방법 논문

파킨슨병 모델에서 미토콘드리아 형태학의 조직학적 검사

2.7K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/65453

⸱

2023년 6월 23일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Achucarro Basque Center for Neuroscience, 2Department of Neuroscience, University of the Basque Country (UPV/EHU), 3Ikerbasque - Basque Foundation for Science, 4Oxford Parkinson’s Disease Centre and Department of Physiology, Anatomy and Genetics, University of Oxford

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

본 연구는 생쥐 뇌 조직의 면역염색 및 영상 분석을 기반으로 미토콘드리아의 형태를 분석하는 방법을 제시 한다. 또한 이를 통해 파킨슨병 모델에서 단백질 응집에 의해 유도된 미토콘드리아 형태의 변화를 감지할 수 있는 방법을 설명합니다.

초록

미토콘드리아는 세포의 에너지 대사에 중심적인 역할을 하며, 미토콘드리아의 기능은 높은 에너지 요구량으로 인해 뉴런에 특히 중요합니다. 따라서 미토콘드리아 기능 장애는 파킨슨병을 포함한 다양한 신경 장애의 병리학적 특징입니다. 미토콘드리아 네트워크의 모양과 조직은 매우 가소적이어서 세포가 환경적 신호와 요구에 반응할 수 있으며, 미토콘드리아의 구조도 세포의 건강과 밀접하게 연결되어 있습니다. 여기에서는 미토콘드리아 단백질 VDAC1의 면역염색 및 후속 이미지 분석을 기반으로 미토콘드리아 형태를 in situ 연구하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 공구는 미토콘드리아 조사에 있는 미묘한 다름을 검출할 수 있고 α-synuclein의 집합체에 의해 유도된 모양, Parkinson의 병리학에서 몹시 포함된 집합 수그린 단백질 검출할 수 있기 때문에 neurodegenerative 무질서의 학문을 위해 특히 유용할 수 있었습니다. 이 방법을 통해 pS129 병변을 품고 있는 substantia nigra pars compacta dopaminergic neuron이 미리 형성된 fibril intracranial injection Parkinson 모델에서 건강한 이웃 뉴런과 비교하여 미토콘드리아 단편화(감소된 종횡비, AR에 의해 제안됨)를 나타낸다고 보고할 수 있습니다.

서론

중추 신경계는 ATP에 대한 수요가 강합니다: 뉴런은 ATP를 사용하여 이온 구배, 신경 전달 물질 합성, 시냅스 소포 동원, 방출 및 재활용을 지원하고 국소 단백질 번역 및 분해를 가능하게 합니다. 뇌에서 사용되는 ATP의 95% 이상은 미토콘드리아1에 의해 생성된다. 따라서 미토콘드리아 기능 장애가 뉴런에 특히 해롭다는 것은 놀라운 일이 아닙니다. 실제로 미토콘드리아 기능 장애는 파킨슨병(PD) 및 알츠하이머병(AD)과 같은 신경 퇴행성 질환을 포함한 여러 신경 질환에서 중요한 역할을 합니다.2,3

여러 유전자는 Parkin 4,5,6, PTEN-induced kinase 1 (PINK1)7,8 및 DJ-19와 같이 미토콘드리아 기능 및 항상성과 관련된 PD 인코딩 단백질과 명백히 연결되어 있습니다. PD에서 미토콘드리아 기능 장애의 역할에 대한 추가 증거는 미토콘드리아 전자 전달 사슬의 복합체 I 억제제(예: 로테논 및 MPTP)를 사용한 치료가 시험관 내 및 생체 내PD의 여러 측면을 재현한다는 것입니다 10. 그러나 많은 병리학적 과정이 미토콘드리아 결핍과 함께 PD의 신경 세포 손실을 유발할 수 있음을 명시하는 것이 중요합니다: 산화 스트레스, 칼슘 항상성 변화, 유비퀴틴-프로테아좀 및 자가포식-리소좀 시스템의 실패, 단백질 응집이 가장 많이 연구된 것 중 하나입니다(11,12,13 및).

미토콘드리아는 모양이 이질적이며, 개별 단위 외에도 일반적으로 확장된 망상 및 관형 네트워크로 발견됩니다. 미토콘드리아의 구조와 세포 위치는 미토콘드리아의 기능에 매우 중요하다14; 사실, 미토콘드리아 네트워크는 매우 역동적이며, 세포의 필요를 충족시키고 환경적 신호에 반응하기 위해 핵분열, 융합 및 미토파지의 빈번한 과정을 거친다15,16. 또한 미토콘드리아의 형태는 건강 상태와 밀접한 관련이 있습니다. 예를 들어, 인간의 시신경 위축에서 미토콘드리아 활동을 감소시키는 유전적 돌연변이는 비정상적이고 가늘고 과융합된 미토콘드리아를 유발한다17. 한편, 미토콘드리아 기능에 해로운 영향을 미치는 미토콘드리아 단편화 또는 과도한 미토콘드리아 융합을 포함한 다양한 인간 질병이 비정상적인 미토콘드리아 형태를 나타냅니다(18년 검토). PD의 맥락에서, 우리와 다른 사람들은 이전에 비정상적인 미토콘드리아 모양이 α-시누클레인 응집체에 대한 반응으로 기능 장애와 상관관계가 있음을 보여주었다19. 미토콘드리아 형태학은 PD 및 기타 질병의 맥락에서 시험관 내에서 광범위하게 연구되어 왔지만 20,21,22 in vivo 섹션에서 미토콘드리아 형태를 평가하기 위한 프로토콜은 부족합니다. 이로 인해 PD와 같은 질병의 맥락에서 미토콘드리아의 생체 내 연구는 형질전환 동물23 또는 세포 분해능을 제공할 수 없는 중뇌 추출물의 평가에 크게 의존하게 됩니다.

여기에서는 미토콘드리아 단백질 VDAC124의 면역염색 후 파라핀이 포매된 조직 절편의 이미지 분석을 기반으로 기능 상태 및 건강의 지표로서 미토콘드리아 형태를 제자리에서 연구하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 우리는 또한 시험관 내 및 생체 내 PD 모델에서이 프로토콜의 결과를 보여줍니다 : SNCA (Synuclein Alpha)를 과발현하는 신경 모세포종 세포와 α-synuclein Pre-Formed Fibrils (PFFs)의 두개내 주사를 받은 마우스의 뇌 조직. α-시누클레인(세포에서) 또는 phosphoSer129-α-synuclein pS129(쥐 뇌에서)에 대한 항체로 공동 면역염색을 통해 샘플에서 집합 단백질 병리(각각 과발현된 α-시누클레인 및 α-시누클레인 피브릴)가 있는 세포를 식별할 수 있었고 음성 세포는 동일한 샘플 내에서 비병리학적 대조군 역할을 했습니다. 이 분석과 여기에 설명된 데이터를 통해 감소된 종횡비가 관찰되었으며, 이는 SNCA를 과발현하거나 pS129 병변을 나타내는 세포에서 미토콘드리아의 단편화를 나타냅니다.

프로토콜

이 섹션에 설명된 모든 절차는 바스크 대학교 참조 M20/2022/212, 바스크 지방 정부, 스페인 정부 및 유럽 연합에서 제공한 윤리 프레임워크에 따라 수행되었습니다.

1. SNCA 과발현 SH-SY5Y 세포의 미토콘드리아 형태 분석

참고: 여기에서는 연구를 위한 시험관 내 물질의 생성에 대한 간략한 설명이 제공되며, 이는 현장에서 얻은 결과를 비교하는 역할을 합니다. 이러한 유형의 분석은 미토콘드리아 형태에 대한 생체 내 실험을 시작하기 전에 수행하는 것이 좋으며, 이는 모든 적절한 이미징 및 분석 설정이 제자리에 있는지 확인하기 때문입니다.

  1. 평평한 광학 바닥 96웰 플레이트에서 세포 부착을 증가시키고 세포 접착을 촉진하려면 피펫팅을 통해 DMEM F12에 코팅 매트릭스 1:1000의 25μL/웰을 추가합니다( 재료 표 참조). 플레이트를 37 ° C 및 5 % CO2 에서 1 시간 동안 배양합니다.
  2. Neubauer 챔버를 사용하여 SH-SY5Y를 계산합니다. 피펫팅으로 코팅 매트릭스를 제거하고 10% FBS, 2mM 글루타민 및 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 DMEM F-12의 50μL/웰에 코팅된 96웰 플레이트에 10.000세포/웰을 파종합니다( 재료 표 참조).
  3. 세포를 37 °C 및 5 % CO2에서 24 시간 동안 배양합니다.
  4. 인간 야생형 SNCA를 운반하는 pcDNA3.1 250ng, transfection 시약 0.250μL, transfection adjuvant 0.250L, 각 웰에 대해 최대 50μL의 transfection 배지를 혼합물로 준비합니다( 재료 표 참조). 실험의 총 웰 수를 고려하여 마스터 솔루션을 준비합니다.
  5. 수동 피펫팅으로 배양 배지를 제거하고 피펫팅을 통해 1.4단계에서 준비한 용액 50μL/웰을 추가합니다. 37 °C, 5 % CO2 에서 배양합니다.
  6. h 형질주입 후 피펫팅을 통해 형질주입 배지를 제거하고 PBS에 4% 파라포름알데히드(PFA)의 25μL/웰을 추가합니다.
    주의: 파라포름알데히드는 독성 고정제입니다. 적절한 PPE를 사용하십시오.
  7. 실온(R.T)에서 5분간 배양합니다. 피펫팅으로 정착액을 제거하고 50μL/웰의 PBS를 추가하여 한 번 세척합니다. 파이펫팅을 통해 PBS를 제거합니다.
  8. 0.05% 트윈(TBS-T) 및 10% 일반 당나귀 혈청(NDS, 재료 표 참조)이 포함된 TBS 25μL/웰 피펫. 불특정 신호를 차단하기 위해 R.T.에서 1시간 동안 배양합니다.
  9. 분석할 웰의 수에 따라 TBS-T에서 Mouse-anti-α-synuclein 항체 MJFR1 1:1000과 Mouse-anti-TOMM20 항체 1:100의 용액을 준비합니다( 재료 표 참조).
  10. 피펫팅을 통해 1.8단계에서 차단 용액을 제거하고 1.9단계에서 준비한 1차 항체 혼합물 25μL/웰을 추가합니다. 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
  11. 1차 항체 용액을 제거하고 피펫팅으로 TBS-T 50μL/웰을 추가 및 제거하여 3회 세척합니다.
  12. 분석할 웰의 수에 따라 TBS-T( 재료 표 참조)에서 녹색 2차 항체 항-Mouse 1:1000과 적색 2차 항체 항-Rabbit 1:1000의 용액을 준비합니다.
  13. 단계 1.11에 기술된 마지막 세척에서 PBS를 흡인한 후, 피펫을 사용하여 2차 항체 혼합물 25μL/웰을 첨가하고 R.T.에서 1시간 동안 플레이트를 배양합니다.
  14. 피펫팅을 통해 2차 항체 용액을 제거하고 TBS-T에 2g/mL DIPI의 25μL/웰을 추가합니다. R.T.에서 5분 동안 플레이트를 배양합니다.
  15. 피펫을 사용하여 DAPI 용액을 제거하고 피펫으로 TBS-T 50μL/웰을 추가 및 제거하여 3회 세척합니다.
  16. PBS 80μL/웰을 0.02% 아지드화나트륨으로 피펫팅하고 플레이트를 4°C에서 보관합니다.
    주의 : 아지드 나트륨은 독성이 있습니다. 적절한 PPE를 사용하십시오.
  17. High-Content 자동 형광 현미경 또는 60x 대물렌즈가 장착된 동등한 컨포칼 이미징 시스템을 사용하여 이미지를 캡처합니다( 재료 표 참조).
  18. 20-3.15단계에 따라 Fiji를 사용하여 단일 셀의 TOMM3.21 신호 분석을 수행합니다. 세포사멸, 괴사 또는 유사분열을 겪는 세포를 피하십시오.
    참고: 이를 위해 세포 수축, 막 번짐, 세포 분리, 핵 응축, DNA 단편화 및 단일 평면에 정렬된 두꺼운 가닥으로 조직된 응축된 핵 크로마틴과 같이 현미경으로 볼 수 있는 세포 사멸, 괴사 또는 유사분열의 형태학적 특징을 보여주는 세포를 분석에서 제외합니다.

2. 마우스에서 PFF 및 PFF 두개내 주사의 생성

참고: 주입 재료의 생성과 두개내 주입 과정이 여기에 제시되어 있습니다. 이 프로토콜은 Luk et al.25에서 채택되었습니다.

  1. PFF를 얻으려면 0.5mL의 α-Syn(5mg/mL; 펩타이드, 재료 표 참조) 37 °C 및 250 rpm에서 7 일 동안 셰이커에서 α-synuclein의 응집을 유도합니다.
  2. 최적의 단편화가 달성되고 투과 전자 현미경으로 샘플의 음성 염색에 의해 관찰 될 때까지 20 % 진폭 및 0.25 사이클 듀티에서 집계 된 α- 시누클레인을 초음파 처리합니다.
  3. 선조체 PFF 주사를 위해 수컷 및 암컷 야생형 C57Bl/6 마우스(3개월령)를 준비하기 위해 Meloxicam/Metacam(5mg/kg)을 식염수에 피하 투여합니다. 또한 동물당 0.5mL 피하 주사 2회 를 통해 멸균 식염수 1mL를 투여합니다. 이러한 치료법은 탈수, 염증 및 통증을 예방한다.
  4. 유도 챔버에서 4% 이소플루란과 0.7L/minO2 로 마취를 유도합니다. 페달 반응의 부족으로 마취 깊이를 확인하십시오.
  5. 마우스 머리의 윗부분을 면도하고 열 매트의 정위 장치 프레임에 동물을 부드럽게 삽입합니다.
  6. 전체 주입 과정에서 안면 마스크를 통해 동물 흡입 마취(0.7L/min O2의 1%-2% 이소플루란)를 제공하여 마취면을 유지합니다.
  7. 동물을 정위 프레임에 놓습니다. 클로르헥시딘 스크럽과 70% 에탄올을 번갈아 가며 3회 사용하여 수술 부위를 소독합니다. 마르케인/부피바카인을 국소적으로(약 100μL) 0.25%의 피하 침윤으로 도포합니다.
  8. 피부를 0.5cm 절개하여 두개골을 노출시키고 두개골에 직경 1mm의 구멍을 뚫어 뇌 표면을 노출시킵니다. - 0.5mm 전후방, +/- 2.5mm 내측.
  9. 2.2단계에서 얻은 PFF 1.5L를 32G Hamilton 주사기로 100nl/min의 유속으로 Bregma에서 2.8단계와 -2.7mm 배쪽(상부 뇌에서)에 표시된 좌표에 정위 전달하여 주입합니다. 주사 후 5분 후에 주사기를 빼냅니다.
  10. 봉합사 (크기 : 4-0, 45cm, 재료 표 참조)는 필요에 따라 3-5 바늘로 상처를 꿰매고 각각 2 개의 이중 매듭으로 결합 한 다음 단일 매듭으로 결합합니다. 마취제 흡입을 중지하고 프레임에서 마우스를 제거합니다.
  11. 마우스를 홈 케이지로 되돌리기 전에 적절한 복구 케이지에서 회복하도록 두십시오.
  12. 그 다음 주에는 매일 수술 후 점검을 실시하십시오. 모든 동물의 통증, 고통 또는 불편함은 24시간마다 2.3단계에 표시된 대로 Meloxicam/Metacam을 투여해야 합니다.
  13. 3개월 후, 복강 내 주사를 통해 식염수에 펜토바르비탈 나트륨 200mg/mL 300μL를 주입합니다. 통증 반사가 사라지면 가슴을 절개(2-3cm)하고 갈비뼈를 들어 올려 심장을 노출시킵니다.
  14. 23G 나비 바늘에 연결된 50mL 주사기를 사용하여 5mL/분에서 PBS에서 10mL의 PBS와 35mL의 4% 파라포름알데히드를 차례로 심 관류합니다.
  15. 뇌를 제거하고 4 ° C에서 24 시간 동안 4 % PFA에 포스트 픽스를 넣습니다. PFA 처리 후 4°C에서 70% 에탄올에 보관하십시오.
  16. 뇌를 적절한 플라스틱 임베딩 상자( 재료 표 참조)에 넣고 R.T.에서 95% 에탄올에서 1시간 동안 배양합니다. 신선한 95% 에탄올에서 단계를 반복하고 1시간 동안 다시 배양합니다.
  17. R.T.에서 1시간 동안 뇌를 100% 에탄올로 옮기고 신선한 100% 에탄올로 단계를 반복하고 1시간 동안 다시 배양합니다.
  18. 뇌를 자일렌 또는 자일렌으로 옮기고 R.T.에서 1시간 동안 대체합니다. 신선한 용액에서 반복하고 1시간 동안 다시 배양합니다.
  19. 크실렌 또는 크실렌 대체품을 제거하고 샘플을 따뜻한 파라핀에서 1시간 동안 배양합니다. 파라핀을 교체하고 한 시간 더 배양합니다.
  20. 따뜻한 파라핀으로 뇌를 임베딩 박스에 장착하고 밤새 말리십시오. 마이크로톰( 재료 표 참조)을 사용하여 5μm 절편을 준비하고 유리 슬라이드에 장착합니다.

3. PFF 주입 마우스의 파라핀 포매 뇌 절편에 대한 면역조직화학에 의한 미토콘드리아 형태 분석

  1. 슬라이드를 크실렌 대용품에 10번 담가 왁스를 제거합니다. 슬라이드를 자일렌 대용품에서 2분 동안 배양합니다. 크실렌 대용품에 다시 10번 담그십시오.
    참고: 이 단계는 파라핀을 제거하고 샘플의 재수화를 활성화하는 데 필요합니다.
  2. 재수화: 100% EtOH, 95% EtOH, 70% EtOH 용액으로 3.1단계에서 설명한 절차를 반복하고 ddH2O를 순서대로 두 번 반복합니다.
  3. 아래 단계에 따라 항원 회수 및 면역염색을 수행합니다.
    1. 먼저 샘플을 ddH2O가 있는 전자레인지용 용기에 옮깁니다.
    2. 4°C에서 보관된 100x 구연산염 완충액 pH 6( 재료 표 참조)을 예열하고(세제가 침전되었을 수 있음) 신선한 1x 구연산염 완충액 350mL를 준비합니다. 그런 다음 구연산염 완충액을 뚜껑이 있는 편리한 플라스틱 용기에 붓습니다.
    3. 슬라이드를 구연산염 버퍼 용기에 넣고(중요: 슬라이드가 버퍼 수준 아래에 있는지 확인) 뚜껑을 덮습니다.
      주의 : 뚜껑이 완전히 닫히지 않았는지 확인하십시오., 그렇지 않으면 용기가 전자레인지에서 터질 수 있습니다.
    4. 700W에서 전자레인지: 4분 + 5분 휴식, 1.5분 + 5분 휴식. 구연산염 완충액을 보충하고 전자레인지에 다시 1.5분 + 5분 휴식, 1.5분 + 5분 휴식, 1.5분 + 5분 휴식.
    5. 얼음 위의 구연산염 완충액에 있는 샘플을 20분 동안 식힙니다. ddH2O로 샘플을 세척합니다.
      참고: 항원 검색은 특정 항체 요구 사항에 따라 달라질 수 있습니다.
  4. 조직을 만지지 않고 종이 타월로 샘플 슬라이드를 건조시킵니다. 티슈 조각 주위에 pap 펜( 재료 표 참조)으로 직사각형을 그립니다.
  5. 모든 슬라이드를 슬라이드 면역 염색 상자에 옮기고 TBS + 0.05% 트윈(TBS-T)으로 부드럽게 몇 번 세척합니다. TBS-T 방울이 pap-pen 사각형 안에 있는지 확인하십시오.
  6. 종이 타월을 두드려 샘플에서 TBS-T를 제거합니다. 50μL의 차단 용액(TBS-T의 경우 10% NDS)을 각 직사각형(조직을 건드리지 않고)에 넣고 RT에서 1시간 동안 배양합니다.
    알림: 볼륨은 조직의 크기에 따라 다를 수 있습니다. (1) PAP-penned 영역이 샘플 간에 유사하고 (2) 영역이 선택한 버퍼 부피로 완전히 덮여 있는지 확인하십시오.
  7. 종이 타월을 두드려 샘플에서 차단 용액을 제거합니다. TBS-T: 항-티로신 하이드록실라제 1:250과 항-VDAC1 1:100 및 항-pSer129 α-시누클레인 EP1536Y 1:2000의 1차 항체 혼합물을 50μL/직사각형으로 부드럽게 피펫팅합니다( 재료 표 참조).
  8. 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
  9. 슬라이드에 TBS-T를 피펫팅하여 세척하고 종이 타월을 두드려 제거합니다. 세 번 반복합니다.
  10. TBS-T에서 녹색 2차 항 닭, 적색 2차 항 마우스 및 원적색 2차 항 토끼 1:1000의 2차 항체 혼합물 50μL/직사각형을 피펫팅하여 추가합니다( 재료 표 참조). 어두운 곳에서 37°C에서 1시간 동안 배양합니다.
  11. 3.13단계에서 설명한 대로 TBS-T로 세 번 세척합니다.
  12. TBS-T에서 DAPI 2 μg/mL로 1분 동안 배양합니다. 종이 타월을 두드려 DAPI 솔루션을 제거합니다. 3.13단계에서 설명한 대로 TBS-T로 세 번 세척합니다.
  13. 장착 시약의 슬라이드당 2방울을 사용하여 샘플에 유리 커버슬립을 장착합니다( 재료 표 참조). 커버슬립을 부드럽게 눌러 기포를 제거하고 샘플을 R.T.에서 1시간 동안 건조시킨 후 어두운 곳에서 4°C에서 보관합니다.
  14. 60x 오일 대물렌즈 또는 컨포칼 기술이 장착된 구조화된 조명 형광 이미징 시스템을 사용하여 다양한 분야에서 최소 50개의 세포를 이미징합니다.
  15. 다음 단계에 표시된 대로 Fiji를 사용하여 단일 셀의 VDAC1 신호 분석을 수행합니다.
    1. 먼저 양수 또는 음수 셀 주위에 등고선을 그리고(적절한 경우) "자르기" 기능을 사용하여 관심 영역(ROI) 을 선택하고 분리합니다. ROI 선택의 편향을 피하려면 분석과 관련이 없는 마커(즉, 미토콘드리아 마커가 아님)의 형광 신호를 고려하여 선택합니다.
  16. 선택 사항: 이미지가 과도하게 픽셀화된 경우 "부드럽게" 기능을 사용하여 더 높은 가장자리 선명도를 얻습니다.
    참고: 스무스 기능을 이미지에 적용하는 경우 이후의 모든 이미지에 적용하십시오.
  17. 선택 사항: "Convolve" 기능( 프로세스 > 필터의 커널 모드)을 사용하여 배경을 줄입니다.
    알림: 이것은 선택 사항이며 섹션의 얇은 특성으로 인해 5m 섹션을 사용할 때는 일반적으로 필요하지 않습니다.
  18. 형상 설명자를 활성화하고 "측정 설정" 기능에서 임계값 옵션을 제한합니다(분석을 통해 활성화되었는지 확인).
  19. "조정" 메뉴에서 임계값 기능을 선택하고 임계값 수준을 조정합니다. 동일한 샘플의 모든 셀에 대해 임계값 설정을 유지해야 합니다.
    1. 이 기사의 대표 이미지에 표시된 것처럼 미토콘드리아 네트워크의 적절한 시각화를 보장하면서 배경 픽셀을 버리십시오.
  20. 분석 탭의 파티클 분석 도구를 사용합니다. 미토콘드리아를 포착하기 위해 적절한 크기를 설정합니다. 이 예제에서는 size: 25-Infinity, activate: Pixel units, Show: Masks 명령을 선택하여 결과를 시각화했습니다. Fiji는 개수, 종횡비(AR) 및 기타 형상 매개변수를 계산하여 새 패널에 표시합니다.
  21. 데이터에 대한 통계 분석을 적절하게 수행합니다. 이 실험에서 t-검정은 D'Agostino 및 Pearson 정규성 검정을 사용한 정규성 검정 후 피지에서 실험 그룹 간에 계산한 평균 종횡비(AR) 및 개수의 차이를 분석하는 데 사용되었습니다.

결과

조직 내 미토콘드리아 형태학의 현장 평가를 위한 적절한 이미징 및 분석 조건이 마련되어 있는지 확인하기 위해, 알려진 미토콘드리아 형태 조절제에 반응하여 미토콘드리아 형태학의 시험관 내 탐색이 권장됩니다(섹션 1). 예를 들어, SNCA는 SH-SY5Y 세포에서 유전적으로 과발현되어 앞서 설명한 바와 같이 미토콘드리아 형태학의 변화를 유도하였다26. 미토콘드리아 형태를 악화시키는 대조군으로 사용될 수 있는 다른 모욕은 굶주림이나 MPP+와 같은 미토콘드리아 활동 억제제의 사용입니다. 세포를 형질주입하고 α-시누클레인(AS)에 대해 염색하여 SNCA+(AS+) 및 SNCA-(AS-) 세포를 분리했습니다. 또한 세포의 미토콘드리아 네트워크를 시각화하기 위해 TOMM2027 로 염색했습니다. 이 분석을 5μm 조직 절편의 분석과 최대한 유사하게 만들기 위해 여러 평면의 최대 투영이 아닌 하나의 공초점 평면을 분석했습니다. TOMM20의 한 공초점면에 대한 형태학적 분석은 SNCA 과발현에 대한 반응으로 미토콘드리아의 총 수와 종횡비 또는 AR(세포소기관의 신장과 상관 관계가 있음)이 모두 감소한 것으로 나타났습니다(그림 1).

상기 프로토콜 섹션에 설명된 대로 PFF를 주입한 동물의 5μm 파라핀 포매 마우스 뇌 절편에서 미토콘드리아 단백질 VDAC1에 대해 면역염색을 수행했습니다. 파킨슨병에서 변성을 겪는 흑질(substantia nigra pars compacta, SNc) 도파민성 뉴런은 항티로신 하이드록실라제(anti-tyrosine hydroxylase, TH)와의 동시 면역염색을 통해 밝혀졌으며, 복측피개영역(ventral tegmental area)과 흑질(substantia nigra pars lateralis)에서 국소적으로 분리되었다. 반면에, 항-phosphoSer129-α-synuclein(pS129) 염색을 통해 pS129 병변이 있는 세포와 건강한 세포를 구별할 수 있었습니다(pS129+ 대 pS129-). 세 가지 다른 동물의 SNc 이미지를 촬영한 후 TH 양성 뉴런의 VDAC1 염색에 대한 후속 이미지 분석을 통해 pS129 병변이 있는 뉴런과 이러한 병변이 없는 뉴런 사이의 미토콘드리아 수 수와 종횡비가 모두 감소한 것으로 나타났습니다(그림 2). 이러한 결과는 pS129 병변이 있는 뉴런의 미토콘드리아 형태가 pS129 병변이 없는 세포에 비해 손상되었음을 나타냅니다.

이 특정 실험은 AR의 감소를 보여주어 미토콘드리아 형태의 악화를 나타내는 전체 수의 감소와 함께 미토콘드리아의 신장 감소를 강조하지만 데이터 해석은 실험에 따라 달라야 합니다. 예를 들어, AR과 개수의 감소는 미토콘드리아 함량의 전반적인 감소와 단편화를 가리킬 수 있는 반면, AR의 감소는 있지만 전체 개수의 증가는 미토콘드리아 단편화 표현형을 가리킬 수 있습니다. 따라서 두 측정값의 컨텍스트에서 데이터를 해석하는 것이 중요합니다.

figure-results-1
그림 1: SNCA의 미토콘드리아 형태 과발현 in vitro 모델. SNCA 과발현 및 과발현되지 않은(각각 AS+ 및 AS-) 세포(A)에서 TOMM20(녹색), α-시누클레인(AS, 빨간색) 및 DAPI(파란색)에 대한 공동 면역염색. AS- 셀(B) 및 AS+ 셀(C)의 세부 정보. 패널 (B)와 (C)의 흑백 이미지는 프로토콜 섹션에서 설명한 피지 기능을 적용한 후의 TOMM20 신호의 마스크를 나타냅니다. 이 마스크를 사용하면 결과 구조의 모양을 정량화할 수 있습니다. AS- 및 AS+ 세포의 미토콘드리아 수 및 종횡비(AR) 값(조건당 N = 25개 세포)을 정량화하여 개별 값과 평균 ± SEM으로 표현했습니다. **p-값 < 0.05 t-검정(D). 정상성은 D'Agostino 및 Pearson 정규성 검정을 통해 평가되었습니다. 스케일 바: A, 30 μm; B,C, 5 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-2
그림 2: 미토콘드리아 형태는 pS129 병변이 있는 뉴런에서 영향을 받습니다. PFF 주입 마우스(A)의 SNc의 TH(녹색), VDAC1(빨간색), phosphoS129-α-synuclein(자홍색) 및 DAPI(파란색)에 대한 공동 면역염색. phosphoS129-α-synuclein-negative(pS129-) 도파민 뉴런(B) 및 phosphoS129-α-synuclein-positive(pS129+) 도파민 뉴런(C)의 세부 정보. 패널 (B)와 (C)의 흑백 이미지는 프로토콜 섹션에서 설명한 피지 기능을 적용한 후의 TOMM20 신호의 마스크를 나타냅니다. 이 마스크를 사용하면 결과 구조의 모양을 정량화할 수 있습니다. 음성 및 양성 세포는 개별 그래프 값(파란색, 녹색 및 주황색)의 서로 다른 색상으로 설명되는 것처럼 세 가지 다른 동물의 샘플에서 계산되었습니다. 도파민성 뉴런에서 pS129-(N=29) 대 pS129+(N=22)의 미토콘드리아 수 및 AR 정량화는 개별 세포 값뿐만 아니라 평균 ± SEM으로 표현되었습니다. **p-값 < 0.05 t-검정(D). 정상성은 D'Agostino 및 Pearson 정규성 검정을 통해 평가되었습니다. 스케일 바: A, 30 μm; B,C, 5 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

전반적으로, 이 연구는 이미지 분석과 결합된 면역염색이 미토콘드리아 형태를 분석하는 신뢰할 수 있는 방법임을 보여줍니다. 사실, 미토콘드리아의 수뿐만 아니라 세포 배양과 조직 모두에서 종횡비와 같은 일부 형태학적 매개변수를 정량화할 수 있습니다. 미토콘드리아의 수는 샘플의 핵분열 및 융합 메커니즘의 기능적 상태와 직접적으로 관련이 있는 반면, AR 값은 세포소기관의 신장에 의존합니다. 이 방법은 변형된 미토콘드리아 형태, 역학 및 기능이 잘 알려진 병리학적 메커니즘인 PD 모델에서 미토콘드리아 이상을 신속하게 평가하는 데 특히 유용할 수 있습니다28,29. α-synuclein는 또한 PD에 있는 관련된 역할을 한다: 실제로, α-synuclein는 Lewy Bodies, PD 환자30의 사후 진단을 위해 이용되는 세포질 섬유질 집합체의 분대의 한개이다. 더욱이, SNCA 유전자의 돌연변이는 익숙한 PD와 산발적인 PD 환자 모두에서 발견되었다(31년 검토). Ser129에 α synuclein의 인산화는 광대하게 PFF 모욕 후에 나타나고 각종 유독한 효력32,26를 유도하는 Lewy 몸 같이 병리학을 레테르를 붙이기 위하여 보였습니다.

여기에 제시된 도구를 사용하여 과발현 및 집계된 α-synuclein(α-synuclein-staining 및 phosphoSer129α-synuclein-positive 병변을 갖는 뉴런)이 있는 세포와 α비교하여 미토콘드리아 수 및 AR 값의 감소를 감지할 수 있었습니다. 이러한 결과는 직접적인 α-시누클레인-미토콘드리아 상호작용이 PD의 미토콘드리아 기능 및 항상성에 대한 독성 효과를 어떻게 생성하는지 보여주는 이전 보고서와 일치한다26,33 34. 실제로, α-synuclein 돌연변이를 가진 마우스는 증가된 미토콘드리아 DNA 손상35 및 미토파지36,37을 나타낸다고 보고되었습니다. 또한, 증가된 α-시누클레인 수치가 미토콘드리아 분열/단편화를 촉진하고, 미토콘드리아 내에서 활성 산소 종을 유도하며, α-시누클레인 26,38,39를 과발현하는 세포주 및 마우스 모델에서 미토콘드리아 단백질 발현을 조절하지 못한다고 설명되었습니다.

이 도구는 연구에 사용된 항체에 크게 의존한다는 점을 강조하는 것이 중요합니다. 사용된 항체 염색에 대한 신중한 형태학적 평가는 적절한 세포 내 구획을 검출하는 데 필수적입니다. 이 기술은 5μm 절편을 기반으로 하므로 미토콘드리아 구조 분석을 위해 단일 초점면이 필요하기 때문에 이 방법으로 미토콘드리아 형태의 미묘한 차이를 감지하지 못할 수 있으므로 표현형이 없어도 표현형의 존재를 배제할 수 없습니다.

이 연구와 다른 연구들은 이전에 생체 내미토콘드리아 형태학을 평가하기 위해 유사한 접근법을 사용했지만, 이 평가를 위해 연구 커뮤니티가 상세한 프로토콜에 접근할 수 있도록 할 필요가 있습니다. 이 연구의 의의는 이 방법을 다양한 생체 내 질환 모델에 적용하여 미토콘드리아 형태학적 이상을 평가하고 잠재적인 병리를 식별할 수 있으며, 이는 궁극적으로 이러한 질환 치료를 위한 납 화합물의 스크리닝을 용이하게 할 수 있다는 것입니다. 이 분석은 현재 파라핀이 포함된 조직으로 제한되어 있지만, 이 방법의 장점은 말단 조직 수집 후 모든 질병 모델에 적용할 수 있어 매우 다재다능한 도구라는 것입니다.

공개 사항

이해 상충이 없는 경우 보고하고자 합니다.

감사의 글

우리는 이 연구의 자금 제공자, 특히 Ikerbasque, 스페인 과학 혁신부, Michael J Fox Foundation, IBRO 및 Achucarro Basque Center for Neuroscience에 감사드립니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
32 G Hamilton 주사기Hamilton7632-01
4',6-diamidino-2-fenilindol, dihidrocloruro (DAPI)InvitrogenD1306
4/0 USP 45 cm 봉합SSa90 pga 32345n-36u
Alexa fluor 488/594-Donkey 안티-마우스 인비트로젠A21202; A21203녹색/빨간색 염료-당나귀 안티-
마우스 알렉사 플루어 594/647-당나귀 안티-토끼 InvitrogenA21207 A31573빨강/원빨강 염료-당나귀 항토끼
AlexaFluor 488-당나귀 항닭 Jackson ImmunoResearch703-545-155green dye-Donkey anti-Chicken
Anti-PSer129 α-synuclein EP1536Y (Rabbit) 항체Abcamab51253
Anti-TOM 20 (Mouse) 항체Santa Cruzsc-17764
Anti-Tyrosine Hydroxylase (Chicken) 항체Abcamab76442
Anti-VDAC1 (Mouse) 항체Santa Cruzsc-390996
항-&알파;-시누클레인 항체 MJFR1 (Rabbit)Abcamab138501
구연산염 완충액 100X 스톡: 120mM 구연산염 완충액, 5% 물에 트윈(pH 6)
일회용 베이스 몰드 Fisher22-363-553플라스틱 임베딩 박스
D-MEM F12GibcoA321331020
EVOS M7000 이미징 시스템ThermoFisher Scientific고함량 자동 형광 현미경
태아 소 혈청Gibco 10270106
평면 광학 바닥 96 웰 플레이트 Greiner675090
FluorSave 시약Millipore345789-20ML마운팅 시약
글루타민 200 mMGibco25030-024
ImmEdge 소수성 장벽 펜Vector LaboratoriesH-4000PAP-pen
Lipofectamine 및 Plus 시약 Invitrogen11668-019; 11514-015트랜스펙션 시약 및 트랜스펙션 보조제
MatrigelCorning354230코팅 매트릭스
마이크로톰ThermoFisher Scientific
Normal Donkey Serum GibcoPCN5000
Opti-MEMGibco31985070형질주입 배지
PCDNA4 플라스미드(백본)Addgene41036
페니실린/스트렙토마이신 용액Gibco15140-122
SH-SY5Y 세포/웰ATCC HTB-11
자일렌 대체물Labbox22L36504
Zeiss Axio Imager Apotome 2Carl Zeiss구조화 조명 형광 이미징 시스템 
&알파;-시누클레인 펩타이드르펩티드 S-1010-2
사 조직 임베딩용 홈메이드

참고문헌

  1. Yang, Y., Lu, B. Mitochondrial morphogenesis, distribution, and parkinson disease. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 68 (9), 953-963 (2009).
  2. Schapira, A. H. Mitochondria in the aetiology and pathogenesis of Parkinson's disease. The Lancet Neurology. 7 (1), 97-109 (2008).
  3. Swerdlow, R. H. Mitochondria and mitochondrial cascades in alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 62 (3), 1403-1416 (2018).
  4. Hedrich, K., et al. type, and origin of Parkin mutations: Review and case studies. Movement Disorders. 19 (10), 1146-1157 (2004).
  5. Kahle, P. J., Haass, C. How does parkin ligate ubiquitin to Parkinson's disease. EMBO reports. 5 (7), 681-685 (2004).
  6. Dawson, T. M., Dawson, V. L. The role of parkin in familial and sporadic Parkinson's disease. Movement Disorders. 25, S32-S39 (2010).
  7. Pickrell, A. M., Youle, R. J. The Roles of PINK1, Parkin, and Mitochondrial Fidelity in Parkinson's Disease. Neuron. 85 (2), 257-273 (2015).
  8. Zhi, L., et al. Loss of PINK1 causes age-dependent decrease of dopamine release and mitochondrial dysfunction. Neurobiology of Aging. 75, 1-10 (2019).
  9. Bonifati, V., et al. DJ-1(PARK7), a novel gene for autosomal recessive, early onset parkinsonism. Neurological Sciences. 24 (3), 159-160 (2003).
  10. Chia, S. J., Tan, E. -K., Chao, Y. -X. Historical Perspective: Models of Parkinson's Disease. International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), 2464(2020).
  11. Wilson, D. M., Cookson, M. R., Den Bosch, L. V. an, Zetterberg, H., Holtzman, D. M., Dewachter, I. Hallmarks of neurodegenerative diseases. Cell. 186 (4), 693-714 (2023).
  12. Moore, D. J., West, A. B., Dawson, V. L., Dawson, T. M. Molecular pathophysiology of Parkinson's disease. Annual Review of Neuroscience. 28 (1), 57-87 (2005).
  13. Olanow, C. W., Tatton, W. G. Etiology and pathogenesis of Parkinson's disease. Annual Review of Neuroscience. 22 (1), 123-144 (1999).
  14. Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: In sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
  15. Okamoto, K., Shaw, J. M. Mitochondrial Morphology and Dynamics in Yeast and Multicellular Eukaryotes. Annual Review of Genetics. 39 (1), 503-536 (2005).
  16. Malpartida, A. B., Williamson, M., Narendra, D. P., Wade-Martins, R., Ryan, B. J. Mitochondrial Dysfunction and Mitophagy in Parkinson's Disease: From Mechanism to Therapy. Trends in Biochemical Sciences. 46 (4), 329-343 (2021).
  17. Zou, W., et al. Nanoscopic quantification of sub-mitochondrial morphology, mitophagy and mitochondrial dynamics in living cells derived from patients with mitochondrial diseases. Journal of Nanobiotechnology. 19 (1), 136(2021).
  18. Navaratnarajah, T., Anand, R., Reichert, A. S., Distelmaier, F. The relevance of mitochondrial morphology for human disease. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 134, 105951(2021).
  19. Zambon, F., et al. Cellular α-synuclein pathology is associated with bioenergetic dysfunction in Parkinson's iPSC-derived dopamine neurons. Human Molecular Genetics. 28 (12), 2001-2013 (2019).
  20. Cherubini, M., Lopez-Molina, L., Gines, S. Mitochondrial fission in Huntington's disease mouse striatum disrupts ER-mitochondria contacts leading to disturbances in Ca2+ efflux and Reactive Oxygen Species (ROS) homeostasis. Neurobiology of Disease. 136, 104741(2020).
  21. Parihar, M. S., Parihar, A., Fujita, M., Hashimoto, M., Ghafourifar, P. Alpha-synuclein overexpression and aggregation exacerbates impairment of mitochondrial functions by augmenting oxidative stress in human neuroblastoma cells. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 41 (10), 2015-2024 (2009).
  22. Wiemerslage, L., Lee, D. Quantification of mitochondrial morphology in neurites of dopaminergic neurons using multiple parameters. Journal of Neuroscience Methods. 262, 56-65 (2016).
  23. Liu, Y. -T., et al. Mt-Keima detects PINK1-PRKN mitophagy in vivo with greater sensitivity than mito-QC. Autophagy. 17 (11), 3753-3762 (2021).
  24. Shoshan-Barmatz, V., Shteinfer-Kuzmine, A., Verma, A. VDAC1 at the intersection of cell metabolism, apoptosis, and diseases. Biomolecules. 10 (11), 1485(2020).
  25. Luk, K. C., et al. Pathological α-Synuclein transmission initiates parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338 (6109), 949-953 (2012).
  26. Ryan, B. J., et al. REST protects dopaminergic neurons from mitochondrial and α-synuclein oligomer pathology in an alpha synuclein overexpressing BAC-transgenic mouse model. The Journal of Neuroscience. 41 (16), 3731-3746 (2021).
  27. Yamamoto, H., et al. Dual role of the receptor Tom20 in specificity and efficiency of protein import into mitochondria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (1), 91-96 (2011).
  28. Exner, N., Lutz, A. K., Haass, C., Winklhofer, K. F. Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease: molecular mechanisms and pathophysiological consequences. The EMBO Journal. 31 (14), 3038-3062 (2012).
  29. Grünewald, A., Kumar, K. R., Sue, C. M. New insights into the complex role of mitochondria in Parkinson's disease. Progress in Neurobiology. 177, 73-93 (2019).
  30. Baba, M., et al. Aggregation of alpha-synuclein in Lewy bodies of sporadic Parkinson's disease and dementia with Lewy bodies. The American journal of pathology. 152 (4), 879-884 (1998).
  31. Vázquez-Vélez, G. E., Zoghbi, H. Y. Parkinson's disease genetics and pathophysiology. Annual Review of Neuroscience. 44 (1), 87-108 (2021).
  32. Mahul-Mellier, A. -L., et al. The process of Lewy body formation, rather than simply α-synuclein fibrillization, is one of the major drivers of neurodegeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (9), 4971-4982 (2020).
  33. Ganguly, U., et al. Interaction of α-synuclein and Parkin in iron toxicity on SH-SY5Y cells: implications in the pathogenesis of Parkinson's disease. Biochemical Journal. 477 (6), 1109-1122 (2020).
  34. Ganjam, G. K., et al. Mitochondrial damage by α-synuclein causes cell death in human dopaminergic neurons. Cell Death & Disease. 10 (11), 865(2019).
  35. Martin, L. J., et al. Parkinson's Disease α-synuclein transgenic mice develop neuronal mitochondrial degeneration and cell death. The Journal of Neuroscience. 26 (1), 41-50 (2006).
  36. Choubey, V., et al. Mutant A53T α-Synuclein induces neuronal death by increasing mitochondrial autophagy. Journal of Biological Chemistry. 286 (12), 10814-10824 (2011).
  37. Chen, L., Xie, Z., Turkson, S., Zhuang, X. A53T Human α-synuclein overexpression in transgenic mice induces pervasive mitochondria macroautophagy defects preceding dopamine neuron degeneration. The Journal of Neuroscience. 35 (3), 890-905 (2015).
  38. Kamp, F., et al. Inhibition of mitochondrial fusion by α-synuclein is rescued by PINK1, Parkin and DJ-1. The EMBO Journal. 29 (20), 3571-3589 (2010).
  39. Nakamura, K., et al. Direct membrane association drives mitochondrial fission by the parkinson disease-associated protein α-synuclein. Journal of Biological Chemistry. 286 (23), 20710-20726 (2011).
  40. Park, J., et al. Abnormal mitochondria in a non-human primate model of MPTP-induced Parkinson's disease: Drp1 and CDK5/p25 signaling. Experimental Neurobiology. 28 (3), 414-424 (2019).

재인쇄 및 허가

태그

면역염색 프로토콜이미지 분석VDAC1 염색알파-시누클레인 응집체흑질도파민 작동성 뉴런미토콘드리아 파편화공초점 현미경법
파킨슨병 모델에서 미토콘드리아 형태학의 조직학적 검사
문의하기
도서관에 추천하기

개인정보 처리방침

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.