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방법 논문

무릎 골관절염 쥐의 염증과 연골 손실을 줄이기 위한 Tuina 조작

4K 조회수

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DOI:

10.3791/65451

⸱

2023년 6월 30일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Yueyang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

우리는 석고로 고정된 무릎 골관절염 쥐에 대해 수행되는 Tuina 조작에 대한 프로토콜을 제시합니다. 예비 결과에 기초하여, 상기 방법의 효능은 염증 및 연골 손실의 감소에 의존한다는 것을 시사하였다.

초록

임상 시험에 따르면 Tuina 조작은 무릎 골관절염 (KOA) 치료에 효과적이며 그 메커니즘을 발견하기 위해서는 추가 연구가 필요합니다. 따라서, 무릎 골관절염의 동물 모델의 조작은 매우 중요하다. 이 프로토콜은 KOA 쥐에 대한 Tuina 조작을 위한 표준 프로세스와 KOA에 대한 Tuina의 메커니즘에 대한 예비 탐색을 제공합니다. 프레스 및 반죽 조작 방법 (신체 표면의 특정 부위를 누르고 반죽하는 것을 의미하는 Tuina 조작의 일종)은 쥐의 무릎 관절 주위의 5 개의 경혈에 적용됩니다. 조작의 힘과 빈도는 손가락 압력 기록에 의해 표준화되었으며 조작 중 쥐의 위치는 프로토콜에 자세히 설명되어 있습니다. 조작의 효과는 통증 행동 테스트와 활액막과 연골의 현미경 소견으로 측정할 수 있습니다. KOA 쥐는 통증 행동에서 상당한 개선을 보였다. 활막 조직 염증 침윤은 Tuina 그룹에서 감소했으며 종양 괴사 인자 (TNF) -α의 발현은 현저히 낮았다. 대조군에 비해, 연골세포 아폽토시스는 Tuina 그룹에서 더 적었다. 이 연구는 KOA 쥐에 대한 Tuina 조작에 대한 표준화된 프로토콜과 Tuina의 치료 효과가 활막 염증 감소 및 지연된 연골 세포 사멸과 관련이 있을 수 있다는 예비 증거를 제공합니다.

서론

무릎 골관절염(KOA)은 주로 관절통에서 나타나는 퇴행성 질환입니다. 섬유화, 갈라짐, 궤양, 관절 연골 손실이 이 질환의 주요 원인이다1. KOA는 유병률이 높으며 환자의 일상 생활에 지대한 영향을 미쳐 심한 경우 장애를 유발할 수 있습니다. 45-84 세의 사람들 중 KOA의 유병률은 나이가 들면서 증가하고 85 세 이상 인구의 유병률은 15 %이며 여성이 우세합니다 2,3. 또한 KOA는 개인과 사회 모두에 심각한 경제적 부담을 줄 수 있습니다. 설문 조사에 따르면 1인당 KOA의 직접 의료 비용은 연간 $5,120 ± $8,858에 달했습니다4. 사회의 고령화와 함께 KOA는 전 세계적인 건강 문제이자 주요 사회 문제이자 과학 연구의 주제가 되었습니다.

증거 기반 연구에 따르면 KOA5 치료에 Tuina 조작의 효과가 있음이 밝혀졌습니다. Tuina 조작은 KOA 환자의 통증을 완화하고 기능 장애를 개선 할 수 있으며, 그 메커니즘은 항 염증 효과와 관련이 있습니다 6,7. 학자들은 Tuina 조작이 염증 인자인 인터루킨(IL)-β 및 5-하이드록시트립타민의 발현을 효과적으로 억제하고 토끼 KOA 모델8에서 관절 연골의 퇴행을 늦춘다는 것을 발견했습니다. Tuina는 병변 부위의 혈액 순환과 신진 대사를 촉진하여 IL-1, IL-6 및 종양 괴사 인자 (TNF) -α와 같은 염증 인자를 제거하여 KOA9의 임상 증상을 완화 할 수 있음을 시사했습니다. 또한, Tuina 조작을 통한 관절의 수동적 움직임은 관절 연골로의 활액의 침투 및 확산을 촉진하고 조직 영양소 대사를 향상시킬 수 있습니다10. 다른 연구에서는 Tuina 조작이 KOA 환자의 생체역학적 지표를 효과적으로 개선할 수 있다고 제안했다11. 연조직에 적용된 조작은 팔다리의 스트레스 분포를 개선하고 균형 기능을 향상시킬 수 있습니다12,13. 동시에, 일부 관절 조정 조작을 통해 비정상적인 보행을 교정하기 위해 하지의 정렬을 조정할 수도 있습니다(14,15).

KOA 치료에서 Tuina 조작의 작용 메커니즘은 아직 연구되지 않았으므로 실험적 연구가 필요합니다. 실험동물에 투이나를 적용하는 핵심은 모델링, 동물 고정, 개입 방법의 표준화이다16. 모델링 방법은 실험 동물이 질병의 특성을 나타낼 수 있는지 여부를 결정합니다. 한편, 적절한 고정 방법은 Tuina 조작의 개입을 용이하게하고 Tuina의 효과를보다 잘 반영 할 수 있습니다. 개입 방법의 표준화는 Tuina 조작에서 가장 어려운 부분입니다. 2010년 중국 침술 기준의 기본 체계는 실험동물에 대한 경혈 기준을 언급하여 동물실험에서 침술 및 투이나(Tuina) 수술의 가능성을 제공했다17. 그러나 Tuina 조작을 표준화하는 데는 여전히 어려움이 있습니다. Tuina 조작에는 여러 유형이 있습니다18. 특정 조작의 선택은 주로 치료할 질병과 수행자가 선호하는 치료 이론에 달려 있습니다. KOA에 대한 Tuina의 연구에서는 포인트 프레싱 조작(엄지손가락이나 팔꿈치로 특정 경혈을 누르는 것), Yizhichan 푸시 조작(엄지손가락을 흔들어 누르는 조작), 프레스 및 주무르기 조작(손가락이나 손바닥으로 신체 표면의 특정 부위를 누르고 주무르는 것을 말함)에 더 많은 주의를 기울였습니다.19. 프레스 및 반죽 조작은 피하 조직을 이동시키기 위해 압착 및 반죽을 결합하는 가장 널리 사용되는 Tuina 조작 중 하나이다(20). 경혈에 적용되는 프레스 및 반죽 조작은 혈액 순환을 촉진하고 통증을 완화시킬 수 있으며 KOA19에 대한 Tuina의 치료 효과를 나타냅니다.

이 프로토콜에서는 향후 연구를 위한 참고 자료를 제공하기 위해 선택된 경혈, 조작의 강도 및 빈도, 쥐의 신체 위치를 포함하여 KOA 쥐에 대한 프레스 및 반죽 조작 작업을 자세히 설명합니다.

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프로토콜

이 연구는 상하이 한의과대학 부속 한중한의학통합병원 웨양병원 실험동물윤리위원회에서 실시한 동물윤리검토를 통과했다(YYLAC-2022-166).

1. 실험동물 준비 및 그룹화

  1. 동물 준비
    1. 실온(18-21°C), 습도 40%-50%, 12시간: 12시간 일주기 리듬 교대에서 200-220g의 총 10마리의 건강한 SPF SD 암컷 래트를 후면합니다. 동물 윤리 지침 및 지침의 관련 조항을 엄격히 준수하여 통증 관련 동물 실험을 수행합니다.
  2. 동물 그룹화
    1. 쥐를 무작위로 Tuina 그룹과 대조군으로 나눕니다. 모델링 후 21 일 동안 Tuina 그룹의 쥐를 프레스 및 반죽 조작으로 치료하십시오. 대조군의 쥐를 같은 Tuina 방에 넣고 Tuina 그룹이 치료를받는 동안 동시에 검은 천 가방에 넣으십시오.

2. 동물 모델링

  1. 동물 마취
    1. 가스 마취를 위해 이소 플루 란을 사용하십시오. 쥐를 유도 농도가 3%인 유도 상자에 넣습니다. 쥐를 눕힌 후 상자를 흔들고 쥐가 엎드린 자세로 돌아가려는 시도 없이 전복될 때 마취를 확인합니다.
    2. 유도 상자에서 쥐를 꺼내 마취 마스크에 코를 고정시킵니다. 마취를 유지하기 위해 이소플루란 농도를 2%로 조정합니다. 쥐가 발을 꼬집을 때 반응하지 않을 때 마취를 확인하십시오. 눈꺼풀을 닫을 수 없기 때문에 쥐가 마취 될 때 건조를 방지하기 위해 쥐에게 눈 연고를 바르십시오.
  2. 모델링 방법21
    1. 면도기를 사용하여 오른쪽 뒷다리의 털을 제거하십시오. 쥐의 오른쪽 발목과 엉덩이 관절 사이에 의료용 면봉을 놓습니다. 오른쪽 무릎 관절을 180° 확장으로 5-6겹의 젖은 석고 붕대로 고르게 고정합니다. 나선형은 발목에서 시작하여 이전 붕대의 1/3을 덮는 석고 붕대를 감 쌉니다. 헤어 드라이어를 사용하여 석고를 말리고 굳히십시오.
    2. 석고 붕대가 마르고 경화 된 후 석고를 고정하고 g아 먹는 것을 방지하기 위해 석고를 의치 기본 재료로 외부 감 쌉니다.
    3. 의치 기초 재료를 혼합하여 끈적 거리게하고 혼합물을 석고 외부에 부착합니다 (혼합물은 붕대 가장자리를 초과해서는 안됩니다, 그림 1). 혼합물이 단단 해지면 마취 기계를 끄고 동물이 자연스럽게 깨어날 때까지 기다리십시오. 쥐가 일어나기 전에 마취 사고를 예방하기 위해 쥐를 감독하십시오.
    4. 쥐의 오른쪽 뒷다리에 석고를 적절하게 고정하십시오., 단단한 고정은 혈액 순환을 제한하는 반면, 느슨한 고정은 떨어지는 경향이 있습니다. 말단 사지의 혈액 순환을 관찰하십시오. 말단의 부종이나 보라색 안색이 감지되면 즉시 석고의 일부를 잘라내어 혈액 순환을 회복하십시오. 석고가 부러져서하지 확장을 유지하지 못하는 경우 석고를 다시 만드십시오.
    5. 3 주간의 지속적인 고정 후에 석고를 제거하십시오. 수술용 가위를 사용하여 외부의 의치 기저재를 잘라내고 석고 붕대를 감습니다. 쥐의하지를 식염수로 헹구고 거즈로 말리십시오. 국소 피부 병변이 있으면 iodophor로 살균하십시오.
  3. 모델 검증22
    1. X-ray 기반 검증
      1. 모델링 종료 1 일 후 오른쪽 무릎의 X- 레이 검사를 실시하십시오. 앙와위 자세에서 30°에서 고관절 굴곡, 0°에서 무릎 신전, 15°에서 고관절 외전으로 전후 방사선 사진을 찍습니다. 슬개골을 무릎 바로 앞에 두고 라디에이터 튜브를 무릎 관절에서 110mm 떨어진 곳에 놓습니다.
      2. 오른쪽 고관절 굴곡을 30°로, 오른쪽 무릎을 0°로 확장하여 오른쪽 측면 욕창 위치에서 측면 방사선 사진을 찍습니다. 왼쪽 팔다리 고관절 굴곡을 70°, 무릎 굴곡을 45°로 만들고 라디에이터 튜브를 무릎 관절에서 110mm 떨어진 곳에 놓습니다. 검출 파라미터를 노출 전압 50kV, 전류 250mA, 노출 선량 32mA, 노출 시간 128ms로 설정합니다.
      3. 정상 쥐의 X-ray와 비교하여 모델링된 무릎 X-ray가 가장자리에 골극 증식과 함께 더 좁은 관절 공간을 보여주는지 확인합니다.
    2. OARSI(Osteoarthritis Research Society International)점수 23점
      1. 쥐를 안락사 상자에 넣고 분당 30%-70% 케이지 부피의 속도로CO2 를 관류합니다. 쥐가 움직이지 않고 숨을 쉬지 않고 동공이 확장되었음을 감지한 후 CO2 관류를 중단하십시오. 사망을 확인하기 위해 2분 더 관찰합니다.
        참고: 경추 탈구는 사망을 확인하기 위한 2차 형태로 CO2 기반 안락사 후에 수행할 수 있습니다. 쥐를 테이블에 고정시키고 한 손으로 꼬리를 잡습니다. 다른 손의 엄지와 검지로 쥐의 머리를 누릅니다. 균열 소리가 들리면 죽음을 확인하고 쥐는 동시에 움직임과 심장 박동을 잃습니다.
      2. 오른쪽 뒷다리가 납치 및 외부 회전으로 구부러진 폼 보드에 주사기 바늘로 앙와위 자세로 쥐를 고정시킵니다. 수술 용 가위로 무릎 관절 주위의 피부를 꼬집습니다. 피부를 절개한 후 피하 근막을 절개하여 무릎 관절 주위의 근육을 노출시킵니다.
      3. 뼈 가위로 대퇴골과 경골 골간을 잘라 내고 오른쪽 무릎 관절을 제거하십시오. 관절 외부의 근육 및 인대와 같은 여분의 연조직을 부드럽게 제거합니다.
      4. 4 ° C에서 24-48 시간 동안 4 % 파라 포름 알데히드에 조인트를 고정합니다. 뼈 조직이 바늘로 쉽게 찔릴 수 있을 때까지 3일 동안 10% 포름산 용액으로 관절을 석회질제거합니다.
      5. 석회질 제거 조직을 흄 후드에 넣고 다듬고 탈수 기계의 탈수 상자에 옮깁니다. 4 시간 동안 75 % 에탄올을 넣은 다음 2 시간 동안 90 % 에탄올을 넣은 다음 1 시간 동안 95 % 에탄올, 30 분 동안 절대 에탄올, 30 분 동안 신선한 절대 에탄올, 5-10 분 동안 알코올 벤젠, 5-10 분 동안 크실렌, 5-10 분 동안 신선한 크실렌의 또 다른 라운드, 1 시간 동안 왁스, 1 시간 동안 신선한 왁스의 또 다른 라운드, 탈수 및 투명 왁스 침지를 위해 1 시간 동안 신선한 왁스의 최종 라운드.
      6. 그런 다음 내장을 위해 조직을 기계에 넣습니다. 파라핀이 굳은 후 왁스 블록을 4μm의 왁스 조각으로 자르고 따뜻한 물에 슬라이스를 평평하게 만듭니다. 슬라이스를 유리 슬라이드에 놓고 말립니다. 실온에 보관하십시오.
      7. 연골 샘플을 관찰하고 OA 연골 조직병리학 등급 평가(표 1)23에 따라 점수를 매깁니다. 모델링 후 랫트의 점수가 정상 래트의 점수보다 유의하게 높으면 모델링에 성공한 것입니다.

표 1. OA 연골 조직병리학 등급 평가. 등급은 연골로의 깊이 진행입니다. 총점 = 등급 x 스테이징. 정상 관절의 경우 0, 심한 관절염의 경우 24. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 1. 석고에 고정 된 쥐. 쥐를 마취시킨 후, 우측하지를 석고 붕대로 감싸고, 과신전 위치에 고정하고, 바깥쪽에 의치 기초 재료 층으로 덮었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

3. 투이나 조작

  1. 범위
    1. ST34, ST35, SP10, EX-LE4 및 BL40을 포함하여 쥐의 오른쪽 뒷다리에서 총 5개의 경혈을 선택합니다(그림 2). 24에서 경혈 위치 지정 원리에 따라 경혈을 찾습니다.
  2. 지원 위치
    1. 한쪽 구멍이 있는 9cm x 15cm 가방에 검은색 천을 자르고 밧줄로 구멍을 조입니다. Tuina 조작 전에 쥐의 꼬리를 부드럽게 잡아 당겨 가방 안으로 파고 들어가 뒷다리를 가방 밖으로 드러냅니다.
    2. 한 손으로 쥐를 엎드린 자세로 유지하고 꼬리와 뒷다리를 잡고 다른 손으로 특정 경혈을 누르고 반죽하는 조작을 적용합니다(그림 3).
  3. Tuina 조작
    1. 오른쪽 뒷다리에 있는 5개의 경혈을 각각 2분씩 누르거나 주무르기 조작합니다. 선택한 경혈에 엄지손가락을 대고 리드미컬한 프레스와 주무르기를 수행하여 피부와 피하 조직을 함께 원을 그리며 움직입니다.
    2. 손가락 압력 기록(뉴턴 단위)을 사용하여 조작의 강도와 빈도를 일관되게 유지합니다. 강도를 3-5N과 주파수를 2Hz로 유지합니다(그림 4). 21 일 동안 하루에 한 번 조작을 적용하십시오.

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그림 2. 경혈 위치. SP10은 쥐의 안쪽 무릎 관절 위 5mm에 위치합니다. ST34는 쥐의 바깥쪽 무릎 관절 위 5mm에 위치합니다. EX-LE4는 쥐의 무릎 인대 내측에 위치합니다. ST35는 쥐의 무릎 인대 측면에 위치합니다. BL40은 가로 슬와 줄무늬의 중간 지점에 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3. Tuina 조작은 쥐에게 적용되었습니다. 쥐들은 뒷다리가 드러난 검은 가방에 보관되었습니다. 연기자는 왼손으로 쥐의 꼬리를 잡고 오른손은 조작을 수행했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4. 손가락 압력 기록. 손가락 압력의 힘과 주파수를 기록하는 장치는 Tuina 조작 과정에서 강도와 주파수에 대한 실시간 피드백에 사용됩니다. (A) 압력 센서 및 전송 장비. (B) 손가락 압력 기록. (C) Tuina 조작 중에 기록된 힘. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

4. 통증 행동 테스트

  1. 모델링 전후, 1일 후(D1), 7일 후(D7), 14일 후(D14) 및 21일 후(D21)에 기계적 금단 역치 및 발 금단 잠복기 테스트를 포함한 Tuina 조작 후 통증 행동을 테스트합니다.
  2. 기계적 인출 임계값(MWT)
    1. 10mm x 10mm 크기의 와이어 격자로 구성된 40cm 높이의 무대에 위치한 20cm x 10cm 투명 강화 유리 칸막이에 쥐를 놓습니다. 실온을 23°C ± 2°C로 유지한다.
    2. 공식 테스트 시작 시 동물이 환경에 적응하지 못하여 테스트 결과에 간섭을 피하기 위해 행동 테스트 단계에서 하루에 최소 2시간 동안 행동 실험실에 쥐를 정착시킵니다. 공식 테스트를 시작하기 전에 30분 동안 쥐를 행동 실험실에 두어 환경에 대한 적응을 촉진하고 주의를 산만하게 하는 요인을 줄입니다.
    3. 전자 Von Frey 섬유를 사용하여 MWT를 측정합니다. 발 중앙에 섬유질이 있는 쥐를 자극하고 쥐가 다리를 들어 올리고 피하는 것과 같은 명백한 움직임을 보일 때 섬유질을 빼냅니다. 기계는 이 순간에 최대 압력 값(N)을 자동으로 기록할 수 있습니다.
    4. 현재 자극 후 최소 15초 후에 동일한 쥐에서 다음 자극을 시작합니다. 쥐의 발에서 촉각 자극에 대한 감작을 방지하기 위해 각 자극 동안 5 초를 초과하지 마십시오. 세 번의 연속 측정값 간의 차이가 미미할 때까지(10N 이내) 테스트를 5회 반복합니다.
    5. 차이가 큰 값(최대값과 최소값)을 삭제하고 나머지 세 값의 평균을 기계적 인출 임계값으로 사용합니다.
  3. 발 철수 대기 시간(PWL)
    1. 쥐를 20cm x 10cm x 20cm 크기의 투명 강화 유리의 작은 구획에 놓습니다. 통풍구가있는 투명한 유리 덮개로 구획 상단을 덮으십시오. 투명 유리판의 온도를 28-30 °C로 유지하십시오., 구획이 놓여 있습니다.
    2. 각 공식 테스트가 시작되기 전에 적응할 수 있도록 최소 30분 동안 이 환경에 쥐를 정착시킵니다. 쥐가 구획에서 소변을 보거나 배설하는 경우, 후속 광 복사 열 전달에 영향을 미치지 않도록 흡수성 종이로 제 시간에 청소하십시오.
    3. 스포트라이트를 쥐의 발 중앙에 집중시키고 시작 버튼을 누릅니다. 쥐가 발을 뒤로 젖히거나 발을 핥는 것과 같은 명백한 행동을 보일 때 중지 버튼을 누르고 이 시점에서 시간을 기록합니다. 스포트라이트 조사 시간은 쥐의 피부 손상을 피하기 위해 20초를 초과해서는 안 됩니다.
    4. 감작을 방지하기 위해 최소 10분 후에 동일한 쥐에 다음 조사를 수행합니다. 각 쥐에 대해 5 배를 측정하십시오.
    5. 차이가 큰 값(최대값과 최소값)을 제거합니다. 나머지 값의 평균을 PWL로 취합니다.

5. 시료 전처리

  1. 2.3.2.1에 설명된 대로 마우스에서 안락사를 수행합니다.
  2. 활막 준비
    1. 오른쪽 뒷다리가 납치 및 외부 회전에서 구부러진 상태에서 폼 보드에 주사기 바늘로 앙와위 자세로 쥐를 고정시킵니다. 수술용 가위로 무릎 관절 주위의 피부를 꼬집고 피부를 절단한 후 피하 근막을 절단하여 쥐의 무릎 관절 주변 근육을 노출시킵니다.
    2. 슬개골 인대를 랜드 마크로 삼아 슬개골 인대 위의 근육 그룹을 벗겨냅니다. 슬개골 인대의 끝 부분 (경골 결절)을 조심스럽게 절개하고 인대가 아래에서 위쪽으로 꼬집어 질 때 활막을 찾으십시오.
    3. 안과 용 가위로 활막 조직을 조심스럽게 잘라 내고 미리 냉각 된 식염수로 혈액과 활액을 씻어 내십시오. 깨끗한 거즈로 조직 표면에서 물을 흡수 한 후 최소 48 시간 동안 4 % 파라 포름 알데히드에 활막을 고정하십시오.
    4. 2.3.2.5-2.3.2.6 단계에서와 같이 샘플을 준비합니다. 2.3.2.7단계에서와 같이 점수를 매깁니다.
  3. 헤마톡실린 및 에오신 염색 수행
    1. 20 분 동안 크실렌으로 물에 왁스를 제거하고 20 분 동안 또 다른 신선한 크실렌으로 교체 한 다음 5 분 동안 무수 에탄올로 처리하고 5 분 동안 새로운 무수 에탄올로 교체 한 다음 90 % 에탄올을 5 분 동안 첨가하고, 80 % 에탄올을 5 분 동안 부피로, 70 % 에탄올을 5 분 동안 첨가하고, 마지막으로 증류수를 5분 동안 증류합니다.
    2. 슬라이드를 헤마톡실린 염색 용액에 3-8분 동안 담급니다. 슬라이드를 제거하고 증류수로 얼룩을 헹굽니다. 슬라이드가 옅은 파란색으로 희미 해지도록 거의 30 초 동안 분화 유체 (1 % 염산 알코올)로 이동하십시오. 증류수로 헹구고 에오신 염색 용액에 1-3분 동안 담가둡니다.
    3. 슬라이드를 5분 동안 95% 에탄올 부피 분율로 탈수하고, 5분 동안 새로운 95% 에탄올로 교체한 다음, 5분 동안 무수 에탄올로 교체하고, 5분 동안 또 다른 라운드의 신선한 무수 에탄올로 교체합니다.
    4. 5분 동안 자일렌을 첨가하여 슬라이드를 투명하게 만들고 5분 동안 또 다른 신선한 자일렌으로 교체한 다음 중성 수지로 밀봉합니다.
  4. 연골에 대한 말단-데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 매개 닉 엔드 라벨링(TUNEL)
    1. 탈랍 수화가 완료될 때까지 연골 샘플을 무수 에탄올, 90% 에탄올, 85% 에탄올 및 75% 에탄올로 탈수합니다. PBS에 5분 동안 담그십시오. 3%H2O2를 10분 동안 적가한다.
    2. 프로테이나제 K 작업 용액을 적가하고 37°C에서 10분 동안 분해합니다. 슬라이스당 20μL의 라벨링 버퍼를 추가하여 촉촉하게 유지하고 작업 용액을 준비한 후 과도한 액체를 털어냅니다. 각 슬라이드에 20μL의 작업 용액을 추가하고 습식 상자에서 37°C에서 2시간 동안 배양합니다.
    3. 클로저 용액 50μL를 한 방울씩 떨어뜨리고 30분 동안 닫습니다. 그런 다음 희석된 비오티닐화 항디곡신 항체(1:100 희석) 50μL를 적가하고 습식 상자에서 37°C에서 2시간 동안 배양합니다. 10μL의 SABC 항체 희석제(1:100 희석)를 적가하고 습식 상자에서 37°C에서 2시간 동안 배양합니다.
    4. DAB 발색 용액(증류수 1000μL에 시약 A, B 및 C 각각 50μL)을 10-15분 동안 적가합니다. 발색은 갈색-노란색 입상일 때 완료됩니다.
    5. 헤마톡실린으로 3초 동안 다시 염색합니다. 그래디언트 탈수 및 투명 처리 후 실온에서 건조하고 슬라이드를 중성 고무로 조심스럽게 밀봉합니다. 기포가 남거나 접착제가 넘치지 않도록 주의하십시오.
  5. IL-1β 및 TNF-α의 면역조직화학적 분석
    1. 슬라이드를 크실렌으로 일상적으로 탈왁스하고 그래디언트 알코올로 수화시킵니다. 내인성 퍼옥시다아제를 3%H2O2로 절편에서 불활성화시킨다. 슬라이드 홀더를 95°C 시트레이트 완충액(pH 6.0)에 넣고 95°C 이상의 수조에서 20분 이상 배양합니다. 배양 상자를 꺼내 실온에서 최소 20분 동안 그대로 두십시오.
    2. 5% 정상 염소 혈청을 PBS와 함께 37°C에서 10분 동안 배양하고 과도한 액체를 털어냅니다. 150 μL의 항체 I 한 방울을 한 방울씩 첨가하고 37°C에서 1시간 동안 방치한 다음 4°C에서 밤새 보관합니다. 다음날 37°C에서 45분 동안 다시 예열합니다.
    3. PBS로 각각 5분 동안 3회 세척합니다. 슬라이드의 조직을 3% BSA로 덮고 37°C에서 30분 동안 밀봉합니다. 항체 II 150μL를 한 방울씩 떨어뜨리고 실온에서 1시간 동안 그대로 두십시오. PBS로 각각 5분 동안 3회 세척하고 DAB 발색액 150pL을 한 방울 떨어뜨립니다. 샘플이 육안으로도 갈색을 띤 노란색이 될 때까지 현미경으로 염색 정도를 관찰하십시오.
    4. 즉시 PBS로 10분 동안 헹굽니다. 헤마톡실린으로 다시 염색하고, 그래디언트 알코올로 탈수하고, 자일렌으로 슬라이드를 투명하게 만들고, 중성 검으로 밀봉합니다.
  6. 통계 분석
    1. 관련 단백질의 양성 발현을 갖는 면역조직화학적으로 염색된 절편은 황색 또는 갈색-황색이다. 면역조직화학 절편의 각 그룹에 대해 Image J 소프트웨어로 양성 발현 강도를 점수화하고 IOD를 면적으로 나눈 값으로 계산한 평균 광학 밀도(AOD)의 평가 기준을 사용합니다.
    2. 통계 분석을 위해 분석 소프트웨어를 사용합니다. 데이터가 정규 분포를 따르는 경우 t-검정을 사용하고 카이-제곱을 따르는 경우 비모수 검정을 사용하고 정규 분포를 따르지 않는 경우 비모수 검정을 사용합니다. 일반화된 추정 방정식을 통해 반복되는 측정 데이터를 분석합니다.

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결과

통증 행동 테스트
MWT 결과는 모델링 후 오른쪽 뒷다리의 MWT가 이전보다 현저히 낮은 것으로 나타났습니다(p<0.05). 대조군과 비교하여, 래트의 MWT는 Tuina (p<0.05; 그림 5 및 표 2).

figure-results-1
그림 5. 기계적 인출 역치 테스트(figure-results-2, Newton)

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토론

이 연구는 KOA 쥐에 대한 Tuina 조작에 대한 프로토콜을 제공합니다. 통증 행동 테스트와 조직형태학적 소견을 통해 KOA 쥐에 적용된 이러한 일련의 Tuina 조작이 활막 염증과 연골 세포 사멸을 감소시킬 수 있음을 시사했으며, 이는 KOA 동물 모델에 대한 Tuina 조작의 참고 자료가 될 수 있습니다.

프로토콜 중에는 몇 가지 중요한 절차가 있습니다. 첫째, KOA 모델을 유도하기 위한 적절한 방법을 선택하는 것이 중요합니다. KOA 모델을 유도하기 위한 방법은 관절강주사(25), 관절내 수술(intra-articular surgery)26,27, 관절제동법(joint brakeking method)28,29 등 다양하다.

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공개 사항

저자는 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.

감사의 글

이 작업은 Shanghai Critical Clinical Specialties Construction Project(보조금 번호: Shslczdzk04001)의 지원을 받았습니다. 상하이 과학 기술위원회의 항해 프로그램 (보조금 번호 : 22YF1444300); Shanghai University of Traditional Chinese Medicine(허가 번호: 2021LK091)의 예산 범위 내 프로젝트.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
절대 에탄올SupelcoPHR1070표본
ALMEMO admeasuring 장치ahlborn2450-1기계적 철수 임계 값 테스트
안티 디곡신 항체Sigma-AldrichSAB4200669HE 염색 IHC 또는 TUNEL
Anti-IL-1 betaabcamab283818HE 염색 IHC 또는 TUNEL
DAB 기판 키트SolarbioDA1010HE 염색 IHC 또는 TUNEL
치아 보철 기본 재료상하이 새로운 세기20000356모델 제작
eosinbioswamp PAB180016 HE 얼룩 IHC 또는 TUNEL의 경우
손가락 압력 기록Suzhou Changxian Optoelectronic TechnologyCX1003wFor Tuina manipulation
formic acid solutionSigma-Aldrich695076석회화
H2O2Sigma-Aldrich386790-MHE 염색 IHC 또는 TUNEL
hematoxylinbioswamp PAB180015HE 염색 IHC 또는 TUNEL
IsofluraneShanghai Yuyan Scientific Instrument CompanyS10010533가스 마취
중성 수지바이오스왐PAB180017HE 얼룩 IHC 또는 TUNEL
파라포름알데히드 고정 용액시그마-알드리치100496조직학 PBS
시그마-알드리치P3813HE 염색 IHC 또는 TUNEL
발바닥 테스트 장치IITC 생명 과학/발 철수 테스트
스터 파리 붕대WANDE20150023모델 제작용
Proteinase KSigma-Aldrich124568For HE stain IHC 또는 TUNEL
TNF Alpha Monoclonal AntibodyProteintech60291-1-IGFor HE stain IHC 또는 TUNEL
TUNEL ServicebioGDP1042HE 얼룩 IHC 또는 TUNEL
왁스시그마 알드리치327204표본
자일렌상하이 Sinopharm 그룹100092표본 제작
프; 플라

참고문헌

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