이 프로토콜은 블레오마이신 처리된 인간 말초 림프구의 간기 핵에서 γH2AX 및 53BP1 병소의 동시 검출을 통해 DNA 이중 가닥 절단의 형성 및 복구를 평가하는 방법을 제시합니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
이중 가닥 절단(DSB)은 세포핵에서 발생할 수 있는 가장 심각한 병변 중 하나이며, 복구하지 않으면 암을 포함한 심각한 결과를 초래할 수 있습니다. 따라서 세포에는 DSB를 복구하는 복잡한 메커니즘이 제공되며 이러한 경로는 Ser-139(즉, γH2AX) 및 p53 결합 단백질 1(53BP1)에서 인산화된 형태의 히스톤 H2AX를 포함합니다. 두 단백질 모두 DSB 부위에서 병소를 형성할 수 있기 때문에 이러한 마커의 식별은 DSB와 복구 동역학을 모두 연구하는 데 적합한 방법으로 간주됩니다. γH2AX 및 53BP1 병소의 형성으로 이어지는 분자 과정에 따르면, 두 개의 DNA 손상 마커를 동시에 검출하여 DSB를 정량화할 수 있는 대체 접근법을 설정하기 위해 DSB 근처의 공동 국소화를 조사하는 것이 더 유용할 수 있습니다. 따라서, 이 프로토콜은 이중 면역형광에서 γH2AX 및 53BP1 병소의 존재를 통해 방사성 모방제 블레오마이신에 의해 인간 림프구에서 유도된 게놈 손상을 평가하는 것을 목표로 한다. 이 방법론을 사용하여 우리는 또한 블레오마이신 유도 DSB의 복구 역학을 연구하기 위한 예비 시도로 시간 경과에 따른 γH2AX 및 53BP1 병소 수의 변화를 설명했습니다.
서론
DNA 손상은 세포 산화 대사에 의해 생성된 ROS와 같은 내인성일 수 있는 작용제에 의해 연속적으로 유도되거나, 또는 외인성, 화학적 및 물리적둘 다1. 가장 해로운 병변 중 이중 가닥 절단(DSB)은 염색체 이상을 일으켜 발암 과정을 시작할 수 있기 때문에 게놈 불안정성에 기여하는 근본적인 역할을 합니다. 따라서, 세포는 DSBs를 복구하는 복잡하고 효율적인 메카니즘을 제공받는다2.
DSB가 발생하면 세포는 MRE11/RAD50/NBS1 복합체와 함께 ATM 또는 ATR 키나아제를 모집하여 세포 주기를 늦추거나 멈추게 하는 다른 단백질을 활성화하는 DNA 손상 반응(DDR)을 유발합니다3. 이러한 키나아제의 필수 표적은 히스톤 H2AX이며, 이는 DSB(즉, γH2AX)로부터 몇 메가베이스 내에서 Ser-139에 인산화되어 BRCA1 및 p53 결합 단백질 1(53BP1)3. 나중에, 상동 재조합 (HR), 비-상동 말단 접합 (NHEJ), 또는 단일-가닥 어닐링 (SSA) 중 하나의 경로가 DSB를 복구하기 위해 트리거된다 <....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
이 연구는 피사 대학교 윤리위원회의 승인을 받았으며 각 기증자로부터 정보에 입각하고 서명 된 동의를 얻었습니다.
1. γH2AX 및 53BP1 병소의 형성
- 시료 준비 및 돌연변이 유발 처리
- 항응고제로 리튬 헤파린이 포함된 혈액 수집(예: Vacutainer) 튜브에서 건강한 성인 개인의 정맥 천자에 의한 전혈 샘플을 수집합니다.
- 적절한 혈액 샘플 보존을 보장하려면 샘플링 후 24시간 이내에 절차를 시작하십시오.
- 300μL의 샘플을 4.7mL의 완전 배지(0.5% 페니실린-스트렙토마이신, 0.75% 식물성 헤마글루티닌, 이전에 비활성화된 10% FBS, 88.75% RPMI 1640)가 들어 있는 튜브에 추가합니다.
- 그런 다음 블레오마이신 설페이트를 최종 농도 5μg/mL에 추가합니다.
주의: 블레오마이신 설페이트는 돌연변이 유발 물질입니다. 피부 접촉 및 흡입을 피하십시오. 용액을 준비하고 후드 아래에 샘플을 추가하십시오. - 각 샘플에 대해 음성 대조군(돌연변이원 없음)을 설정합니다.
- 튜브를 37°C의 온도 조절기에 2시간 동안 놓습니다.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
말초 림프구의 형광 현미경 분석으로 얻은 데이터를 통해 우리는 세 가지 주요 측면을 평가할 수 있습니다: 돌연변이 유발 효과로 인해 γH2AX 및 53BP1 병소(따라서 DSB)의 수를 증가시키는 블레오마이신 치료의 효과, 두 병소가 DSB 부위에 공동 국한되는 정도, 블레오마이신 유도 DSB의 복구 동역학을 설명하기 위한 γH2AX 및 53BP1 병소의 시간 경과. 예상한 바와 같이, 처리되지 않은 세포와 처리된 세포 사이에서 γH2AX 및 53BP1 병소의 매우 높은 빈도가 관찰되었으며, 따라서 블레오마이신이 말초 림프구에서 DSB의 형성을 유도한다는 것을 확인했습니다(그림 2).
두 마커의 초점 수에서 큰 차이가 관찰되었습니다. 특히, γH2AX 병소는 53BP1 병소보다 더 많았으며, 따라서 공동 국소화가 항상 발생하는 것은 아니며 여러 요인에 의존할 수 있음을 나타냅니다(그림 3<.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
γH2AX 및 53BP1 병소의 면역형광 분석은 세포 시스템의 간기 핵에서 게놈 손상을 평가하는 데 적합한 방법입니다. 이 절차에는 실험 결과, 주로 고정 및 투과에 사용되는 제제, 항체 유형 및 희석 인자, 돌연변이 유발 물질의 농도에 영향을 미칠 수 있는 몇 가지 중요한 사항이 있습니다.
면역형광법은 주로 단백질인 항원을 식별할 것으로 예상하기 때문에 단백질 무결성의 유지는 기본입니다. 이 프로토콜에서 메탄올은 림프구를 고정하는 데 사용됩니다. 이 단계는 알코올이 물을 대체하고 가용성 단백질의 침전을 유발하여 작용하는 반면, 고정되지 않은 다른 세포 성분은 PBS13과 같은 식염수 완충 용액에서 세척하여 제거할 수 있기 때문에 특히 중요합니다.
또 다른 주요 통로는 차단 용액을 통해 수행되는 투과화이며, 이 경우 투과화와 차단을 모두 허용합니다. 블로킹은 FBS를 용액에 첨가하여 수.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
혈액 샘플을 채취 한 전혈 기증자와 모든 의료진에게 감사드립니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| AlexaFluor 568 염소 안티 마우스 IgG(&감마; 1) | Invitrogen | A21124 | 53BP1 2차 항체 |
| Bleoprim | Sanofi | bleomycin sulfate (mutagen) | |
| Penicillin-streptomycin solution, 100X | Euroclone | ECB3001D | antibiotics for culture |
| medium PBS 10X | Termofisher | 14200075 | Phosphate-buffered Saline |
| FBS | Euroclone | EC20180L | Fetal Bovine Serum 면역형광용 |
| 염소 항토끼 IgG (H+L) DyLight 488 Coniugated | Termofisher | #35552 | γ H2AX 2차 항체 |
| 마우스 anti-53BP1 단클론 항체 | Merck | MAB 3802 | 53BP1 1차 항체 |
| Labophot 2 | Nikon | 형광 현미경 | |
| P-histone H2AX (Ser139) 토끼 항체 | 세포 신호 | 2577 | γ H2AX 일차 항체 |
| Phytohemoagglutinin | Termofisher | R30852801 | 배양 배지의 구성 요소 |
| Cell Signaling | 금 퇴색 방지 시약 Prolong gold Antifade reagent for | counterstaining | |
| RPMI 1640 | Euroclone | ECB9006L | Culture medium |
| Triton-X100 | Sigma | T9284 | Nonionic detergent for DAPI Cell Signaling#8961 Antifade solution with DAPI Cell Signaling #8961 Antifade solution with DAPI 투과화 |
참고문헌
- Chatterjee, N., Walker, G. C. Mechanisms of DNA damage, repair and mutagenesis. Environmental and Molecular Mutagenesis. 58 (5), 235-263 (2017).
- Aleksandrov, R., Hristova, R., Stoynov, S., Gospodinov, A. The chromatin response to double-strand DNA breaks and their repair.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
