Method Article

교차 실험 비교를 위한 세포 주기 동기화 모델의 특성화 손실을 사용한 동기화된 시계열 데이터의 정렬

DOI:

10.3791/65466

⸱

June 9th, 2023

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Duke University, 2Department of Biology, University of Massachusetts, 3Orlando Data Science LLC, 4Department of Computer Science, Duke University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

동기화된 시계열 실험 분석의 한 가지 과제는 실험이 종종 동기 및 세포 주기 기간으로부터의 회복 기간이 다르다는 것입니다. 따라서 서로 다른 실험의 측정값을 집계하여 분석하거나 쉽게 비교할 수 없습니다. 여기에서는 단계별 비교가 가능하도록 실험을 정렬하는 방법을 설명합니다.

Abstract

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세포 주기를 조사하는 것은 종종 세포가 세포 주기를 통과할 때 시계열로 다양한 매개변수를 측정하기 위해 세포 집단을 동기화하는 데 달려 있습니다. 그러나 유사한 조건에서도 반복 실험은 동기화에서 회복하고 세포 주기를 통과하는 데 필요한 시간의 차이를 나타내므로 각 시점에서 직접적인 비교가 불가능합니다. 실험 전반에 걸쳐 동적 측정을 비교하는 문제는 돌연변이 집단 또는 동기 회복 시간 및/또는 세포 주기 기간에 영향을 미치는 대체 성장 조건에서 악화됩니다.

우리는 이전에 세포의 동기 집단이 동기화에서 방출되고 세포 주기를 통해 진행되는 방식을 모니터링하는 CLOCCS(Characterizing Loss of Cell Cycle Synchrony)라는 파라메트릭 수학적 모델을 발표했습니다. 그런 다음 모델에서 학습된 매개 변수를 사용하여 동기화된 시계열 실험의 실험 시점을 정규화된 시간 척도(라이프라인 포인트)로 변환할 수 있습니다. lifeline scale은 실험 시작부터 경과 시간을 분 단위로 나타내는 대신 동기에서 세포 주기 진입까지의 진행을 나타내며 그 다음에는 세포 주기의 단계를 거칩니다. 라이프라인 포인트는 동기화된 모집단 내의 평균 세포 위상에 해당하기 때문에 이 정규화된 시간 척도를 통해 다양한 기간과 회복 시간을 가진 실험을 포함하여 실험 간에 직접 비교할 수 있습니다. 또한, 이 모델은 서로 다른 종(예: Saccharomyces cerevisiae 및 Schizosaccharomyces pombe) 간의 세포 주기 실험을 정렬하는 데 사용되어 세포 주기 측정을 직접 비교할 수 있어 진화적 유사점과 차이점을 밝힐 수 있습니다.

Introduction

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세포주기가 진행됨에 따라 동기화된 세포 집단에 대한 시계열 측정은 세포주기 진행을 제어하는 메커니즘을 조사하기 위한 표준 방법입니다 1,2,3,4,5,6,7,8 . 동시성/릴리스 시계열 실험을 비교하는 기능은 이러한 동적 프로세스를 이해하는 데 매우 중요합니다. 결과를 확증하기 위해 반복 실험을 사용하면 결론의 재현성에 대한 신뢰도를 높일 수 있습니다. 또한 환경 조건, 돌연변이 간, 심지어 종 간의 비교를 통해 세포주기 조절에 대한 많은 새로운 통찰력을 발견 할 수 있습니다. 그러나 동시성으로부터의 회복 및 세포 주기 진행 속도의 실험 간 가변성은 복제물 간 또는 변경된 세포 주기 타이밍이 있는 실험 간에 시점 간 비교를 수행하는 능력을 손상시킵니다. 이러한 문제로 인해, 반복실험은 종종 전체 시계열(예: Spellm....

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Protocol

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1. 세포주기 단계 및 실험 데이터 수집

  1. 원하는 동기화 방법을 사용하여 세포 주기에 대해 세포를 동기화한다 (예를 들어, Leman et al.18에 기술된 바와 같은 원심 용출 또는 Rosebrock 19에 기술된 바와 같은 짝짓기 페로몬 정지; Leman et al.18 및 Rosebrock19 둘 다 동기화로부터 방출하기 위한 방법을 포함한다). 시계열 전체에서 샘플링을 시작하여 시계열의 길이가 최소 2개의 전체 셀 주기 기간인지 확인하고 최적으로 셀 주기당 최소 10개의 샘플을 수집합니다. 각 시점에서 아래에 설명된 대로 세포 주기 단계 데이터(신진 또는 유세포 분석)를 위한 샘플과 실험 데이터를 위한 샘플을 수집합니다.
  2. 신진 데이터를 세포 주기 단계 데이터로 사용하는 경우 CLOCCS 정렬을 위해 신진에 대한 데이터를 수집합니다.
    1. 시계열 전체에서 샘플링합니다. 각 시점에 대해 세포를 수집하고 Leman et al.18에 설명된 대로 200μL의 초음파 처리된 세포 배양액과 200μL의 고정 용액....

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Results

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위의 프로토콜과 그림 1 의 워크플로우에 설명된 단계를 5개의 세포 주기 동기화 시계열 실험에 적용하여 서로 다른 동기화 방법(짝짓기 페로몬 및 원심 용출18)을 사용한 복제물과 염기서열 분석 플랫폼(RNA 시퀀싱[RNA-seq] 및 마이크로어레이) 간의 두 가지 대표적인 비교를 입증했습니다. S. cerevisiae를 사용하여 여러 실험을 수행하고, 각 실험에 대해 세포 주기 단계 및 실험 데이터를 수집하였다. 워크플로에는 CLOCCS를 사용하여 다양한 동기화/릴리스 시계열 실험을 매개 변수화하고, 이러한 매개 변수를 사용하여 실험을 일반적인 비교 가능한 라이프라인 척도에 맞춘 다음, 두 가지 대표 비교에 이러한 정렬된 실험을 사용하는 작업이 포함됩니다.

반복실험 전반에 걸친 대표적인 비교를 입증하기 위해 동일한 균주와 동일한 실험 조건에서 수행된 세 가지 실험(조건.......

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 논문은 동기화된 세포 집단에 대한 시계열 실험의 데이터를 보다 정확하고 정량적으로 평가하는 방법을 제시합니다. 이 방법은 각 실험을 파라미터화하기 위해 신진 데이터 및 유세포 분석 DNA 함량 데이터와 같은 입력 세포 주기 단계 데이터를 사용하는 베이지안 추론 모델인 CLOCCS에서 학습된 매개변수를 활용합니다(14,15). CLOCCS는 입력 세포 주기 단계 데이터를 사용하여 각 실험에 대한 파라미터를 추론한 다음 공통 라이프라인 척도에 맞추는 데 사용합니다. 여러 동시성/릴리스 시계열 실험을 단일 라이프라인 정렬 시간 척도로 변환하면 이전에는 어렵거나 불가능했던 실험과 여러 반복 실험의 집계 간에 단계별 관련 비교가 가능합니다.

이 프로토콜의 중요한 단계에는 데이터 수집, CLOCCS 실행, 데이터 세트 정렬 및 데이터 세트 간 비교가 포함됩니다. 먼저 이 프로토콜에서.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S. Campione과 S. Haase는 국립 과학 재단 (DMS-1839288)과 국립 보건원 (5R01GM126555)의 자금 지원을 받았습니다. 또한 저자는 원고에 대한 의견과 프로토콜 베타 테스트에 대해 Huarui Zhou(Duke University)에게 감사를 표합니다. 또한 Java 코드에 도움을 준 Francis Motta(Florida Atlantic University)와 Joshua Robinson에게도 감사드립니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
PBS. Leman 2014에 설명되어 있습니다.
정착 해결책을 위한4% 포름알데히드
100% 에탄올유세포 분석 고정용. Haase 2002에 설명되어 있습니다.
CLOCCShttps://gitlab.com/haase-lab-group/cloccs_alignment.git
유세포분석기 유세포 분석 프로토콜용.
Githttps://git-scm.com/
Java 19https://www.oracle.com/java/technologies/downloads/#java19
현미경세포와 새싹을 세는 데 사용됩니다.
Minicondahttps://docs.conda.io/en/latest/
프로테아제 솔루션유세포 분석 프로토콜용. Haase 2002에 설명되어 있습니다.
RNAse: 유. Haase 2002에 설명되어 있습니다.
SYTOX Green Nucleic Acid StainInvitrogenS7020유세포 분석용 염색. Haase 2002에 설명되어 있습니다.
트리스pH 7.5
고착 용액용 2개.세포 분석 프로토콜용 솔루션

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tyers, M., Tokiwa, G., Futcher, B. Comparison of the Saccharomyces cerevisiae G1 cyclins: Cln3 may be an upstream activator of Cln1, Cln2 and other cyclins. EMBO Journal. 12 (5), 1955-1968 (1993).
  2. Schwob, E., Nasmyth, K.

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Cell Cycle SynchronyTime Series AlignmentLifeline NormalizationCross Experiment ComparisonSynchronized Cell PopulationsCell Cycle PhaseFlow CytometryBudding YeastTranscriptomic DataProteomic Data

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