이 프로토콜은 암의 중요한 분자 변화를 식별하는 데 유용한 도구를 설명하고 식도 편평 세포 암종에 대한 새로운 진단 및 치료 접근법의 개발로 이어집니다.
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이 프로토콜은 암의 중요한 분자 변화를 식별하는 데 유용한 도구를 설명하고 식도 편평 세포 암종에 대한 새로운 진단 및 치료 접근법의 개발로 이어집니다.
식도암(EC)은 8번째로 공격적인 악성 종양으로 꼽히며, 조기 발견을 용이하게 하는 바이오마커가 없기 때문에 치료가 여전히 어렵습니다. EC는 선암종(adenocarcinoma, EAD)과 편평세포암(squamous cell carcinoma, ESCC)의 두 가지 주요 조직학적 형태로 나타나며, 둘 다 지리적으로 구별되는 인구 집단에 따라 발병률의 차이를 보입니다. 고처리량 기술은 암을 포함한 질병에 대한 이해를 변화시키고 있습니다. 과학계의 중요한 과제는 문헌에 흩어져 있는 데이터를 처리하는 것입니다. 이 문제를 해결하기 위해 공개적으로 사용 가능한 마이크로어레이 데이터 세트를 분석하고 암과 정상 상태 사이에서 차등적으로 조절되는 분자를 수집하기 위한 간단한 파이프라인이 제안됩니다. 파이프라인은 차등 유전자 발현 분석을 위한 표준 접근법으로 사용될 수 있으며, 암과 정상 조직 간 또는 다른 암 아형 간에 차등적으로 발현된 유전자를 식별할 수 있습니다. 파이프라인에는 데이터 전처리(샘플 간의 기술적 차이를 제거하기 위해 원시 유전자 발현 데이터의 품질 관리 및 정규화 포함), 차등 발현 분석( t-test와 같은 통계 테스트를 사용하여 두 개 이상의 샘플 그룹 간에 차등적으로 발현된 유전자 식별)을 포함한 여러 단계가 포함됩니다., ANOVA 또는 선형 모델), 기능 분석(생물정보학 도구를 사용하여 차등적으로 발현된 유전자에서 풍부한 생물학적 경로 및 기능 식별) 및 검증(독립적인 데이터 세트 또는 qPCR 또는 면역조직화학과 같은 실험 방법을 사용한 검증 포함). 이 파이프라인을 사용하면 식도암을 포함한 모든 유형의 암에 대해 차등적으로 발현된 분자(DEM) 집합을 생성할 수 있습니다. 이 개요서는 암에 대한 잠재적인 바이오마커 및 약물 표적을 식별하고 질병의 기저에 있는 분자 메커니즘에 대한 이해를 향상시키는 데 사용할 수 있습니다. 또한 이 파이프라인을 사용하여 식도암에 대한 인구별 스크리닝은 개별 인구에 대한 특정 약물 표적을 식별하는 데 도움이 되어 질병에 대한 맞춤형 치료로 이어질 것입니다.
EC가 전 세계적으로 8번째로 흔한 암이자 전 세계적으로 6번째로 큰 사망 원인이라는 것은 놀라운 일입니다. 중국, 인도, 이란은 발병률과 사망률이 놀라울 정도로 높습니다. EC에는 식도 선암종(esophageal adenocarcinoma, EAC 또는 EAD)과 식도 편평 세포 암종(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)의 두 가지 주요 유형이 있습니다1. EAC는 서구 세계에서 더 흔한 반면 ESCC는 동부 국가, 특히 중국과 이란에서 더 일반적입니다2. EC와 관련된 몇 가지 위험 요인은 담배 및 알코올 사용, 비만, 위식도 역류 질환(GERD)을 포함합니다. 또한 과일과 채소 부족, 뜨거운 음료 및 음식 섭취와 같은 식이 요인은 고위험 지역의 ESCC 위험과 관련이 있습니다. 조기 진단과 치료는 EC 3,4 환자의 예후를 개선하는 데 중요하다. 따라서 EC의 위험 요인, 징후 및 증상에 대한 인식을 높이고 고위험군에 대한 정기적인 선별 검사를 장려하는 것이 중요합니다. 또한 담배 및 알코올 사용, 건강에 해로운 식습관과 같은 수정 가능한 위험 요인을 해결하려는 노력은 EC의 발병률을 줄이는 데 도움이 될 수 있습니다. EAD는 위 근처의 식도 하부에 있는 점액 생성 분비샘의 세포에서 발생합니다. 위산과 내용물이 식도로 돌아가는 GERD와 관련이 있는 경우가 많습니다. 이와는 대조적으로, ESCC는 식도의 상부를 감싸고 있는 평평하고 얇은 세포에서 발생합니다5. 중국과 이란과 같이 담배와 알코올 사용이 널리 퍼져 있는 지역에서 더 흔합니다.
식도와 관련된 다양한 질환 중, 식도 내벽이 선 세포로 대체되는 상태인 바렛 식도(Barrett's esophagus, BE)는 EAC6의 전구체로 알려져 있습니다. BE는 GERD가 없어도 발병할 수 있지만, GERD가 있으면 BE의 발병 위험이 3배에서 5배까지 증가한다는 점에 주목할 가치가 있습니다. 또한 BE의 존재는 EAC 발병 위험을 50-100배 증가시킵니다7. 또한 뜨겁거나 매운 음식 및 액체는 ESCC와 관련이 있지만 EAC와는 관련이 없습니다. EC의 위험 요인을 이해하는 것은 예방 및 조기 발견을 위해 중요합니다. 담배 사용, 음주, 비만, 건강에 해로운 식습관과 같은 수정 가능한 위험 요인을 해결하려는 노력은 EC의 발병률을 줄이는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한, 삼킴곤란(BE)이 있는 환자와 같은 고위험군에 대한 정기 검사 및 감시는 조기 발견 및 치료를 가능하게 하여 결과를 개선할 수 있습니다.
유전체학(genomics), 전사체학(transcriptomics), 단백질체학(proteomics), 메틸체믹스(methylomics), miRNAomics(miRNAomics), 대사체학(metabolomics)을 포함한 오믹스(omics) 기반 연구가 EC에 대한 이해, 특히 ESCC 8,9,10,11,12,13에 크게 기여한 것은 분명한 사실입니다. 이러한 연구를 통해 ESCC의 발달 및 진행과 관련된 새로운 바이오마커, 잠재적인 치료 표적 및 새로운 경로를 식별할 수 있었습니다. 그러나 이러한 연구에서 생성된 데이터는 문헌 전체에 흩어져 있어 과학계가 이 정보에 액세스하고 사용하는 데 어려움을 겪고 있습니다. 따라서 특정 암에 대한 고처리량 또는 저처리량 연구에서 얻은 데이터를 컴파일하는 저장소 또는 데이터베이스를 만드는 것이 중요합니다. 이러한 패키지는 몇 가지 기본 지침을 구현하여 간소화하고 만들 수 있습니다. 이 지침에는 관련 연구 선정, 이러한 연구에서 데이터 추출 및 구성, 데이터 품질 및 일관성 보장이 포함됩니다. 또한, 새로운 연구와 데이터가 입수되는 대로 이를 반영하기 위해 개요서를 정기적으로 업데이트해야 한다. 연구원들은 단일 플랫폼을 사용하여 서로 다른 연구의 데이터를 결합하는 개요 또는 데이터베이스를 생성함으로써 특정 암에 대한 데이터를 검색하고 분석할 수 있습니다. 이는 연구 노력을 가속화하고 궁극적으로 암 환자를 위한 보다 효과적인 치료와 더 나은 결과로 이어지는 데 도움이 될 것입니다.
암 개요서의 개발에는 저처리량 및 고처리량 연구의 데이터가 모두 포함됩니다. 이 개요서는 암에 대한 잠재적인 진단 또는 치료 표적을 식별하려는 연구자에게 귀중한 자료가 될 것입니다. 이 컬렉션을 구축하는 한 가지 방법은 GEO(Gene Expression Omnibus)와 같이 공개적으로 액세스할 수 있는 저장소에서 사용할 수 있는 마이크로어레이 연구를 검토하는 것입니다. 마이크로어레이 연구는 암세포의 유전자 발현 수준에 대한 정보를 제공할 수 있으며, 이러한 데이터는 암 발병 및 진행에 중요한 역할을 할 수 있는 차등 발현 유전자(DEG)를 식별하는 데 사용할 수 있습니다.
그러나 다른 연구에서 데이터를 분석하기 위해 다른 방법을 사용했을 수 있으며, 이로 인해 다른 DEG가 식별되었을 수 있다는 점에 유의해야 합니다. 따라서 각 연구를 주의 깊게 검토하고 개요서를 위해 데이터를 통합할 때 잠재적인 편향이나 제한 사항을 고려하는 것이 중요합니다. 데이터가 공통 플랫폼에서 수집되면 연구원들은 이를 사용하여 추가 연구를 위한 잠재적인 분자 표적을 식별할 수 있습니다. 여기에는 임상 샘플에서 특정 유전자의 발현을 검사하거나 특정 유전자 또는 단백질이 암 발병 및 진행에 어떻게 관여하는지 이해하기 위한 기계론적 연구를 수행하는 것이 포함됩니다. 전반적으로 암 데이터 세트의 생성은 암 연구자에게 귀중한 자원이 될 것이며 진단 및 치료 개입을 위한 새로운 대상을 식별하는 데 도움이 될 것입니다.
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1. ESCC에서 차등 조절된 분자의 수동 선별
2. PubMed를 사용하여 관련 연구 찾기
3. 유전자 발현 옴니버스(GEO)를 활용한 유의미한 연구 발굴
참고: 유전자 발현 옴니버스(GEO)는 DNA 마이크로어레이에 데이터를 저장하기 위해 무료로 사용할 수 있는 저장소입니다. GEO에서 사용할 수 있는 방대한 데이터는 암/질병과 정상 상태 간에 차등적으로 조절되는 분자를 식별하기 위한 데이터 마이닝에 좋은 리소스입니다.
4. GEO2R을 이용한 마이크로어레이 분석
참고: 첫 번째는 부울 연산자(AND, OR, NOT)를 사용하여 관련 연구를 찾는 것입니다. 이들은 '식도 편평 세포 암종', 'ESCC' 또는 '식도 편평 세포 암종'이라는 키워드와 함께 사용됩니다. GEO2R( 재료 표 참조)은 GEO와 통합된 무료로 사용할 수 있는 R 언어 패키지로, 사용자가 사용자 친화적인 방식으로 마이크로어레이 연구의 데이터를 분석할 수 있도록 합니다. GEO 항목 ID와 상호 작용하고 백엔드용 Bioconductor R 패키지를 사용하여 DEG를 식별하기 위해 복잡한 R 기반 분석을 수행하기 위한 인터페이스를 제공합니다. 이 패키지는 GEO 데이터를 변환할 뿐만 아니라 출력을 .txt 테이블 형태로 표시하며, 이는 사용자의 필요에 따라 추가로 수정될 수 있습니다16. GEO2R 패키지는 p-값을 기준으로 통계적으로 유의한 순서로 유전자를 표시하지만, 순서는 log2-fold 변화를 기준으로 정렬할 수 있습니다. 또한 사용자는 유전자 발현 프로파일을 GEO 프로파일 이미지로 볼 수 있습니다. 다른 분석 도구와 달리 GEO2R은 선택한 데이터 세트 기록과 독립적이며 조사자가 제출한 실제 데이터를 직접 조사할 수 있습니다. GEO 연구의 90% 이상이 이 방법을 사용하여 분석될 수 있다17. GEO2R을 사용하여 마이크로어레이 데이터 분석과 관련된 단계가 있는 GEO2R의 워크플로우는 그림 1에 나와 있습니다.
5. 유전자/단백질의 별칭 찾기
6. DEGs에 대한 공식 유전자 기호 찾기
7. DEG의 유전자 자리 찾기
8. DEG의 OMIM Pagegene 유전자 자리에서 DEG에 대한 정보 찾기
9. 유전자에 의해 암호화된 단백질의 단백질 국소화(localization), 영역(domain), 모티프(motif), 분비 성질(secretory nature) 파악
10. 검증을 위한 단백질에 대한 체리 피킹(Cherry Picking) 및 관심 악성 종양의 진단 또는 예후를 위한 추가 평가
참고: 고유한 분자가 식별되면 가장 큰 과제는 이를 검증하는 방법입니다. 일반적으로 마이크로어레이 연구는 mRNA 수준에서 발현을 제공하지만 질병 진단이나 예후를 위해서는 단백질 수준의 판독이 중요합니다. 이와 같이, 환자 또는 환자에서 파생된 동일한 암의 샘플 또는 세포주를 스크리닝하여 분자가 실제로 그곳에서 발현되는지, 암과 정상 예후, 좋은 예후와 나쁜 예후를 구별할 수 있는지, 또는 질병의 초기와 말기를 구별할 수 있는지 여부를 파악해야 합니다. 후보 분자를 검증하기 위해 웨스턴 블롯, 효소 결합 면역흡착 분석법, 즉 ELISA, 면역침전, 면역조직화학, 면역세포화학 또는 분석법이 유용한 기술이다 18,19,20. 동시에 이러한 모든 분석에는 샘플에 존재하는 항원을 검출하기 위한 항체가 필요합니다. 항체는 비용이 많이 드는 품목이므로 항상 다음 사항에 따라 항체를 선택하는 것이 좋습니다.
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예를 들어, GEO 등록 GSE161533는 ESCC에서 차등적으로 탐색된 유전자를 연구하는 데 사용되었습니다. 분석의 대표적인 결과는 그림 3에 나와 있습니다. GEO2R은 두 그룹의 실험 대상자 간에 크게 다른 사건을 식별하는 데 유용한 화산 플롯을 생성합니다. 화산 플롯은 y축에 -log10 변형 유의성(p-값)을 표시하고 x축에 fold changes(log2 transformed fold change 포함)를 사용하여 전체 유전자 분포를 표시하며(그림 3A), 차등적으로 발현되는 유전자를 시각화하는 데 유용합니다. 강조된 유전자는 0.05의 기본 adj. p-value cut-off에서 유의하게 다르게 발현됩니다(파란색 = 하향 조절, 빨간색 = 상향 조절).
평균 차이(MD) 그림은 로그
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암 생물학에 고처리량 OMICS 기술이 도입된 이후 데이터 생성 속도가 크게 증가했습니다. 이는 연구자, 특히 컴퓨터에 익숙하지 않은 연구자들에게 도전이 됩니다. 이를 극복하기 위해 수년에 걸쳐 생물정보학자들은 체계적인 방식으로 데이터를 제공하기 위해 데이터베이스를 개발한다는 아이디어를 내놓았습니다. 이는 연구자들, 특히 기술에 관심이 없는 연구자들로부터 긍정적인 반응을 이끌어냈습니다. 더욱이, 문헌 여기저기에 흩어져 있는 오믹스 데이터는 누구에게도 쓸모가 없습니다. 따라서 이를 적절하게 활용하기 위해서는 특별한 관심사를 가진 연구자들이 데이터에 액세스할 수 있는 공통 플랫폼이 항상 필요했습니다. ONCOMINE38, ESCC ATLAS39, 췌장암 데이터베이스(PCD)40 및 DDEC41을 포함하여...
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저자는 공개할 내용이 없습니다.
MKK는 과학기술부 과학공학연구위원회(SERB) 및 인도 뉴델리 정부 인도의학연구위원회(ICMR)로부터 각각 TARE 펠로우십(보조금 # TAR/2018/2018/001054 2020/NCD-III) 교외 보조금(보조금 # 5/13/55/2020/NCD-III)을 받았습니다.
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| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| NCBI-PUBMED | NCBI | 섹션 1을 참조합니다. 문헌 검색에 필요 | |
| 인터넷 시설과 웹 브라우저가 있는 노트북/맥북 또는 개인용 컴퓨터. | |||
| g:프로파일러 | ELIXIR 인프라 | https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost | 섹션 4.10 참조. GO:MF, GO:BP 및 GO:CC 유 |
| 전자 발현 옴니버스 | NCBI | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ | 섹션 3.1 참조. 마이크로어레이 연구 데이터베이스 |
| GEO2R | NCBI | 검색에 필요https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/ | 섹션 3.2 참조. GEO2R 도구를 사용하여 데이터를 분석하는 데 필요 |
| https://www.google.com | 1.1 참조. 문헌 검색에 필요 | ||
| HGNC | HGNC는 인간 게놈 기구(HUGO)의 위원회입니다 | https://www.genenames.org | DEGs 의 공식 유전자 기호를 알아야 하는 섹션 6.1을 참조합니다. |
| HPRD | 생물정보학 연구소, 방글루루 | http://hprd.org | 단백질 구조에 대한 정보를 위해 필요한 섹션 5.1을 참조합니다 |
| OMIM& | nbsp; 존스 홉킨스 대학교, 볼티모어 http://www.omim.org/entry | 특정 유전자의 OMIM ID를 아는 데 필요한 섹션 8.1 참조 / DEG | |
| Pangloss 프로그램 | Chris Seidel이 개발 | http://www.pangloss.com/seidel/Protocols/venn.cgi | 섹션 4.9 참조. 벤 다이어그램 생성에 필요 |
| 서던 캘리포니아 | 대학의 PANTHER Thomas 연구실http://www.pantherdb.org/geneListAnalysis.do | 섹션 4.10을 참조합니다. GO:MF, GO:BP 및 GO:CC | |
| ShinyGO | 사우스다코타 주립대학교 | http://bioinformatics.sdstate.edu/go | 섹션 4.10을 참조합니다. 염색체에 DEG 할당에 필요 |
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