이 프로토콜은 cAMP 센서와 광유전 단백질인 bPAC-nLuc를 transfection하여 세포 분포와 광 자극에 대한 반응을 정확하게 추적합니다. 포인트 스캐닝 시스템을 사용하여 cAMP 응답 맵을 만드는 혁신적인 접근 방식은 다양한 분야에서 광유전 단백질에 대한 연구를 발전시킬 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
우리의 목표는 광유전 단백질의 세포 분포를 정확하게 추적하고 특정 세포질 위치 내에서 그 기능을 평가하는 것이었습니다. 이를 위해 핵 표적 cAMP 센서와 실험실에서 개발한 광유전 단백질인 박테리아 광활성성 아데닐릴 시클라아제-나노루시퍼라제(bPAC-nLuc)와 세포를 동시 transfection했습니다. bPAC-nLuc는 445nm 광 또는 루시페라제 기판으로 자극될 때 아데노신 3',5'-고리형 일인산염(cAMP)을 생성합니다. 우리는 HC-1 세포의 세포질 전체에 걸쳐 작은 조명 반점(~1μm2)의 그리드/매트릭스 패턴을 생성할 수 있는 포인트 스캐닝 시스템에 연결된 고체 레이저 조명기를 사용했습니다. 이를 통해 핵 표적 bPAC-nLuc의 분포를 효과적으로 추적하고 포괄적인 cAMP 대응 맵을 생성할 수 있었습니다. 이 지도는 bPAC-nLuc의 세포 분포를 정확하게 나타내었으며, 광 자극에 대한 반응은 조명된 점의 단백질 양에 따라 달랐습니다. 이 혁신적인 접근 방식은 세포 광유전 단백질을 조사하는 데 사용할 수 있는 기술 툴킷을 확장하는 데 기여합니다. 높은 정밀도로 분포와 반응을 매핑할 수 있는 능력은 광범위한 잠재력을 가지고 있으며 다양한 연구 분야를 발전시킬 수 있습니다.
서론
신경과학에 혁명을 일으킨 도구로 탄생한 광유전학은 이제 전 세계 많은 실험실과 생물학의 다양한 연구 분야에서 일상적으로 사용되는 성장하는 연구 분야이자 떠오르는 기술입니다. Beggiatoa sp.(박테리아 광활성 아데닐릴 시클라제, bPAC)의 빛에 민감한 아데닐릴 시클라아제(AC)를 나노루시퍼라제(nLuc)1,2,3에 융합하여 다재다능한 광유전 단백질인 bPAC-nLuc를 개발했습니다. 청색광으로 자극되면 bPAC은 두 번째 메신저 3',5'-고리형 아데노신 일인산염(cAMP)을 생성합니다. nLuc는 최근에 개발된 작은 루시페라아제로, 기질 중 하나가 있는 상태에서 생물 발광을 생성하고 cAMP 생산을 활성화할 수 있습니다4. 따라서 이 광유전 단백질은 짧은 광 펄스를 사용하여 일시적으로 활성화하거나 Furimazine 또는 기타 루시페라제 기질을 통해 꾸준히 활성화될 수 있으므로 다양한 cAMP 신호 패턴을 모방하고 세포 반응(전사 인자 활성화, 유전자 발현, 세포 증식, 이동 등)을 평가할 수 있습니다. 최근 2차 메신저 신호전달의 발전은 매우 제한된 세포....
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프로토콜
1. HC-1 세포 배양 및 이미징 준비
- 10% 소 태아 혈청(FBS), 페니실린(100IU/L), 스트렙토마이신(100mg/L) 및 L-글루타민이 보충된 DMEM에서 HC-1 세포를 유지하고 10cm 접시에 담고 95% 가습 공기에서 37°C, 5% CO2에서 배양합니다.
- 세포가 1:5 또는 1:10 희석액을 사용하여 ~90% 융합되면 2-4일마다 세포를 계대 배양합니다.
- 실험 2일 전에 유리 커버슬립에 형질 주입을 위한 종자 세포.
- 예열된 배지와 PBS가 있는 조직 배양 후드에서 멸균 상태로 작업하고, 거의 합류하는 세포 접시에서 배지를 흡인하고 5mL의 PBS로 부드럽게 세척합니다.
- PBS를 흡인하고 트립신 1mL를 추가합니다. 세포가 분리될 때까지 37°C에서 3-5분 동안 배양합니다.
- 4mL의 배지에 세포를 재현탁하고 세포 현탁액을 15mL 코니컬 튜브로 옮깁니다.
- 혈구계를 사용하여 세포 수를 세고 세포 밀도를 계산합니다.
- 세포를 1.5 x 104 cells/mL의 밀도로 희석합니다.
- 6웰 접시에 폴리-D-라이신 코팅이 된 25mm 유리 커버슬립에 세포 현탁....
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결과
그림 1에 제시된 결과는 세포핵을 향한 자극만이 측정 가능한 cAMP 상승을 유도할 수 있었음을 보여줍니다. 이는 NLS-bPAC-nLuc이 HC-1 세포의 핵 구획에서만 독점적으로 발현된다는 것을 확인시켜 줍니다. 이러한 그리드/매트릭스 패턴을 사용하여 광유전학 단백질을 정밀하게 자극함으로써 세포 내 분포를 매핑할 수 있습니다. 또한, 핵 중심부에서 더 높은 cAMP 상승이 나타나는 것은 핵 주변부에 배치된 스폿에 비해 중심부 스폿에 의해 시뮬레이션된 bPAC-nLuc의 질량이 더 높기 때문입니다(그림 1).
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토론
이 연구의 목적은 광유전학적 단백질의 세포내 분포를 정확하게 모니터링하고 특정 세포질 구획 내에서 그 성능을 평가하는 것이었습니다. 우리는 또한 광유전학적 단백질을 발현하는 세포에 대한 포인트 스캐닝 시스템의 정확한 자극 기능을 보여주었습니다. 이를 달성하기 위해 우리는 발현 수준은 높지만 핵에 국한된 분포가 매우 제한된 핵 표적 bPAC-nLuc를 사용했습니다. 결과는 광유전학적 단백질의 세포 분포에 따라 ~1μm만 분리된 자극 지점이 cAMP 생산을 유발할 수 있거나 유발하지 않을 수 있음을 보여주었습니다. 핵에 대한 자극만이 cAMP 수준을 높일 수 있었습니다. 이 프로토콜에서 목표는 국부적인 cAMP 상승을 생성하는 것이 아니라 짧은 빛 자극이 주변 단백질을 자극하지 않고 세포의 매우 제한된 영역에서 광유전학적 단백질을 활성화할 수 있을 만큼 충분히 정확할 수 있음을 보여주는 것이었습니다. 그러나 이 접근법은 확산 분포 및/또는 국소적인 cAMP 상승 생성을 갖는 다른 광유전학적 단백질의 연구에 필요한 제어를 구성합니다........
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공개 사항
저자는 경쟁 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
자금은 미국 국립보건원(NIH)의 R01 GM099775 및 D.L.A.에 대한 GM130612 보조금으로 제공되었습니다.
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참고문헌
- Naim, N., et al. Luminescence-activated nucleotide cyclase regulates spatial and temporal cAMP synthesis. The Journal of Biological Chemistry. 294 (4), 1095-1103 (2019).
- Naim, N., Reece, J. M., Zhang, X., Altschuler, D. L.
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