여기에서는 GMP 등급의 용해성 마이크로캐리어를 기반으로 하는 완전 폐쇄형 시스템을 통해 부착 세포의 대규모 제조를 달성하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 인간 중간엽 줄기 세포, HEK293T 세포 및 Vero 세포의 배양은 검증되었으며 세포 및 유전자 치료 산업의 수량 요구와 품질 기준을 모두 충족했습니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
방법 논문
GMP 등급의 용해성 다공성 마이크로캐리어를 기반으로 한 대규모 셀 생산
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
세포 및 유전자 치료(CGT) 산업의 연구자들은 세포의 효율적이고 대규모적인 확장이라는 만만치 않은 과제에 오랫동안 직면해 왔습니다. 2차원(2D) 평면 배양 시스템의 주요 단점을 해결하기 위해 인간 중간엽 줄기/기질 세포(hMSC), HEK293T 세포 및 Vero 세포를 포함한 부착 세포의 3D 배양을 위한 GMP 등급의 용해성 다공성 마이크로캐리어를 기반으로 하는 자동 폐쇄형 산업 규모 세포 생산(ACISCP) 플랫폼을 혁신적으로 개발했습니다. 대규모 확장을 달성하기 위해 5L 및 15L 교반 탱크 바이오리액터로 2단계 확장을 수행하여 9일 이내에 전체 128배 팽창으로 1.1 x 1010 hMSC를 생산했습니다. 세포는 마이크로캐리어를 완전히 용해시켜 수거하고, 농축하고, 세척하고, 연속 흐름 원심분리기 기반 세포 처리 시스템으로 제형화한 다음, 세포 충전 시스템으로 분주하였다. 2D 평면 배양과 비교했을 때, 3D 배양에서 채취한 hMSC의 품질에는 큰 차이가 없습니다. 우리는 또한 이러한 용해성 다공성 마이크로캐리어를 CGT 부문의 다른 인기 있는 세포 유형에도 적용했습니다. 구체적으로, HEK293T 세포 및 Vero 세포는 각각 1.68 x 10 7 cells/mL 및 1.08 x 107 cells/mL의 피크 세포 밀도로 배양되었습니다. 이 연구는 부착 세포의 산업 규모 제조를 달성하기 위해 GMP 등급 용해성 마이크로캐리어 및 고급 폐쇄 장비의 특성을 활용하는 바이오프로세스 엔지니어링 플랫폼을 사용하기 위한 프로토콜을 제공합니다.
서론
CGT 산업은 지난 20년 동안 기하급수적으로 확장되었습니다. 차세대 의약품의 발전은 수많은 난치성 질환을 치료하고 완치할 것으로 예상됩니다1. 2017년 미국 식품의약국(FDA)이 CGT 제품인 킴리아(Kymriah)를 최초로 승인한 이후, 전 세계적으로 CGT 관련 연구 개발은 빠른 속도로 계속 성장하고 있으며, FDA는 CGT에 대한 활발한 임상시험용 신약 신청이 2018년에 500건으로 증가했다고 밝혔다2. 2030년까지 미국에서 CGT 제품의 승인 건수는 54-74건이 될 것으로 예측되었다2.
CGT 연구 및 혁신의 급속한 성장은 흥미진진하지만, 저렴한 비용으로 필요한 만큼 많은 환자에게 도달할 수 있는 유망한 의약품을 제공할 수 있는 실험실 연구와 산업 규모 제조 사이에는 여전히 큰 기술 격차가 있습니다. 이러한 임상시험에 채택된 현재 공정은 소규모 실험을 위해 실험실에서 확립되었으며, CGT 제조를 개선하고 혁신하기 위해서는 상당한 노력이 필요하다3. CGT 제품에는 여러 유형이 있으며, 대부분은 동종 세포, 자가 세포, 엔지니어링 또는 천연 세포를 기반으로 합....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
인간 탯줄은 베이징 칭화 창겅 병원에서 입수했습니다. 인간 탯줄 중간엽 줄기세포(UCMSC)의 획득, 분리 및 배양에 관한 모든 절차와 프로토콜은 정보에 입각한 동의와 베이징 칭화창겅 병원 윤리 위원회(출원 번호 22035-4-02)의 승인을 받아 수행되었으며, 절차와 프로토콜은 1964년 헬싱키 선언 및 이후 개정안 또는 이에 상응하는 윤리 기준을 준수했습니다.
1. hMSC, HEK293T 세포 및 Vero 세포의 단층 배양
- 보고된 방법21에 따라 Wharton's jelly에서 1차 인간 UCMSC를 분리합니다. 일차 UCMSC의 분리 및 증식을 위해 무혈청(SF) hMSC 배양 배지를 사용하고, 통로 2에서 세포를 수확하고, 마스터 세포 은행(MCB)으로 냉동 보존합니다.
- 단층 배양을 위해 하나의 T75 플라스크에 6 x 105 개의 인간 UCMSC(바람직하게는 통로 2 또는 통로 3 세포)를 15mL의 완전한 SF hMSC 배양 배지로 접종합니다(즉, 2D 평면 용기의 파종 밀도는 8,000 cells/cm2). 플라스크의 8자 이동을 통해 균일한 파종을 보장합니다. 37°C에서 5%
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
ACISCP 플랫폼은 확장 확장을 위한 일련의 교반 탱크 바이오리액터, 자동화된 세포 수확 및 제형을 위한 세포 처리 시스템, 세포 주입 시스템을 사용하는 완전 폐쇄형 시스템입니다(그림 1). 부착 세포는 다공성 마이크로 캐리어에 부착되어 생물 반응기로 분산될 수 있으므로 부착 세포의 부유 배양을 달성할 수 있습니다.
설명된 프로토콜에 따라, 10g의 W01 마이크로캐리어가 포함된 2.5 x 108 hMSC를 초기 팽창을 위해 5L 교반 탱크 바이오리액터에 먼저 접종했습니다. 약 2.9 x 10 9 세포를 농축하여 4일째에 세포 처리 시스템에 의해 세척하고, 그 중 1.0 x 109 수거된 세포를 2단계 배양을 위해 40g의 W01 마이크로캐리어와 함께 15L 교반 탱크 바이오리액터로 통과시켰다. 최종적으로 1.1 x 10 10 MSC를 수확하여 제형화한 후 9일째에<.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
면역 요법과 줄기 세포 요법 모두 살아있는 세포를 약물로 사용합니다. 그러나 최종 제품은 저분자 또는 바이러스와 같은 방식으로 정제하거나 멸균해서는 안 됩니다. 그러므로, QbD(Quality by Design)의 원칙은 항상 염두에 두어야 하며, 셀 생산 중 화학 제조 및 제어(CMC) 공정에 실질적으로 적용되어야 한다23. 완전 폐쇄형 세포 배양 시스템, 처리 시스템 및 충전 시스템은 요구 사항을 충족하는 것으로 우선적으로 고려됩니다. 이 연구에서는 GMP 등급, 용해성 및 다공성 3D 마이크로캐리어를 기반으로 하는 ACISCP 플랫폼을 활용하여 hMSC의 2계층 확장을 수행하기 위한 프로토콜을 제시했습니다. 일부 연구자들은 시험관 내에서 hMSC를 확장하기 위해 마이크로캐리어와 함께 바이오리액터를 사용하는 타당성을 탐구했지만, 보고된 연구의 대다수는 규모가 증가하면 hMSC 수율이 감소하여 100mL의 작업 부피에서 6.1 x 10 5 cells/mL 또는 12.5.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
Y.D.는 과학 고문이며, H.X., Y.Z., L.G., M.L., Y.Y., W.L. 및 X.Y.는 Beijing CytoNiche Biotechnology Co. Ltd.의 직원입니다. 다른 저자는 이 문서에 설명된 제품이나 회사에 대해 상업적, 독점적 또는 재정적 이해관계가 없습니다. 다른 모든 저자는 경쟁 이익이 없음을 선언합니다.
감사의 글
이 연구는 미국 국립과학재단(National Science Foundation for Distinguished Young Scholars, 82125018)의 재정 지원을 받았습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.25% 트립신 EDTA | BasalMedia | S310JV | 는 2D 세포 수확에 사용됩니다. |
| 3D FloTrix Digest | CytoNiche Biotech | R001-500 | 이것은 3D TableTrix 마이크로캐리어를 특이적으로 용해시키는 시약입니다. |
| 3D FloTrix MSC 무혈청 배지 | CytoNiche Biotech | RMZ112 | 2D 평면 배양에서 중간엽 줄기 세포 확장 및 유지 및 3D TableTrix 마이크로캐리어에서 3D 배양을 위한 무혈청, 무동물 배지입니다. |
| 3D FloTrix 일회용 여과 모듈 | CytoNiche Biotech | R020-00-10 | 이 모듈에는 0.22 μ M 캡슐 필터는 배양 배지 및 소화 용액의 여과에 사용됩니다. |
| 3D FloTrix 일회용 보관 백(10L) | CytoNiche Biotech | R020-00-03 | 5L 생물반응기용 사료 백으로 사용됩니다. |
| 3D FloTrix 일회용 보관 백(3L) | CytoNiche Biotech | R020-00-01 | 세포 파종 또는 전사 백으로 사용됩니다. |
| 3D FloTrix 일회용 보관 백(50L) | CytoNiche Biotech | R020-00-04 | 15L 생물반응기용 사료 백으로 사용됩니다. |
| 3D FloTrix vivaPACK 일회용 채우기 및 마감 소모품 키트 | CytoNiche Biotech | PACK-01-01 | 이것은 3D vivaPACK 충전 및 마감 시스템에 적합한 표준 키트입니다. |
| 세포용 3D FloTrix vivaPACK 충진 및 마감 시스템 | CytoNiche Biotech | vivaPACK | 이 시스템은 자동 혼합 및 가스 배기 기능을 갖춘 폐쇄형 액체 처리 장치입니다. 동결 보존 버퍼에 재현탁된 세포는 배치당 20개의 백으로 빠르고 균일하게 분주될 수 있습니다. |
| 3D FloTrix vivaPREP PLUS 세포 처리 시스템 | CytoNiche Biotech | vivaPREP PLUS | 이 시스템은 연속 흐름 원심분리기 기반 장치입니다. 세포는 완전히 폐쇄된 절차로 농축, 세척 및 재현탁할 수 있습니다. |
| 3D FloTrix vivaPREP PLUS 일회용 세포 처리 키트 | CytoNiche Biotech | PREP-PLUS-00 | 3D vivaPREP PLUS 세포 처리에 적합한 표준 키트입니다. |
| 3D FloTrix vivaSPIN 생물반응기 15 L | CytoNiche Biotech | FTVS15 | 이 생물반응기 제품은 컨트롤러, 15 L 유리 교반 탱크 용기 및 평가를 사용합니다. 특수 관류 튜브를 사용할 수 있습니다. |
| 3D FloTrix vivaSPIN 생물반응기 5 L | CytoNiche Biotech | FTVS05 | 이 생물반응기 제품은 컨트롤러, 5 L 유리 교반 탱크 용기 및 평가를 사용합니다. 특수 관류 튜브를 사용할 수 있습니다. |
| 3D FloTrix vivaSPIN 폐쇄 시스템 소모품 팩(10/15L) | CytoNiche Biotech | R020-10-10 | 샘플링 백이 포함된 3D vivaSPIN 생물반응기 15 L에 적합한 표준 튜빙 키트입니다. |
| 3D FloTrix vivaSPIN 폐쇄 시스템 소모품 팩(2/5L) | CytoNiche Biotech | R020-05-10 | 샘플링 백이 포함된 3D vivaSPIN 바이오리액터 5 L에 적합한 표준 튜빙 키트입니다. |
| 3D TableTrix 마이크로캐리어 G02 | CytoNiche Biotech | G02-10-10g | 이 다공성 및 분해성 마이크로캐리어는 HEK293T세포 배양에 적합합니다. 생물 반응기의 튜브에 용접하기 위해 C-Flex 튜브와 함께 10g/병으로 사전 멸균 상태로 제공됩니다. |
| 3D TableTrix 마이크로캐리어 V01 | CytoNiche Biotech | V01-100-10g | 이 다공성 및 분해성 마이크로캐리어는 부착성 세포 배양에 적합하며, 사용하기 전에 PBS에서 고압멸균해야 하는 비멸균 마이크로캐리어로 제공됩니다. 특히 백신 생산에 적합합니다. |
| 3D TableTrix 마이크로캐리어 W01 | CytoNiche Biotech | W01-10-10g(일회용 패키징); W01-200 (정제) | 이 다공성 및 분해성 마이크로캐리어는 부착성 세포 배양, 특히 최종 산물로 수확해야 하는 세포에 적합합니다. 생물 반응기의 튜브에 용접하기 위해 C-Flex 튜브와 함께 10g/병으로 사전 멸균 상태로 제공됩니다. 이 제품은 CDE로부터 제약 부형제에 대한 2가지 자격을 획득했으며 등록 번호는 [F20200000496; F20210000003]입니다. 또한 FDA로부터 제약 부형제에 대한 DMF 자격을 받았으며 등록 번호 [DMF:35481] |
| APC anti-human CD45 Antibody | BioLegend | 368512 | MSC 동일성 평가를 위한 유세포 분석에 사용 |
| Calcein-AM/PI 이중 염색 키트 | Dojindo | C542 | Calcein-AM/PI Double Staining Kit는 생존 세포와 죽은 세포의 동시 형광 염색에 사용됩니다. 이 키트에는 생존 세포와 사멸 세포를 각각 염색하는 Calcein-AM 및 Propidium Iodide(PI) 용액이 포함되어 있습니다. |
| EZ Top 용기 마개용 캡 NALGENE-containers(500mL) | Saint-Gobain | CAP-38 | 브랜드 및 카탈로그 번호는 예를 들어 다양한 공급업체에서 유사한 제품을 구입할 수 있으며 동일한 기능을 제공하는 한 다른 브랜드로 대체할 수 있습니다. |
| C-Flex 튜빙, 제형 374 (0.25 in x 0.44 in) | Saint-Gobain | 374-250-3 | 튜브 용접 및 분리에 사용됩니다. |
| CryoMACS 냉동 백 50 | Miltenyi Biotec | 200-074-400 | 3D FloTrix vivaPACK 일회용 채우기 확장에 사용됩니다. 마감 소모품 키트. |
| 디메틸 설페이트 (DMSO) | Sigma | D2650-100mL | 동결 보존 용액의 제조에 사용됩니다. |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | BasalMedia | L120KJ | HEK293T 및 Vero 세포의 배양에 사용됩니다. |
| DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (2 L) | DWK 생명 과학 | 218016357 | 5 L 생물 반응기에서 폐기물을 수거하는 데 사용됩니다. |
| DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (5 L) | DWK 생명 과학 | 218017353 | 15 L 생물 반응기에서 폐기물을 수거하는 데 사용됩니다. |
| DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (500 mL) | DWK 생명 과학 | 218014459 | 0.1 M NaOH의 보조 병에 사용됩니다. |
| NALGENE-containers(500mL)용 EZ Top Container ClosuresSaint-Gobain | EZ500 ML-38-2 | 브랜드 및 카탈로그 번호는 예를 들어 다양한 공급업체에서 유사한 제품을 구입할 수 있으며 동일한 기능을 제공하는 한 다른 브랜드로 대체할 수 있습니다. | |
| 소태아혈청(FBS) 우수한 품질의 | Wisent | 086-150 | HEK293T세포 배양에 사용됩니다. |
| FITC anti-human CD14 Antibody | BioLegend | 301804 | MSC 동정 평가를 위한 유세포 분석에 사용됩니다. |
| FITC anti-human CD34 Antibody | BioLegend | 343504 | MSC 동정 평가를 위한 유세포 분석에 사용됩니다. |
| FITC anti-human CD90 (Thy1) 항체 | BioLegend | 328108 | MSC 동정 평가를 위한 유세포 분석에 사용됩니다. |
| 유세포 분석 | Beckman Coulter | CytoFLEX | 세포 식별 평가에 사용됩니다. |
| 형광 세포 분석기 | Alit 생명 과학 | Countstar Rigel S2 | 세포 계수에 사용됩니다. 세포 생존율은 AO/PI 염료로 염색하여 계산할 수 있습니다. |
| GL 45 멀티포트 커넥터 스크류 캡, 2 포트 | DWK 생명 과학 | 292632806 | 브랜드 및 카탈로그 번호는 예를 들어 다양한 공급 업체에서 유사한 제품을 구입할 수 있으며 동일한 기능을 가진 한 다른 브랜드로 대체 될 수 있습니다. |
| 혈당 측정기 | Sinocare | 6243578 | 세포 배양 배지 및 상등액에서 포도당 농도를 감지하는 데 사용됩니다. |
| 칼슘과 마그네슘이 함유된 Hank's Balanced Salt Solution(HBSS) | Gibco | 14025092 | 소화 용액 준비에 사용됩니다. |
| 인간 알부민 20% Behring (HSA) | CSL Behring | N/A | 세척 완충액의 준비를 위해 사용하는. |
| 도립 형광 현미경 | OLYMBUS | CKX53SF | brifgt 필드 및 형광 관찰 및 이미징에 사용됩니다. |
| Nalgene 측정 실린더 (500 mL) | Thermo Scientific | 3662-0500PK | 연동 펌프의 액체 처리 체적 속도를 교정하는 데 사용됩니다. |
| 신생아 송아지 혈청(NBS) 초미세 | MINHAI BIO | SC101.02 | Vero 세포의 배양에 사용됩니다. |
| OriCell 인간 중간엽 줄기세포 지방생성 분화 및 특성화 키트 | Cyagen | HUXUC-90031 | hUCMSC의 삼중 계통 분화에 사용됩니다. |
| OriCell 인간 중간엽 줄기 세포 연골 형성 분화 및 특성화 키트 | Cyagen | HUXUC-90041 | hUCMSC의 삼중 계통 분화에 사용됩니다. |
| OriCell 인간 중간엽 줄기세포 골형성 분화 및 특성화 키트 | Cyagen | HUXUC-90021 | hUCMSC의 삼중 계통 분화에 사용됩니다. |
| PE anti-human CD105 Antibody | BioLegend | 800504 | MSC 동일성 평가를 위한 유세포 분석에 사용됩니다. |
| PE anti-human CD19 Antibody | BioLegend | 302208 | MSC 동정 평가를 위한 유세포 분석에 사용됩니다. |
| PE anti-human CD73 (Ecto-5'-nucleotidase) 항체 | BioLegend | 344004 | MSC 동일성 평가를 위한 유세포 분석에 사용됩니다. |
| PE anti-human HLA-DR 항체 | BioLegend | 307605 | MSC 동일성 평가를 위한 유세포 분석에 사용됩니다. |
| 인산염 완충 식염수(PBS) | Wisent | 311-010-CL | 유리 용기 및 V01 마이크로캐리어의 오토클레이빙 및 배양 배지 교체에 사용됩니다. |
| Sani-Tech 플래티넘 경화 위생 실리콘 튜빙 (0.13 인치 x 0.25 인치) | Saint-Gobain | ULTRA-C-125-2F | 연동 펌프로 구동되는 용액 전송에 사용됩니다. |
| 멸균 식염수 | Hopebiol | HBPP008-500 | 세척 완충액 제조에 사용됩니다. |
| Trypzyme 재조합 Trypsin | BasalMedia | S342JV | 이 시약은 HEK293T 및 Vero 세포의 bead-to-bead 전달에 사용됩니다. |
| 튜브 실러 | Yingqi Biotech | Tube Sealer I | 이 실러는 C-Flex 튜빙 및 PVC 튜빙과 모두 호환됩니다. |
| PVC 튜빙 용 튜브 용접기 | Chu Biotech | Tube Welder Micro | PVC 튜브 용접에 사용했습니다. |
| TPE 튜빙용 튜브 용접기 | Yingqi Biotech | 튜브 용접기 I-V2 | TPE 튜빙 용접에 사용됩니다. |
| ViaStain AO / PI Viability Stains | Nexcelom | CS2-0106-25mL | 이중 형광 생존도는 아크리딘 오렌지(AO) 및 프로피듐 요오드화물(PI)을 사용하여 PBMC와 같은 일차 세포 및 파편이 포함된 샘플의 줄기 세포의 정확한 생존도 분석에 권장되는 방법입니다. |
참고문헌
- Golchin, A., Farahany, T. Z. Biological products: Cellular therapy and FDA approved products. Stem Cell Reviews and Reports. 15 (2), 166-175 (2019).
- Young, C. M., Quinn, C., Trusheim, M. R.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
