이 프로토콜은 신진 효모인 맥주효모균(Saccharomyces cerevisiae)에서 네이티브 염색질 맥락에서 관심 있는 단일 복제 유전자 자리를 정제하기 위해 부위 특이적 재조합을 기반으로 하는 유전자좌 특이적 염색질 분리 방법을 제시합니다.
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방법 논문
Single-Copy Gene Locus Chromatin Purification in Saccharomyces cerevisiae (맥주효모균의 단일 복제 유전자 자리, 염색질 정제)
이 논문에서
요약
초록
진핵 염색질의 기본 조직 단위는 뉴클레오솜 코어 입자 (NCP)이며, 이는 히스톤 옥타머 주위에 ~ 1.7 배 감싼 DNA로 구성됩니다. 크로마틴은 NCP와 전사 인자, 염색질 리모델링 및 변형 효소를 포함한 수많은 다른 단백질 복합체의 실체로 정의됩니다. 이러한 단백질-DNA 상호 작용이 세포주기의 여러 단계에서 특정 게놈 위치 수준에서 어떻게 조정되는지는 아직 불분명합니다. 이는 주로 현재의 기술적 한계로 인해 이러한 동적 상호 작용의 정확한 측정값을 얻기가 어렵기 때문입니다. 여기서는 부위 특이적 재조합과 효율적인 단일 단계 친화성 정제 프로토콜을 결합하여 네이티브 염색질 상태에서 단일 복제 관심 유전자 자리를 분리하는 개선된 방법을 설명합니다. 이 방법은 게놈 크로마틴에 대한 표적 자리의 강력한 농축을 허용하므로 이 기술은 질량 분석법과 같은 편향되지 않고 체계적인 방식으로 단백질 상호 작용을 식별하고 정량화하기 위한 효과적인 전략이 됩니다. 이러한 조성 분석에 더하여, 이 방법에 의해 정제된 천연 염색질은 뉴클레오솜 위치 지정 및 히스톤 변형에 관한 생체 내 상황을 반영할 가능성이 높으며, 따라서 효모의 거의 모든 게놈 유전자좌에서 유래한 염색질의 추가 구조 및 생화학적 분석에 적합합니다.
서론
진핵생물 게놈을 염색질로 역동적으로 조직하면 DNA가 핵의 한계 내에 맞도록 압축되는 동시에 유전자 발현을 위한 충분한 역학과 조절 인자에 대한 접근성을 보장합니다. 부분적으로, 이 다재다능함은 히스톤 옥타머1 주위에 ~1.7배 감싼 DNA의 147 bp를 가진 핵심 입자를 포함하는 염색질의 기본 단위인 뉴클레오솜에 의해 매개됩니다. 뉴클레오솜은 N- 및 C-말단 히스톤 꼬리에 수많은 히스톤 변이체와 번역 후 변형(PTM)이 있는 구성과 관련하여 매우 역동적인 구조입니다. 또한 진핵 염색질은 전사 인자, DNA 및 RNA 처리 기계, 건축 단백질, 염색질 리모델링 및 변형에 관여하는 효소, 염색질과 관련된 RNA 분자와 같은 다양한 다른 필수 구성 요소와 상호 작용합니다. 전사, 복제 및 복구와 관련된 이러한 중요한 기계는 모두 이러한 과정의 천연 기질 역할을 하는 크로마틴에 대한 접근이 필요합니다. 결과적으로, 이러한 DNA 거래의 기초가 되는 분자 메커니즘을 이해하려면 이러한 기계가 수렴하고 생물학적 반응을 촉진하는 특정 게놈 영역에서 염색질 구조의 집합적 변화를 정확하게 정의해야 합니다.
유전학 및 단백질-단백질 상호 작용 연구를 통해 수많은 염색질 인자를 식별했음에도 불구하고 특정 게놈 부위에....
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프로토콜
이 프로토콜에 사용된 모든 재료 및 도구와 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오. 표 1 에서 사용된 솔루션, 버퍼 및 매체 목록을 참조하십시오.
1. 재조합 효모 균주 구성
- 재조합 적격 효모 균주를 구축하기 위해, SbfI-소화된 플라스미드 K238을 관심 유전자좌(13,14)에 통합된 LexA-결합 부위 및 RS 재조합 부위를 갖는 효모 균주로 형질전환시킨다.
참고: 형질전환된 SbfI 제한 단편에는 상동 재조합에 의한 발현 카세트의 게놈 통합을 위한 효모 염색체 I의 상동 서열과 함께 LexA-TAP 융합 단백질 및 R-재조합효소의 구성적 발현에 필요한 발현 카세트가 포함되어 있습니다(그림 1). - 대조군 균주를 구성하기 위해서는 통합 RS 및 LexA 결합 부위가 없는 동종 효모 균주를 재조합 가능 균주에 사용된 것과 동일한 조건에서 SbfI 분해 K238 플라스미드로 형질전환시킵니다.
- SCD-LEU 한천 플레이트
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결과
~1.4kb ARS316 크로마틴 도메인의 정제는 구성적으로 발현된 LexA-TAP 어댑터 단백질에 의해 매개되었습니다. 음성 대조군으로 사용하기 위해 LexA-TAP을 발현하지만 통합 RS 및 LexA 결합 부위를 포함하지 않는 동종 균주를 사용하여 정제를 수행했습니다. 그림 3 은 ARS316 유전자좌를 표적으로 하는 대조군과 재조합 가능 균주 모두에 대해 수행된 표준 정제 실험의 DNA 분석 결과를 보여줍니다. 원형 DNA 분자를 선형화하기 위한 DNA 분리 및 제한 효소 분해 후, qPCR 분석을 수행하여 관련 없는 게놈 제어 위치 PDC1에 대한 ARS316 표적 자리의 정제 효율을 평가했습니다.
또한, 전체 염색질에 대한 ARS316 유전자좌의 농축을 정량화했습니다(그림 3A,B). 음성 대조군 균주는 조세포 추출물, 투입 및 플로우.......
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토론
특정 표적 게놈 영역의 인자 및 염색질 지형을 식별하는 것은 염색질 연구에서 계속해서 주요 과제를 제기하고 있다18. 이 프로토콜은 효모 염색체에서 뚜렷한 염색질 도메인을 특이적으로 절제하고 정제하는 효율적인 시스템을 설명합니다. 우리가 아는 한, 이 단일 단계 정제의 순도와 수율은 유전자좌 특이적 염색질 정제 방법의 많은 한계를 극복하여 다른 관련 없는 게놈 영역에 비해 표적 유전자좌의 매우 높은 농축을 달성할 수 있습니다.
부위 특이적 R-재조합효소를 사용한 추가 절제 단계로 인해, 또 다른 장점은 게놈에서 재조합 부위의 정확한 위치에 따라 정제되는 게놈 영역을 정확하게 결정할 수 있다는 것입니다. 대조적으로, 다른 방법은 초음파 처리에 의한 DNA 전단에 의존하며, 이는 이질적인 분자 길이를 초래합니다. 이러한 이질성으로 인해 이러한 방법은 잘 정의된 표적 유전자좌의 정제 측면에서 덜 정확합니다.
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공개 사항
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
S.H. 실험실에서의 작업은 SFB1064(프로젝트 ID 213249687), 유럽 연구 위원회(ERC Starting Grant 852798 ConflictResolution) 및 Helmholtz Gesellschaft를 통해 DFG의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 효모 균주 | |||
| Control 변형: MATa; ura3Δ 0; leu2Δ 0; 그의3&델타; 1; met15&델타; 0; 바1::kanMX4; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR | Section 1, 참고 문헌 13 및 14 참조 | ||
| Recombination Strain: MATa; ura3Δ 0; leu2Δ 0; 그의3&델타; 1; met15&델타; 0; 바1::kanMX4; RS_LEXA_NS-3_ARS316_NS+3_RS; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR | Section 1, 참조 13 및 14 | ||
| Plasmid | |||
| K238 plasmid | Section 1 참조, 참조 13 참조 Storage: store at -20 ° C | ||
| K071 스파이크인 플라스미드 DNA | 섹션 7.1, 참조 참조 13 참조저장: -20°C에 보관; C | ||
| 시약 | |||
| Acetone | Carl Roth | 5025.1 | Section 2 보관: 실온에서 보관 |
| 아세트산 암모늄 (NH4Ac) | Sigma Aldrich | A7262 | Section 6 및 7.1 보관: 실온에서 |
| 보관 암모늄 용액 (NH4OH) 25% | Merck Millipore | 533003 | 섹션 6 보관: 실온에서 보관 |
| 산암모늄 | Santa Cruz | Sc-29085 | 섹션 2 보관: 실온에서 보관 |
| Bacto 한천 | BD(VWR) | 90000-760 | 섹션 3 보관: 실온에서 보관 |
| Bacto 펩톤 | BD(VWR) | 211820 | 섹션 3 보관: 실온에서 보관 |
| β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 07604 | 단면도 7.2 저장: 4에 저장하십시오 ° C |
| 화학발광 기판 키트 | ThermoFisher | 34580 | 섹션 7.2 보관: 4°C에서 보관; C |
| Di-Sodium Hydrogen Phosphate dodecahydrate | Merck | 1.06579.1000 | Section 2 및 7.1 보관: 실온 |
| Dithiothreitol (DTT) | ThermoFisher | 15508013 | Section 4 보관: 4°C에서 보관; C |
| 에탄올 | 머크 | 100983 | 섹션 7.1 보관: 실온에서 보관 |
| 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) | 시그마 알드리치 | ED | 섹션 7.1 보관: 실온에서 보관 |
| 갈락토스(20%(w/v) 재고)Sigma | Aldrich | G0625-1KG / 5KG | 섹션 3 보관: 실온에서 보관 |
| 젤 로딩 염료 (6x) | BioLabs | B7024A | 섹션 7.1 저장: -20°C에서 보관; C |
| Glusose | Sigma-Aldrich | G8270 | Section 저장: 실온 |
| Glycine | Carl | Roth.0079.4 | Section 2 저장: 실온 Glycogen |
| (5 mg/mL) | Invitrogen | AM9510 | Section 7.1 Storage: -20 ° C |
| 염산 (HCl) | PanReac AppliChem | 182109.1211 | 섹션 2, 4 및 7.1 보관 : 실온에서 보관 |
| 마그네슘 아세테이트 (MgAc) | Bernd Kraft | 15274.2600 / C035 | 섹션 4 보관 : 실온에서 보관 |
| 염화 마그네슘 (MgCl2< / sub>) | Sigma Aldrich | M8266 | 섹션 6 보관 : 실온에서 보관 |
| Nu PAGE LDS 샘플 버퍼 (4x) | Invitrogen | 2399549 | 섹션 7.2 보관: 실온에서 |
| 보관 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올 (25:24:1 v/v) | Invitrogen | 15593-031 | 섹션 7.1 보관: 4°C에서 보관; C |
| 염화칼륨 (KCl) | Sigma | P9541 | 섹션 4 보관 : |
| 방사성 라벨 α -32P dATP (3,000 Ci / mmol, 10 mCi / mL) | Hartmann Analytic | SRP-203 | 섹션 7.1 보관 : 4 °C에서 보관; C |
| RadPrime 라벨링 시스템 | ThermoFisher | 18428-011 | 섹션 7.1 보관: -20°C에서 보관; C |
| 라피노스 (20% (w/v) 재고) | SERVA | 34140.03 | 섹션 3 보관: 실온에서 보관 |
| 염화나트륨(NaCl) | Merck | K53710504142 | 섹션 7.1 보관: 실온에서 보관 |
| 구연산나트륨(Na3C6H5O7) | 시그마-알드리치 | 71402 | 섹션 7.1 보관: 실온에서 보관 |
| 수산화나트륨(NaOH) | Sigma Aldrich | S5881 | 섹션 7.1 저장: 실온에서 보관 |
| 나트륨 n-도데실 설페이트 (SDS) (5% 재고 (w/v) ) | Alfa Aesar | A11183 | 섹션 7.1 저장: 실온에서 보관 |
| 소듐 인산 단염기 | Sigma-Aldrich | 71496 | 섹션 2 및 7.1 저장: 실온에서 보관 |
| 나트륨 아지데 | 산타 크루즈 Biotechnology | sc-208393 | Section 2 Storage: store at -20 & deg; 생명공학 sc-208393 섹션 2br/ 저장: -20°C; 씨 |
| Triethylamine | Sigma Aldrich | 90340 | Section 2 보관: 실온에서 보관 |
| Tris base | Chem Cruz | SC-3715B | Section 2 및 4 보관: 실온에서 보관 |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | Section 2 및 4 보관: 실온에서 보관 |
| Tween-20 | Bernd Kraft | 18014332 | 섹션 4 보관: 실온에서 보관 |
| 효모 추출물 | BD(VWR) | 212720 | 섹션 3 보관: 실온에서 보관 |
| 효모 짝짓기 인자 알파(1 &마이크로; g/mL 재고) | Biomol | Y2016.5 | 섹션 3 보관: -20°C에 보관; |
| Sigma Aldrich | Y1376 | 없는 C 효모 합성 드롭아웃 매체 보충제 | , 참조 14 |
| Enzymes | |||
| HpaI 제한 효소(5,000 U/mL) | NEB | R0105S | 섹션 7.1 보관: -20°C에서 보관; C |
| 프로테아제 및 인산가수분해효소 억제제 칵테일 (100개) | ThermoFisher Scientific | 78446 | 섹션 4 저장: 저장 at4 ° C |
| Proteinase K (10 mg/mL) | SERVA | 33756 | 단면도 7.1 저장: -20°C에 저장; C |
| RNase A (10 mg/mL) | ThermoFisher | EN0531 | 섹션 7.1 보관: -20°C에서 보관; C |
| TEV 프로테아제(10000 U/&마이크로; L) | NEB | P8112S | 섹션 5 보관: -20°C에 보관하십시오. C |
| Materials | |||
| BcMag 에폭시 활성화 자석 비드 | Bioclone Inc. | FC-102 | 단면도 2 저장: 4 °에 저장; C |
| 드라이 아이스 | 섹션 4 | ||
| 저결합 원심분리기 튜브 2.0 mL | Eppendorf | 22431102 | 섹션 4 |
| Microspin G-25 컬럼 | Cytiva | 27-5325-01 | 섹션 7.1 보관: 실온에서 보관 |
| Parafilm | Merck | P7793 | 섹션 4 |
| 포지티브 나일론 멤브레인 | Biozol | 11MEMP0001 | 섹션 7.1 보관: 실온에서 보관 |
| PVDF 전사막 | Immobilon-Merck Millipore | IPVH00010 | 섹션 7.2 보관: 방에 보관 온도 |
| SDS-PAGE 젤 4-12% bis-tris (15 well, 1.5 mm) | Invitrogen | NP0336BOX | 섹션 7.2 보관: 4 °에 보관; |
| 루어 피팅이 있는 C 주사기(25mL) | Henke Sass Wolf | 4200-000V0 | Section 3 |
| Whatman 종이(3MM 등급 CHR 셀룰로오스 웨스턴 블로팅 종이 시트) | Cytiva | 3030-917 | 섹션 7.1 보관: 실온 |
| 에서 보관항체 | |||
| Anti-LexA, 토끼 다클론 IgG, DNA 결합 영역 항체 | Merck Millipore | 06-719 | 섹션 7.2 보관: -20°에서 보관; C |
| 염소 안티 토끼 IgG (H + L), 양 고추 냉이 과산화 효소 접합체 | Invitrogen | G21234 | 섹션 7.2 저장 : -20 °에 보관하십시오. |
| C Peroxidase Anti-Peroxidase (PAP) 항체는 TAP 태그가 지정된 단백질의 검출을 위해 토끼에서 생성됨 | Sigma Aldrich | P1291-500UL | 단면도 7.2 저장: -20°C에 저장; C |
| 토끼 IgG 항체 시 | 그마 | I5006-100MG | 단면도 2 저장: 4개의 °에 저장; C |
| Primers (10 &마이크로; M) | |||
| ARS316: fwd 5'- CGGCATTATCGTACACAACCT, rev 5'- GTTCTTCGTTGCCTACATTTTCT | Section 7.1 | ||
| K071 스파이크인 플라스미드 DNA: fwd: 5'-TTTTCGCTGCTTGTCCTTTT, rev 5'- CATTTTCGTCCTCCCAACAT | Section 7.1 | ||
| 효모 게놈 DNA의 PCR 단편을 템플릿으로 사용 ARS316 증폭 (남부 블롯 용) : < / 강> fwd 5 '- AAATTCTGCCCTTGATTCGT rev 5'- TTTGTTTATCTCATCACTAAT | 섹션 7.1 | ||
| PDC1: fwd 5'- CATGATCAGATGGGGCTTCA, rev 5'-ACCGGTGGTAGCGACTCTGT | 섹션 7.1 | ||
| Equipment | |||
| 커피 그라인더 | Gastroback | 42601 | 섹션 4 |
| 듀어 플라스크 | NAL GENE | 4150-2000 | Section 3 |
| DynaMag TM-2 마그네틱 랙 | Invitrogen | 12321D | Section 4, 5 및 6 |
| 하이브리드화 오븐 | Hybaid Mini10 | Ri418 | Section 2 |
| 마이크로 원심분리기 | Eppendorf | 5424R | Section 4 및 7.1 |
| UV 가교제 | 분석기 | 95-0174-02 | Section 7.1 |
참고문헌
- Kornberg, R. D., Lorch, Y. Twenty-five years of the nucleosome, fundamental particle of the eukaryote chromosome. Cell. 98 (3), 285-294 (1999).
- Gauchier, M., van Mierlo, G., Vermeulen, M., Déjardin, J. Purification and enrichment of specific chromatin loci. Nature Methods
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재인쇄 및 허가
