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방법 논문

생검 유래 신장 세포의 대사 표현형 설명

639 조회수

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DOI:

10.3791/65457

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2025년 6월 17일

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1Soham and Shaila Ajmera Family Transplant Centre, University Health Network, 2Division of Nephrology, The Hospital for Sick Children, 3Division of General Surgery, University Health Network, 4Institute of Medical Science, University of Toronto, 5Program in Cell Biology, The Hospital for Sick Children Research Institute, 6Toronto General Hospital Research Institute, University Health Network, 7Division of Nephrology, Tallaght University Hospital, 8Trinity Kidney Centre, Trinity College Dublin, 9Department of Immunology, University of Toronto, 10Division of Nephrology, McMaster University and St. Joseph's Healthcare, 11Division of Nephrology, Department of Medicine, University Health Network, 12Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 생검 유래 신장 세포의 대사 프로파일링을 수행하는 고유한 방법을 설명합니다. 제시된 접근법은 건강한 성인 수컷 돼지에 최적화되었으며 신장 동종이식 생존력의 실시간 평가를 향상시킬 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 이 방법은 또한 여러 대사 기반 신장 질환에 걸쳐 새로운 생물학을 발견하는 데 도움이 될 수 있습니다.

초록

신장 이식은 말기 신장 질환에 대한 최적의 치료법입니다. 그러나 이식된 신장은 종종 조기에 손실되며, 이식 후 10년이 지나면 최대 50%의 이식편 손실이 발생합니다. 조기 이식편 손실의 주요 원인 중 하나는 허혈-재관류 손상(IRI)으로 알려진 이식 시 이식편으로 인한 손상입니다. 이식 후 첫 주에 투석이 필요한 것으로 정의되는 지연된 이식 기능(DGF)은 급성 신장 손상(AKI)의 기능적 및 조직학적 특징을 보여주는 중증 IRI의 징후입니다. AKI를 유발하는 메커니즘은 불분명하지만, 축적된 증거는 동종이식의 변화된 대사 기능이 AKI를 매개하고 DGF의 원인이 될 수 있음을 시사합니다. 따라서 IRI의 대사 토대를 해독하고 모니터링하면 AKI를 진단하고 예방하는 능력이 향상될 것입니다. 이 논문에서는 바늘 생검 유래 신장 세포 현탁액에서 미토콘드리아 호흡(산소 소비율), 해당작용(세포 외 산성화 속도) 및 세포 내 ATP 수치를 평가하는 고유한 방법을 설명합니다. 이 방법론은 건강한 성인 수컷 돼지에서 최적화되었으며 자동 이식의 돼지 모델에서 검증되었습니다. 제시된 접근 방식은 임상에서 신장 동종이식 생존력에 대한 실시간 평가를 향상시킬 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 환자 유래 생검에서 신진대사를 프로파일링하면 다른 대사 기반 신장 질환에서 새로운 생물학을 발견할 수도 있습니다.

서론

신장 이식은 말기 신장 질환에 대한 최적의 치료법입니다 1,2,3,4; 그러나 이식된 신장은 조기에 소실되는 경우가 많으며, 이식 후 10년이 지나면 이식편이 최대 50% 손실됩니다5. 영향을 받은 환자는 이환율과 사망률을 증가시키고 의료 시스템에 큰 경제적 부담을 초래합니다6. 조기 이식 손실의 주요 원인은 허혈-재관류 손상(IRI)으로 알려진 이식 시 이식편으로 인한 손상입니다. IRI는 혈류 감소로 인한 피할 수 없는 부상으로, 재관류가 뒤따른다7. 허혈은 조직 숙시네이트 축적을 특징으로 하며, 이는 미토콘드리아 호흡계에서 역전자 흐름을 유도하여 과산화물 생성과 재관류 후 조기에 손상을 일으킵니다8. 이식된 장기에서 IRI는 원발성 비기능, 지연된 이식 기능(DGF), 거부 반응 및 열등한 이식 결과의 위험을 증가시킨다 8,9. 이식 후 첫 주에 투석이 필요한 것으로 정의되는 DGF9는 중증 IRI10의 징후입니다. 조직학적으로 IRI 관련 DGF는 급성 세뇨관 괴사(ATN) 및 미세혈관 구조의 손상으로 나타납니다. 기능적으로, 동종이식편에서 급성 신장 손상(AKI)의 특징인 사구체여과율(GFR)과 소변 배출량이 감소한다11. 그 중요성에도 불구하고, 현재 허혈-재관류 관련 이식 후 AKI에 대한 치료법은 없습니다. 치료법의 부족은 질병 메커니즘에 대한 이해가 불완전하고 손상이 되돌릴 수 있는 중요한 시점에 이식 기능 장애의 위험이 가장 높은 환자를 식별할 수 있는 마커의 부족에서 비롯됩니다12.

축적된 증거에 따르면 동종이식에서 변화된 에너지 대사는 AKI를 매개하고 DGF 13,14,15를 뒷받침할 수 있습니다. 신장 세포는 두 가지 주요 메커니즘, 즉 미토콘드리아 호흡(mitochondrial respiration)과 해당작용(glycolysis)을 통해 에너지를 생성합니다16. IRI에서 재관류는 미토콘드리아 기능 장애를 초래한다17. 결과적으로, 해당과정은 주요 에너지 원이됩니다13 , 18 , 19 , 20 . IRI의 대사 변화는 세뇨관 및 미세혈관 내피 세포 사멸을 촉진하여 AKI 21,22,23,24를 유발합니다. 이전 연구에서 ATN은 해당효소의 발현 증가 및 미토콘드리아 단백질의 수준 변화25와 관련이 있었으며, 이는 이식편의 IRI와 일치합니다13,18. 더욱이, 돼지 신장 자가이식 모델에서는 허혈 후 냉장 보관으로 인해 신장 미토콘드리아 단백질의 수치가 감소하고 젖산 배설이 증가했다26. 전체적으로 이러한 발견은 동종이식의 기초 대사 특징이 동종이식 기능 장애를 예측할 수 있기 때문에 이식 전에도 신장 동종이식편의 대사 표현형을 모니터링하는 것의 임상적 중요성을 확고히 합니다27.

동종이식 거부 반응 및 손실의 단기 위험에 대한 임상 예측 모델이 개발되었습니다28,29. 그러나 이러한 모델은 정밀도가 부족하고 이식편의 분자적 특징을 고려하지 않습니다 30,31,32. 최근 연구에서는 동종이식 기능 장애 및 거부 반응과 같은 열등한 이식 결과와 관련된 조직 수준의 분자 패턴을 식별하여 이러한 미충족 수요를 해결하는 것을 목표로 했습니다 13,14,15,25,33,34. 이러한 연구는 유전자33,34,35, 단백질 25,26 및 대사 산물 수준13,14에서 정상 상태 분자 측정에 의존하여 동종이식의 대사 표현형에 대한 불완전한 그림을 남깁니다. 이러한 지식의 격차는 부분적으로 특정 순간에 신장 유래 샘플의 대사 기능과 에너지 상태를 측정할 수 없기 때문입니다. 생검 유래 신장 세포의 대사 표현형을 결정하기 위한 표준화된 프로토콜의 개발이 필요하며, 이는 잠재적으로 환자 샘플 연구로 번역될 수 있습니다. 이 문서에서는 생검 유래 신장 세포 현탁액에서 미토콘드리아 호흡(산소 소비율), 해당작용(세포 외 산성화 속도) 및 세포 내 ATP 수치를 평가하는 고유한 워크플로우에 대해 설명합니다. 이 방법론은 건강한 성인 수컷 돼지의 신장 생검 코어를 사용하여 최적화되었습니다. 향후 임상 구현을 용이하게 하기 위해 신장 이식 샘플링의 표준 임상 프로토콜36,37에서와 같이 18G 바늘을 사용하여 생검 코어를 얻었습니다. 마지막으로, 실험 조건을 구별하는 데 있어 프로토콜 구현의 유용성은 자동 이식의 돼지 모델에서 검증되었습니다.

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프로토콜

이 프로토콜은 토론토 종합 연구소(Toronto General Research Institute)의 동물 관리 위원회(Animal Care Committee)의 승인을 받았습니다(동물 사용 프로토콜 번호: 3652). 동물은 캐나다 온타리오주 국립보건원(NIH)의 국립의학연구협회(National Society of Medical Research and Guide for the care of laboratory animals)에 따라 보살핌을 받았습니다. 이 연구에는 각각 약 30kg의 3개월 된 수컷 요크셔 돼지 5마리가 사용되었습니다. 이 방법론을 위한 프로토콜은 다음 단계로 세분화됩니다: (1) 단일 신장 생검 코어를 세포 현탁액으로 해리; (2) 생검 유래 신장 세포의 대사 프로파일링; (3) 생검 유래 신장 세포의 ATP 함량 측정. 대사 기능 또는 ATP 함량 측정을 위해 수집된 모든 생검 샘플은 생물 안전 캐비닛에서 회수 후 3시간 이내에 해리되었습니다. 방법론의 워크플로우는 그림 1에 나와 있습니다. 사용된 시약과 장비는 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 단일 신장 생검 코어를 세포 현탁액으로 해리

  1. 동축 바늘(즉, 외부 유도 바늘 및 내부 생검 바늘) 총 시스템을 사용하여 신장 피질에서 조직의 3개의 생검 코어를 수집합니다38. 임상 번역의 경우, 18G 생검 바늘 총을 사용하는 것이 좋다39.
    참고: 신장 피질의 생검을 수행할 때 생검 바늘 총의 각도(~45°C)와 천자 깊이(~20mm)를 일치시켜야 합니다.
  2. 얼음 위에 2mL의 RPMI 1640이 들어 있는 15mL 튜브에 각 생검 코어를 조심스럽게 놓습니다.
    1. 얼음 위에 올려진 6cm 페트리 접시에 메스를 사용하여 생검 조직을 작은 조각(길이 ≤2mm)으로 절단합니다. 초박형 가는 팁 곡선 핀셋을 사용하여 각 생검의 조직 조각을 1mL의 해리 배지가 들어 있는 다른 1.5mL 튜브에 넣습니다.
      참고: 해리 매체는 0.1mg/mL DNase I, 10mg/mL 콜라겐분해효소 및 Bacillus polymyxa의 2990 units/mL 중성 프로테아제를 포함하는 RPMI 1640 배지로 구성됩니다. 이 배지 조성물을 사용한 인간 신장 생검의 해리는 세포 생존력을 극대화하고 희귀하고 취약한 세포 집단의 표현을 보존하는 것으로 입증되었습니다40.
  3. 37°C(가열 블록)에서 30분 동안 간헐적인 교반으로 해리가 일어나도록 합니다(5분마다 튜브를 볼텍싱하는 것이 권장됨).
  4. 해리 후 35μm cell strainer snap-cap tube를 통해 cell suspension을 여과합니다.
  5. 1:1 부피의 100% 소 태아 혈청(FBS)으로 여과기를 헹굽니다.
  6. 3개의 생검 유래 신장 세포 현탁액을 하나의 15mL 튜브에 모읍니다.
  7. 원심분리(400 x g, 5분, 4°C)로 세포를 펠렛화하고 10% FBS가 함유된 RPMI 1640 1mL에 재현탁합니다. 이 세포 현탁액은 일반적으로 0.8-1.2 × 106 세포를 생성합니다.

2. 생검 유래 신장 세포의 대사 프로파일링

참고: 대사 프로파일링 단계는 대사 기능 분석기에서 해당작용(ECAR) 및 산소 소비율(OCR) 측정과 상용 키트를 사용하여 세포 내 ATP 수치를 통합합니다.

  1. 카트리지 유틸리티 플레이트 수화 및 교정
    1. 시료 채취 하루 전에 대사 기능 분석기의 카트리지 유틸리티 플레이트의 모든 웰에 200μL의 ddH2O를 추가합니다.
    2. 카트리지 유틸리티 플레이트를 37°C의 CO2-free 인큐베이터에서 밤새 배양합니다.
    3. 샘플 채취 당일, 진공 시스템에 연결된 파스퇴르 피펫을 사용하여 흡인으로 ddH2O를 제거하고 카트리지 유틸리티 플레이트의 모든 웰에 200μL의 캘리브런트 용액(pH = 7.4)을 추가합니다.
    4. 카트리지 유틸리티 플레이트를 37°C의 CO2-free 인큐베이터에서 밤새 배양합니다.
  2. 세포 도금 및 대사 기능 측정을 위한 분석 매체 및 스트레스 요인 화합물의 준비
    1. 96웰 대사 기능 분석 플레이트의 각 웰에 10% FBS와 함께 100μL의 RPMI를 추가합니다.
    2. 다른 튜브에서 세포 현탁액(단계 1에서 얻음)의 작은 부분 표본(예: 10μL)을 분리하고 trypan blue exclusion viability dye를 사용하여 세포를 염색합니다.
    3. 계수 챔버를 사용하여 원래 현탁액에서 살아있는 세포(트리판 블루 네거티브)41 의 농도를 측정합니다.
    4. 대사 기능 분석 플레이트의 각 연구 웰에 1.0 x 105 살아있는 세포/웰의 밀도로 세포를 파종합니다. 이 셀 수는 최적화 후에 결정되었습니다(대표 결과 섹션 참조).
      참고: 대사 기능 분석 플레이트의 네 모서리 중 어느 곳에도 세포를 파종하지 마십시오. 이는 블랭크로 사용되므로 마찬가지입니다.
    5. 대사 기능 분석 플레이트를 37°C, 5% CO2 인큐베이터에서 하룻밤(~16시간) 동안 배양하여 세포가 부착되도록 합니다.
    6. 다음 날, 현미경으로 세포가 70%-80%의 최소 합류점에 있는지 확인합니다(건강한 세포 단층은 대사 기능 매개변수의 최적 결정을 위해 중요합니다).
    7. 분취액(40-50mL)의 페놀 레드가 없는 기저 배지를 37°C에서 최소 15분 동안 해동합니다.
    8. 사전 해동된 33.915mL의 기저 배지에 2mM 글루타민(350μL), 1mM 피루베이트(350μL) 및 5.55mM 포도당(385μL)을 첨가하여 35mL의 분석 배지를 준비합니다.
    9. 단일 또는 다중 채널 피펫을 사용하여 대사 기능 분석 플레이트의 각 연구 웰에서 RPMI 배지를 부드럽게 제거합니다. 다음으로, 100μL의 기저 배지를 추가하여 세포를 세척합니다.
    10. 기저 배지를 부드럽게 제거하고 세포가 없는 웰을 포함한 모든 웰에 150μL의 분석 배지를 추가합니다.
      참고: 분석 매체 없이 웰을 방치하면 플레이트 환경의 습도 조건에 영향을 미치고 대사 기능이 일관되지 않게 측정될 수 있습니다(보충 그림 1).
    11. 대사 기능 분석 플레이트를 37°C의 CO2-free 인큐베이터에 ~1시간 동안 놓습니다(적응 단계). 카트리지 유틸리티 플레이트(이전에 캘리브런트 용액에서 배양)를 생물 안전 작업대에 다시 가져갑니다.
    12. 적응하는 동안 분석 매체에서 다음 4가지 스트레스 요인 화합물 용액을 준비합니다: 7μM 올리고마이신(7x, 최종 농도의 경우 1μM 올리고마이신); 2.4 μM 카르보닐 시안화물-4 (트리플루오로메톡시) 페닐히드라존 (FCCP) (8x, 최종 농도 0.3 μM FCCP); 450 mM 2-deoxy-glucose (2-DG) (9x, 최종 농도 50 mM 2-DG에 대해); 10 μM 로테논 및 10 μM 안티마이신 A (부패 + AA) (10x, 최종 농도의 경우 1 μM 부패 + 1 μM AA).
      참고: 올리고마이신은 ATP 합성효소의 활성을 억제하여 전자전달계(ETC)를 중단합니다. 이것은 OCR과 ATP 합성효소에 의해 주도되는 양성자가 미토콘드리아로 유입되는 것을 낮춥니다. 결과적으로, 해당과정(glycolysis)은 ATP 생산의 주요 공급원이 된다42. FCCP는 양성자(양전하)를 끌어당기고 미토콘드리아로 지속적인 양성자 유입을 유도하여 산화적 인산화의 커플러 역할을 하는 시안화물 약물(음전하)이며, 이는 ATP 합성효소 활성과 독립적으로 ETC에 의한 산소 소비를 가능하게 합니다43. 2-DG는 2-하이드록실기가 수소로 대체된 포도당의 합성 구조 유사체이며, 해당작용44의 경쟁적 억제제로 작용합니다. 부패(rot)와 AA는 각각 전자전달계(electron transport chain)의 복합체 I과 III의 억제제이다(45). 대사 기능 분석의 상이한 단계에서 각 약물을 주입하는 효과는 보충 그림 2에 나타나 있습니다.
    13. 세포가 없는 웰을 포함하여 카트리지 유틸리티 플레이트의 각 웰 상단에 있는 해당 포트에 각 약물 25μL를 로드합니다. 7x oligomycin (포트 A), 8x FCCP (포트 B), 9x 2-DG (포트 C), 10x Rot + AA (포트 D)의 순서로 약물을 로드합니다.
    14. 대사 기능 분석을 설정하는 데 필요할 때까지 CO2-free 인큐베이터에서 카트리지 유틸리티 플레이트를 배양합니다.
  3. 생검 유래 신장 세포의 산소 소비량 및 해당과정 속도 측정
    1. 대사 기능 분석기가 켜져 있고 액세서리 컴퓨터의 컨트롤러 소프트웨어에 연결되어 있는지 확인합니다.
    2. 소프트웨어를 실행합니다.
    3. Template > Blank 버튼을 클릭합니다.
    4. 첫 번째 탭에서 Injection strategy 버튼을 클릭하십시오. 4개의 주입 포트에 해당하는 문자 A, B, C 또는 D 가 있는 각 버튼을 클릭합니다. 각 포트를 통해 주입될 약물의 이름을 적어 둡니다: 올리고마이신(포트 A), FCCP(포트 B), 2-DG(포트 C), Rot + AA(포트 D).
    5. 두 번째 탭에서 모든 실험 조건을 정의합니다. Add condition 버튼을 클릭하여 새 조건을 도입합니다. 소프트웨어는 각 조건에 자동으로 색상을 할당합니다. Plate map 버튼을 클릭하고 해당 실험 조건을 각 웰에 할당하면 그에 따라 색상이 지정됩니다.
      알림: 4개의 모서리 웰은 배경 신호를 빼는 데 사용되므로 공백(검은색)으로 할당된 상태로 유지해야 합니다.
    6. 세 번째 탭에서 주입 버튼을 네 번 클릭하여 4개의 주입(포트 A, B, C, D)이 시퀀스에 추가됩니다. 기본 주입 순서(A, B, C, D), 측정 횟수(기초 측정 3회 + 각 주입 후 측정 3회) 및 측정 간 시간(3분)을 사용하여 분석을 실행할 수 있습니다.
    7. 네 번째 탭에서 필수 연구 정보로 상자를 채우고 실행을 클릭합니다. 트레이가 열리고 소프트웨어가 사용자에게 카트리지 유틸리티 플레이트를 장착하도록 요청합니다. 접시를 트레이에 놓기 전에 녹색 뚜껑을 제거했는지 확인하십시오.
    8. 보정(~15분) 후 트레이가 다시 열리고 소프트웨어는 사용자에게 카트리지 유틸리티 플레이트를 제거하고 대사 기능 분석 플레이트를 트레이에 놓으라고 요청합니다. 다시 말하지만, 트레이에 플레이트를 장착하기 전에 플레이트 뚜껑을 제거하십시오. 카트리지 유틸리티 플레이트는 폐기할 수 있습니다.
    9. 분석은 약 2시간 내에 완료됩니다. 그 후 해당 '.asyr' 파일을 저장합니다. .asyr 파일을 계산적으로 분석하여 ECAR 및 OCR 곡선을 검토합니다. 데이터를 기본 형식으로 내보냅니다.
  4. 대사 기능 데이터의 정규화를 위한 DNA 함량 측정
    1. 지정된 세포 증식 분석 키트를 사용하여 대사 기능 분석 후 각 웰의 세포에 있는 DNA의 양을 측정합니다( 재료 표 참조).
    2. 20x 세포 용해 완충액을 탈이온수에 희석하여 필요한 부피의 1x 세포 용해 완충액을 준비합니다.
    3. 표준 곡선을 준비하기 위해 세포 용해 완충액에서 0 ng/mL, 12.5 ng/mL, 25 ng/mL, 50 ng/mL, 100 ng/mL, 200 ng/mL, 400 ng/mL, 800 ng/mL 범위의 농도로 순차적으로 희석된 박테리오파지 λ DNA 표준물질(세포 증식 분석 키트에 포함)의 100 μL 샘플을 준비합니다. 각 희석액을 검은색 96웰 마이크로플레이트의 다른 웰에 로드합니다.
    4. 1x 세포 용해 완충액에 400x 염료 시약을 희석하여 1x 염료 결합 용액을 준비합니다. 각 표준 곡선 웰 및 대사 기능 분석 웰 연구에 대해 100μL가 필요합니다.
    5. 100μL의 1x 염료 용액을 이미 표준물질이 포함된 첫 번째 컬럼에 분배합니다. 참고: 이 시점까지의 프로세스는 대사 기능 분석 실행이 끝나기 30분 전에 시작할 수 있습니다.
    6. 단일 또는 다중 채널 피펫을 사용하여 대사 기능 분석 플레이트에서 분석 매체를 제거합니다.
    7. 멀티채널 피펫을 사용하여 100μL의 1x 염료 결합 용액을 대사 기능 분석 플레이트의 각 연구 웰에 추가합니다. 피펫을 위아래로 몇 번 사용하여 세포를 용해시키고 내용물을 블랙 플레이트로 옮깁니다.
    8. 마이크로플레이트를 빛으로부터 보호하고 37°C에서 2-5분 동안 배양합니다.
    9. 480nm에서 여기(excitation)와 520nm에서 방출 검출이 가능한 형광 마이크로플레이트 리더를 사용하여 각 샘플의 형광 강도를 측정합니다.

3. 생검 유래 신장 세포의 ATP 함량 측정

참고: 지정된 ATP 검출 시약 및 재조합 ATP(rATP) 표준물질을 사용하여 생검 유래 신장 세포의 ATP 양을 측정합니다( 재료 표 참조).

  1. 얼었다면 ATP 검출 시약을 4°C에서 밤새 해동합니다.
  2. 생검 유래 세포 현탁액 및 세포 계수 획득 후, 10% FBS가 포함된 100μL의 RPMI 1640 배지를 함유한 흰색 96웰 마이크로플레이트의 각 웰에 1.0 x 104 살아있는 세포/웰을 플레이트화합니다. 마이크로플레이트의 첫 번째 열은 다음 날 rATP 표준 곡선을 로드하는 데 사용되므로 비워 둡니다.
  3. 마이크로플레이트를 37°C의 5% CO2 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양합니다.
  4. 다음 날에는 ATP 검출 시약을 실온에서 예열합니다.
  5. rATP 표준 곡선을 생성합니다. PBS에서 0 nM, 0.001 nM, 0.01 nM, 0.1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 100 nM, 1000 nM 농도로 직렬로 희석된 rATP 표준물질 100 μL 샘플을 준비합니다.
  6. 각 rATP 표준물질 시료 50μL를 마이크로플레이트의 첫 번째 컬럼에 로드합니다.
  7. 단일 또는 다중 채널 피펫을 사용하여 각 마이크로플레이트 연구 웰에서 10% FBS가 포함된 RPMI 1640 배지를 제거합니다.
  8. 각 연구를 100μL의 PBS로 잘 세척합니다(37°C 수조 에서 예열).
  9. PBS를 제거하고 각 연구 웰에 50μL의 새로운 PBS를 추가합니다.
  10. 50μL의 ATP 검출 시약을 표준물질 웰과 연구 웰 모두에 추가합니다.
  11. 혼합하고 37 ° C에서 2 분 동안 배양 한 다음 RT에서 10 분 동안 배양합니다.
  12. 마이크로플레이트 리더에서 발광을 읽고 기록합니다.

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결과

워크플로우는 건강한 3개월 된 수컷 요크셔 돼지의 생검 유래 신장 세포에서 테스트되었습니다. 조직 해리 및 세포 플레이팅에 대한 프로토콜은 위에서 설명한 대로 따랐습니다. 세포를 16시간 동안 부착시킨 후, OCR과 ECAR은 각각 미토콘드리아 호흡 및 해당작용의 마커로 대사 기능 분석기를 사용하여 생검 유래 돼지 신장 세포에서 실시간으로 측정되었습니다.

첫 번째 실험은 생검 유래 신장 세포에서 OCR 및 ECAR 값과 대사 스트레스에 대한 예상 반응을 확실하게 측정하기 위한 최적의 파딩 밀도를 결정하는 것을 목표로 했습니다. 15,000 세포, 30,000 세포, 60,000 세포 및 1,20,000 세포의 4가지 다른 시딩 밀도를 테스트했습니다. 세포는 표준 제형(5.5mM 포도당, 2mM 글루타민 및 1mM 피루브산)을 사용하여 대사 기능 분석 매체에 노출되었습니다. 대사 스트레스는 이전에 보고된 일련의 약물을 1μM 올리고마이신, 0.3μM FCCP, 100mM 2-DG ...

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토론

이 논문은 생검에서 얻은 신장 세포의 대사 기능을 평가하는 고유한 방법에 대해 설명합니다. 새로운 코어 신장 생검에서 단일 세포 현탁액을 얻기 위한 프로토콜은 대사 기능 및 세포 내 ATP 수치 분석과 결합되었습니다. 해당작용은 ECAR을 측정하여 평가하고 미토콘드리아 호흡은 OCR을 측정하여 평가합니다. 방법론을 최적화하기 위해 포린 신장 생검을 사용했습니다.

대사 기능 분석기를 사용한 신장 생검의 해리를 통해 얻은 세포의 생체 에너지 기능을 효과적으로 연구하기 위해서는 먼저 파종할 살아있는 세포의 밀도를 최적화하고, 사용된 스트레스 요인 화합물의 투여량(해당되는 경우)을 적정하고, 예상되는 결과를 반영하는 임상적으로 관련된 실험 그룹에서 방법론을 검증하는 것이 중요합니다. 최적화는 다양한 세포 밀도와 스트레스 요인 화합물 농도에 대해 수행되었습니다. 1,00,000 cells/well을 시딩하고 1μ...

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공개 사항

공동 저자 중 누구도 공개할 경쟁적인 재정적 이해관계나 기타 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

AK는 University Health Network Foundation(579067450776, 579072310776 및 579068260776 수상)의 지원을 받았습니다. SC-F는 KRESCENT(Kidney Research Scientist Core Education and National Training) 프로그램(2019KPPDF637713 및 24KNIA-1291062)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
2-Deoxy-D-glucoseSigmaD6134경쟁 해당과정 억제제
5 mL 라운드 바텀 폴리스티렌
시험관, 세포 여과기 포함 Snap Cap		Falcon352235Dissociation 튜브
Antimycin A에서  스트렙토마이세스  sp.SigmaA8674호흡 사슬 복합체 III의 억제제
AOF BP 프로테아제VitaCyte003-1000해리 효소
카르보닐 시안화물 4-(트리플루오로메톡시)
페닐히드라존(FCCP)		SigmaC2920산화 인산화 언커플러
CellTiter-Glo 2.0 분석, 100mLPromegaG9242세포 내 ATP 측정
Collagenase MAVitaCyte001-2030해리 효소
CyQUANT 세포 증식 분석, 배양 세포용InvitrogenC7026세포 내 DNA
D-포도당, 무수, 시약 등급BioshopGLU501대사 기질
DNase I줄기세포07469분해 효소
태아 소 혈청, 프리미엄,
미국 원산지, 열 비활성화, 500 mL		Wisent080-450해리 미디어 보충제
L-Glutamine-200 mM (100x) 액체 (100 mL)Gibco25030081대사 기질
Oligomycin ASigma75351ATP 합성효소 PBS의 억제제
, -/-, 500 mLWisent311-010-CL세포 세척
rATP,  10 밀리미터,  0?5 mLPromegaP1132세포 내 ATP
측정 RotenoneSigmaR8875호흡 사슬의 복합체 I 억제제
RPMI 1640Gibco11875119해리 매체
Seahorse Wave Controller Software 2.6AgilentN/A대사 기능 측정 설정
Seahorse Wave 데스크탑 소프트웨어 2.6AgilentN/A대사 기능 데이터 분석
Seahorse XF 기본 매체,  페놀 레드 없음, 500 mLAgilent103335-100대사 기능 측정
Seahorse XFe96 FluxPak  (플레이트 20개, 카트리지 18개,
및 캘리브런트 용액 500mL)		Agilent102416-100대사 기능 측정
Seahorse XFe96 대사 기능 분석기Agilent101991-100대사 기능 측정
피루브산 나트륨 용액 100mM(100X), 액체 100mLGibco11360070대사 기질

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