여기에서는 반자동 고처리량 스크리닝 형식으로 루시페라아제 기반 리포터 분석을 사용하기 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
높은 자가포식 플럭스가 종양 진행 및 암 치료 내성과 관련이 있다는 증거가 늘어나고 있습니다. 개별 자가포식 단백질을 분석하는 것은 이 경로를 표적으로 하는 치료 전략의 전제 조건입니다. 자가포식 프로테아제 ATG4B의 억제는 전체 생존율을 증가시키는 것으로 나타났으며, 이는 ATG4B가 암 치료의 잠재적인 약물 표적이 될 수 있음을 시사합니다. 우리 실험실은 세포에서 ATG4B 활성을 모니터링하기 위한 선택적 루시페라아제 기반 분석을 개발했습니다. 이 분석을 위해 ATG4B, LC3B의 기질은 해양 요각류 Gaussia princeps(GLUC)의 비밀 루시페라아제로 C-말단에 태그됩니다. 이 리포터는 액틴 세포골격(actin cytoskeleton)에 연결되어 있어, 세포가 없어졌을 때 세포의 세포질에 보관되어 있다. ATG4B 매개 절단은 비전통적 분비에 의해 GLUC의 방출을 초래하며, 세포 ATG4B 활성의 상관 관계로서 세포 배양에서 상층액을 수확하여 모니터링할 수 있습니다. 이 논문은 이 루시페라아제 기반 분석법을 자동화된 고처리량 스크리닝에 적용하는 방법을 제시합니다. 세포 ATG4B 활성의 모범적인 고처리량 분석을 위한 워크플로우 및 최적화에 대해 설명합니다.
서론
자가포식은 세포가 세포 내 항상성을 유지하고 리소좀 1,2,3을 통해 노화되거나 결함이 있거나 불필요한 세포 내용물을 분해하여 스트레스에 반응할 수 있도록 하는 보존된 대사 과정입니다. 일부 병태생리학적 조건에서 이 과정은 영양소 및 산소 결핍에 대한 중요한 세포 반응으로 작용하여 재활용된 영양소와 지질을 생성하여 세포가 대사 요구에 적응할 수 있도록 합니다 2,3,4. 자가포식은 또한 신경퇴행성 질환, 병원체 감염 및 다양한 유형의 암과 같은 여러 질병과 관련된 세포 스트레스 반응으로 확인되었습니다. 암에서 자가포식의 기능은 복잡하며 종양의 유형, 병기 및 상태에 따라 달라집니다. 손상된 세포의 자가포식 분해를 통해 종양 형성을 억제할 수 있을 뿐만 아니라 저산소증, 영양 결핍 및 세포독성 손상과 같은 스트레스 조건에서 세포 생존을 개선하여 진행성 종양의 생존을 촉진할 수 있습니다
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프로토콜
참고: 분석 프로세스는 그림 1에 요약되어 있습니다. 이 프로토콜에 사용되는 모든 재료, 시약 및 장비와 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
1. 레트로바이러스 생산
참고: ActinLC3dNGLUC를 인코딩하는 플라스미드는 pMOWS-ActinLC3dNGLUC20입니다. 높은 titer 바이러스 생산을 위해 적은 수의 세포를 사용합니다(이상적으로는 P20 미만).
- 형질주입을 위해 파종하기 전에 80%-90%가 합류할 때까지 5%CO2 의 분위기에서 37°C에서 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(P/S)이 보충된 Dulbecco의 변형된 독수리 배지(DMEM)에서 세포를 배HEK293T양합니다.
- transfection 전날, 세포를 1 × 10 6 세포/웰의 2mL/웰 밀도로6 웰 플레이트에 시드합니다. 5 % CO2 분위기의 가습 인큐베이터에서 플레이트를 밤새 배양합니다.
알림: 리포솜 기반 tran....
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결과
이전 간행물8에서 이 분석을 사용하여 저분자 및 siRNA 라이브러리를 스크리닝하고 ATG4B의 새로운 조절자를 식별하는 데 성공했습니다. 여기에서는 이 루시페라아제 리포터의 프로토콜과 대표 결과를 반자동 고처리량 스크리닝 형식으로 설명합니다. 그림 8은 세포핵과 발광에 대한 원시 데이터 분석의 예를 보여줍니다. 발광 측정의 일반적인 결과는 그림 8A에 나와 있습니다. DMSO의 기저 발광 신호는 컬럼 1에서 볼 수 있으며, 컬럼 24에서 ATG4B 억제제 FMK9A의 10μM이 있는 경우 볼 수 있습니다. 동일한 플레이트의 핵 수 결과는 그림 8B에서 볼 수 있습니다. 각 화합물에 대한 원시 값을 중성 대조군 평균값으로 정규화하여 ATG4B 활성 및 세포 생존율의 백분율을 얻었습니다(그림 .......
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토론
이 프로토콜은 ATG4B 억제제의 식별을 위한 세포 기반 리포터 유전자 분석을 설명합니다. 1차 히트의 식별은 β-actin과 dNGLUC 사이에서 LC3B의 전체 길이 개방 판독 프레임을 발현하는 세포 처리에 따른 루시페라아제 활성을 기반으로 합니다. 이 분석법의 몇 가지 장점은 세포를 용해하지 않고 dNGLUC를 검출할 수 있기 때문에 민감하고 정량이 많으며 비침습적이라는 것입니다. 이 논문은 안정적인 세포주와 1차 스크리닝을 생성하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다.
먼저, 본 프로토콜은 높은 transfection 효능과 높은 증식 능력을 나타내는 PANC1 세포주를 사용하였다. 이러한 스크리닝 방법은 다른 세포주를 사용하여 수행할 수 있지만, 형질도입 효능은 세포주마다 다를 수 있다. 둘째, 통로 번호가 5보다 높은 냉동 재고에서 안정적인 세포 집단으로 작업하는 것은 시간이 지남에 따라 보고자의 발현 수준이 감소할 수.......
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공개 사항
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 MRC-UCL 대학 단위 보조금 Ref MC_U12266B, MRC Dementia Platform Grant UK MR/M02492X/1, Pancreatic Cancer UK(보조금 참조 2018RIF_15) 및 MRC Confidence in Concept 2020 UCL MC/PC/19054의 자금 지원을 받는 UCL Therapeutic Acceleration Support 계획에 대한 영국 의학 연구 위원회의 핵심 자금 지원을 받았습니다. ActinLC3dNGLUC (pMOWS-ActinLC3dNGLUC)를 암호화하는 플라스미드는 Dr. Robin Ketteler (베를린 의과대학 인간 의학과)로부터 수득하였다.
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참고문헌
- Kocaturk, N. M., et al. Autophagy as a molecular target for cancer treatment. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 134, 116-137 (2019).
- Fu, Y., et al. Targeting ATG4 in cancer therapy. Cancers. 11 (5), 649(2019).
- Towers, C. G., Thorburn, A. <....
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