리아 외막 또는 미토콘드리아 내막으로만 구성되거나 온화한 초음파 처리를 통해 두 막의 접촉 부위를 포함하는 소포를 생성 할 수 있습니다. 미토콘드리아 내막은 단백질 대 지질 비율이 훨씬 높기 때문에 미토콘드리아 내막 소포는 미토콘드리아 외막 소포에 비해 더 높은 밀도를 나타냅니다. 밀도의 차이는 자당 부력 밀도 구배 원심 분리를 통해 막 소포를 분리하는 데 사용할 수 있습니다. 따라서, 미토콘드리아 외막 소포는 낮은 슈크로스 농도에서 축적되는 반면, 미토콘드리아 내막 소포는 높은 슈크로스 농도에서 농축된다. 접촉 부위를 포함하는 소포는 중간 자당 농도로 농축됩니다(그림 2). 다음의 프로토콜은 이전에 확립^{된 것에 비해} 덜 전문화된 장비, 시간 및 에너지를 필요로 하는 이 개선된 방법을 상세히 설명하고, 가능한 접촉 부위 단백질의 식별을 위한 유용한 도구를 제공한다.

1. 완충액과 원액

1. 탈이온수, pH 7.4에서 1M 3-모르폴리노프로판-1-술폰산(MOPS) 용액을 만듭니다. 4 °C에서 보관하십시오.
2. 탈이온수(pH 8.0)에서 500mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)을 준비합니다. 실온에서 보관하십시오.
3. 탈이온수에 2.4M 소르비톨을 준비합니다. 오토클레이브 후 실온에서 보관하십시오.
4. 탈이온수에 2.5M 자당을 준비합니다. 오토클레이브 후 실온에서 보관하십시오.
5. 이소프로판올에 200mM 페닐메틸설포닐플루오라이드(PMSF)를 준비합니다. -20 °C에서 보관하십시오.
   주의: PMSF는 삼키면 독성이 있으며 심각한 피부 화상과 눈 손상을 일으킵니다. 먼지를 흡입하지 말고 보호 장갑과 고글을 착용하십시오.
6. 탈이온수에 72% 트리클로로아세트산(TCA)을 준비합니다. 4 °C에서 보관하십시오.
   주의: TCA는 호흡기 자극, 심한 피부 화상 및 눈 손상을 유발할 수 있습니다. 먼지를 흡입하지 말고 보호 장갑과 고글을 착용하십시오.
7. SM 완충액을 준비합니다: 20mM MOPS 및 0.6M 소르비톨, pH 7.4.
8. 팽윤 완충액을 준비합니다: 20mM MOPS, 0.5mM EDTA, 1mM PMSF 및 프로테아제 억제제 칵테일, pH 7.4.
9. 슈크로스 그래디언트 완충액을 준비합니다: 0.8 M, 0.96 M, 1.02 M, 1.13 M, 1.3 M 슈크로스를 20 mM MOPS 및 0.5 mM EDTA, pH 7.4에서 제조합니다.
   알림: 모든 버퍼는 4°C에서 보관할 수 있습니다. 그러나, 곰팡이 성장을 피하기 위해 자당-함유 완충액을 -20°C에 보관하는 것이 권장된다. 프로테아제 억제제는 사용하기 전에 새로 추가해야 합니다.

2. 제출연골 소포의 생성

1. 확립된 프로토콜^34,35에 따라 미토콘드리아를 신선하게 분리합니다.
   참고: 이 실험을 위해 미토콘드리아는 맥주효모균(Saccharomyces cerevisiae)에서 분리되었습니다. 다른 세포 기관이 없는 구배 순수 미토콘드리아의 생성은 필요하지 않습니다.
2. 피펫팅을 통해 1.6mL SM 완충액(4°C)에 갓 분리한 미토콘드리아 10mg을 재현탁시킵니다(그림 2, 1단계).
3. 미토콘드리아 현탁액을 사전 냉각된 100mL 삼각 플라스크로 옮깁니다.
4. 20mL 유리 피펫을 사용하여 16mL의 팽창 완충액을 천천히 추가합니다. 추가하는 동안 얼음에 지속적으로 약한 저어주기를 적용합니다. 이 삼투압 처리는 매트릭스 공간으로 수분을 흡수합니다. 미토콘드리아 내막의 부종은 외막을 파괴합니다. 그러나, 두 멤브레인 모두 접촉 부위⁹에서 접촉을 유지한다(그림 2, 단계 2).
5. 얼음 위에서 30분 동안 지속적으로 약한 저어주면서 샘플을 배양합니다.
6. 5mL 유리 피펫을 사용하여 2.5M 슈크로스 용액 5mL를 천천히 추가하여 샘플의 슈크로스 농도를 약 0.55M로 높입니다. 이러한 삼투압 처리는 매트릭스(³⁶)로부터 물의 유출을 초래한다. 내막의 수축은 외막의 잔류 조각까지의 거리를 최대화하기 위한 것입니다. 이것은 초음파 처리를 통해 내막과 외막의 인공 하이브리드 소포를 생성 할 확률을 감소시킵니다 (그림 2, 3 단계).
7. 얼음 위에서 15분 동안 가볍게 저어주면서 샘플을 배양합니다.
8. 미토콘드리아를 초음파 처리하여 제출 연골 막 소포를 생성합니다 (그림 2, 4 단계).
   1. 미토콘드리아 현탁액을 사전 냉각된 로제트 셀로 옮깁니다.
   2. 미토콘드리아 현탁액을 10 % 진폭으로 30 초 동안 초음파 처리하면서 얼음 수조에서 로제트 세포를 냉각시킵니다.
   3. 서스펜션을 얼음 욕조에서 30초 동안 쉬십시오.
   4. 2.8.2단계와 2.8.3단계를 세 번 더 반복합니다.
      알림: 초음파 처리 조건은 사용 된 초음파 발생기에 따라 다릅니다. 개별 기계에 대한 최적화가 필요합니다. 너무 가혹한 초음파 처리는 미토콘드리아 내막과 외막으로 구성된 소포의 인위적인 형성으로 이어질 것입니다.

3. 제출연골 소포의 분리

1. 생성된 소포를 4°C에서 20분 동안 20,000 x g 에서 원심분리하여 나머지 온전한 미토콘드리아에서 분리합니다. 온전한 미토콘드리아는 펠릿을 만들고 소포는 상층액에 머뭅니다.
2. 소포 혼합물을 농축하십시오.
   1. 상층액을 신선한 초원심분리 튜브로 옮깁니다.
   2. 0.8 mm x 120 mm 캐뉼라가 장착된 1 mL 주사기를 사용하여 튜브 바닥에 0.3 mL의 2.5 M 자당 용액 쿠션을 로드합니다.
   3. 118,000 x g 에서 4 °C에서 100분 동안 원심분리.
      참고: 여기서는 최대 반경이 153.1mm인 스윙 버킷 로터가 사용되었습니다. 원심분리 조건은 로터에 따라 크게 달라지며 다른 로터를 사용할 때 조정해야 합니다.
3. 소포는 원심분리 후 자당 쿠션 상단에 디스크로 나타납니다. 상층액의 약 90%를 버립니다. 이제 위아래로 피펫팅하여 2.5M 자당을 포함한 나머지 완충액에 농축된 소포를 재현탁시켜 수확합니다. 서스펜션을 얼음처럼 차가운 Dounce 균질화기로 옮깁니다.
4. 폴리테트라플루오로에틸렌 포터를 사용하여 최소 10번의 스트로크로 현탁액을 균질화합니다.
5. 자당 그라디언트를 준비합니다.
   1. 5단계(20mM MOPS 및 0.5mM EDTA, pH 7.4에서 1.3M, 1.13M, 1.02M, 0.96M 및 0.8M 슈크로스)가 있는 11mL 스텝 그래디언트의 경우, 각 층에는 2.2mL의 슈크로스 용액이 있습니다.
      알림: 굴절계는 자당 농도를 측정하고 조정하는 것이 좋습니다. 그러나 필수는 아닙니다. 버퍼 10μL를 굴절계에 적용하고 각 굴절률을 검출합니다. 자당 농도의 계산은 다음과 같습니다.
      
      1.3333은 물의 굴절률을 나타냅니다. 0.048403은 수용액( ³⁷)에서 몰 굴절률에서 슈크로스 농도로의 몰 굴절률의 선형 스케일링으로부터 얻어진 슈크로스 특이적 전환지수이다.
   2. 가장 높은 자당 농도를 원심분리 튜브에 추가하고 튜브를 -20°C에 둡니다. 레이어가 완전히 고정될 때까지 기다렸다가 다음 레이어를 적용합니다. 마지막 레이어가 추가될 때까지 계속 진행하고 기울기를 -20°C에 저장합니다.
      참고: 실험을 시작할 때 그래디언트가 해동될 수 있도록 동결된 그래디언트를 4°C로 옮기는 것을 잊지 마십시오. 약 3 시간 정도 소요됩니다. 여기서 원심분리를 위해 13.2mL 용량의 스윙 버킷 로터가 사용되었습니다. 다른 로터를 사용하는 경우 그래디언트 단계 체적을 적절하게 조정해야 합니다.
6. 굴절계를 사용하여 샘플의 자당 농도를 측정합니다. 굴절계에 접근할 수 없는 경우 자당 농도가 2M라고 가정할 수 있습니다. 이 가정된 자당 농도는 다음 단계의 기초가 될 것입니다.
7. 적절한 양의 20mM MOPS, 0.5mM EDTA, 1mM PMSF 및 프로테아제 억제제 칵테일(pH 7.4)을 첨가하여 슈크로스 농도를 0.6M으로 조정합니다. 자당 농도가 측정되지 않고 2M으로 추정되는 경우, 조정 후 농도가 충분히 낮은지 테스트하는 것이 좋습니다. 시험관에 있는 0.8M 자당 200μL 위에 샘플의 작은 부분 표본(약 50μL)을 적용합니다. 샘플은 0.8M 자당 위에 있어야 합니다.
8. 샘플(약 1mL)을 자당 그래디언트 위에 로드합니다(나중에 참조할 수 있도록 10% 유지). 그래디언트의 교란을 피하기 위해서는 신중한 피펫팅이 중요합니다(그림 2, 5단계).
9. 200,000 x g 및 4 °C에서 12 시간 동안 원심 분리하여 소포를 분리합니다. 가능하면 기울기의 방해를 피하기 위해 원심분리기를 느린 가속 및 감속으로 설정합니다(그림 2, 6단계).
   참고: 여기서는 최대 반경이 153.1mm인 스윙 버킷 로터가 사용되었습니다. 원심분리 조건은 로터에 따라 크게 달라지며 다른 로터를 사용할 때 조정해야 합니다.
10. 1mL 피펫을 사용하여 700μL 분획으로 그래디언트를 위에서 아래로 수확합니다. 이렇게 하면 17개의 분수가 생성되어 충분한 분해능을 얻을 수 있습니다.

4. 제출연골 소포 분석

1. SDS-PAGE 샘플을 제조하기 위해 순차적으로 수행된 2개의 TCA 침전(³⁸)에 각 분획을 적용하여 단백질을 농축시킨다.
   1. 개별 분획에 72% TCA 200μL를 첨가하고 용액이 균질해질 때까지 혼합합니다. 얼음 위에서 30분 동안 분획을 배양하고, 20,000 x g 및 4°C에서 20분 동안 원심분리하여 침전된 단백질을 펠렛화합니다. 상층액을 버리고 500μL의 28% TCA 용액을 넣고 잘 섞은 다음 원심분리 단계를 반복합니다.
   2. 펠릿을 1mL의 아세톤(-20°C)으로 세척하고 20,000 x g 및 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버리고 펠릿을 자연 건조시킵니다. 펠릿을 60μL의 SDS 샘플 버퍼에 재현탁시키고 샘플을 95°C에서 5분 동안 배양합니다.
      참고 : 많은 양의 자당은 특히 고밀도 분획에서 첫 번째 TCA 침전 후에 남아 있습니다. 이것은 추가 TCA 강수를 통해 제거됩니다.
2. SDS-PAGE³⁹ 및 면역블로팅^40,41,42,43으로 각 분획의 20μL를 분석합니다.

미토콘드리아 내막과 외막을 분리하는 것은 비교적 쉽습니다. 그러나 접촉 부위 함유 소포의 생성 및 분리는 훨씬 더 어렵습니다. 우리의 의견으로는, 두 단계가 중요하고 필수적입니다 : 초음파 처리 조건과 사용 된 기울기.

일반적으로 선형 그래디언트는 스텝 그래디언트에 비해 해상도가 더 좋은 것으로 생각됩니다. 그러나 재현 가능한 생산은 지루하고 특수 장비가 필요합니다. 따라서 개별 단계 간에 상대적으로 작은 차이로 단계 그래디언트를 생성하는 방법을 설정했습니다(3.5단계 참조). 우리는 원심분리 시 계단식 구배가 균형을 이루어 거의 선형적인 구배가 될 것이라고 추측했습니다. 놀랍게도, 굴절계를 사용하여 원심분리한 후 개별 분획의 자당 농도를 측정한 결과, 200,000 x g 에서 원심분리 12시간 후에 단계 구배가 실제로 거의 선형으로 변하는 것으로 나타났습니다(그림 3).

온화한 초음파 처리의 중요성은 이러한 대표적인 결과에서 분명합니다. 온화한 초음파 처리 조건 (그림 4A)에서 미토콘드리아 외막 마커 Tom40은 초기 저밀도 분획 (분획 번호 4)에서 농축되었으며 후기 분획에서는 거의 없었습니다. 미토콘드리아 내막 마커 Tim17은 고밀도 분획물(분획 번호 17)에 농축되었습니다. 대조적으로, 접촉 부위 단백질 Mic60은 중간 슈크로스 농도의 분획 (분획 번호 12-14)으로 축적되었으며, 이는 다양한 막 소포의 성공적인 생성 및 후속 분리를 나타냅니다. 대조적으로, 더 가혹한 초음파 처리 조건에서는 미토콘드리아 외막 마커 Tom40이 구배의 낮은 분획에서 검출 될 수 있습니다 (분획 번호 14 및 분획 번호 17, 그림 4B). 또한, 중간 밀도의 분획에서 상당한 양의 Tim17이 존재했습니다(분획 번호 13 및 분획 번호 14, 그림 4B). 중간 밀도의 분율에서 외부 및 내부 막 마커의 비특이적 축적은 혼합 막의 인위적인 형성을 나타내며, 이는 후보 단백질의 식별을 억제합니다.

그림 1: 미토콘드리아 초미세구조의 개략도 .다양한 구획, 막 및 단백질 위치를 보여주기 위한 미토콘드리아의 개략적인 표현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 접촉 부위 단백질을 분리하기 위한 미토콘드리아 분획의 워크플로우. 프로토콜에 설명된 프로세스의 개략적인 개요입니다. (1) 갓 분리된 미토콘드리아는 (2) 삼투압으로 부풀어 올랐다가 (3) 수축되었습니다. (4) 수축된 미토콘드리아는 제출연골드리아 소포를 생성하기 위해 온화한 초음파 처리에 반대했습니다. (5) 소포 혼합물을 농축하여 슈크로스 스텝 구배 상에 로딩하였다. (6) 원심분리를 통해 미토콘드리아 외막 소포는 낮은 슈크로스 농도에서, 미토콘드리아 내막 소포는 높은 슈크로스 농도에서, 접촉 부위 함유 소포는 중간 슈크로스 농도로 농축하였다. 약어: MIM, 미토콘드리아 내막; MOM, 미토콘드리아 외막. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 원심분리에 의한 선형 그래디언트 생성. 2단계 그래디언트(1.3M, 1.13M, 이어서 20mM MOPS 및 0.5mM EDTA, pH 7.4에서 1.02M, 0.96M, 및 0.8M)를 병렬로 제조하고, 20mM MOPS 및 0.5mM EDTA, pH 7.4에서 0.6M 슈크로스 1mL를 두 그래디언트에 로드하였다. 그래디언트를 200,000 x g 및 4°C에서 12시간 동안 원심분리하고 각각 17개 분획으로 수확했습니다. 상기 방법의 재현성은 굴절계를 사용하여 개별 그래디언트의 단일 분획의 슈크로스 농도를 측정함으로써 시험하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 잘 정의된 초음파 펄스를 사용한 접촉 부위 단백질의 분리. (ᅡ,ᄂ) 갓 분리한 효모 미토콘드리아를 삼투압 처리하고 초음파 처리에 노출시켰다. 생성된 소포는 슈크로스 부력 밀도 구배 원심분리를 사용하여 분리하였다. 그래디언트를 분획하고, 다양한 분획물의 단백질을 TCA 침전을 실시하였다. 미토콘드리아 외막(Tom40), 미토콘드리아 내막(Tim17) 및 접촉 부위(Mic60)에 대한 마커 단백질의 분포는 지시된 항체를 사용하여 면역블로팅에 의해 분석되었습니다. (A) 온화한 초음파 처리 (4 x 30 초, 10 % 진폭)는 외막 단백질 (저밀도 분획)과 내막 단백질 (고밀도 분획)을 명확하게 분리했습니다. 또한, 접촉 부위 단백질 Mic60은 중간 밀도의 분획으로 성공적으로 농축되었습니다. (B) 더 가혹한 초음파 처리 (4 x 30 초, 20 % 진폭)는 하이브리드 소포의 생성을 초래하여 접촉 부위의 명확한 분리를 허용하지 않았습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.