Surface-Enhanced Raman Scattering Spectroscopy and Microscopy를 사용한 단일 나노입자의 전기화학 추적

요약

이 프로토콜은 표면 강화 라만 산란 분광법 및 이미징을 사용하여 단일 나노 입자의 전기화학적 이벤트를 모니터링하는 방법을 설명합니다.

초록

단일 나노 입자에 대한 전기 화학 반응을 연구하는 것은 개별 나노 입자의 이질적인 성능을 이해하는 데 중요합니다. 이 나노 스케일 이질성은 나노 입자의 앙상블 평균 특성화 중에 숨겨져 있습니다. 단일 나노 입자의 전류를 측정하기 위해 전기 화학 기술이 개발되었지만 전극 표면에서 반응을 겪는 분자의 구조와 정체성에 대한 정보는 제공하지 않습니다. 표면 강화 라만 산란(SERS) 현미경 및 분광법과 같은 광학 기술은 개별 나노 입자의 전기화학적 사건을 감지하는 동시에 전극 표면 종의 진동 모드에 대한 정보를 제공할 수 있습니다. 이 논문에서는 SERS 현미경 및 분광법을 사용하여 단일 Ag 나노 입자에서 나일 블루(NB)의 전기화학적 산화-환원을 추적하는 프로토콜을 시연합니다. 먼저, 매끄럽고 반투명한 Ag 필름 상에 Ag 나노입자를 제조하기 위한 상세한 프로토콜이 설명된다. 광축을 따라 정렬된 쌍극자 플라즈몬 모드는 단일 Ag 나노입자와 Ag 필름 사이에 형성됩니다. 나노 입자와 필름 사이에 고정 된 NB로부터의 SERS 방출은 플라즈몬 모드로 결합되고, 고각 방출은 현미경 대물렌즈에 의해 수집되어 도넛 모양의 방출 패턴을 형성한다. 이러한 도넛 모양의 SERS 방출 패턴을 통해 기판 상의 단일 나노입자를 명확하게 식별할 수 있으며, 이로부터 SERS 스펙트럼을 수집할 수 있습니다. 이 작업에서, SERS 기판을 도립 광학 현미경과 호환되는 전기 화학 전지에서 작동 전극으로 사용하는 방법이 제공됩니다. 마지막으로, 개별 Ag 나노 입자에서 NB 분자의 전기 화학적 산화 환원을 추적하는 것이 표시됩니다. 여기에 설명된 설정 및 프로토콜은 개별 나노입자에 대한 다양한 전기화학 반응을 연구하기 위해 수정될 수 있습니다.

서론

전기 화학은 생물학, 화학, 물리학 및 공학을 포함한 다양한 분야의 응용 분야와 함께 전하 이동, 전하 저장, 질량 수송 등을 연구하는 데 중요한 측정 과학입니다 1,2,3,4,5,6,7 . 일반적으로 전기화학은 분자, 결정 도메인, 나노 입자 및 표면 부위와 같은 단일 개체의 대규모 집합인 앙상블에 대한 측정을 포함합니다. 그러나 이러한 단일 개체가 앙상블 평균 응답에 어떻게 기여하는지 이해하는 것은 복잡한 전기화학 환경에서 전극 표면의 이질성 때문에 화학 및 관련 분야에서 새로운 근본적이고 기계론적인 이해를 도출하는 데 중요합니다 ^8,9. 예를 들어, 앙상블 환원은 부위 특이적 환원/산화 전위(¹⁰), 중간체 및 미량 촉매 생성물(11)의 형성, 부위 특이적 반응 역학(12, 13) 및 전하 운반체 역학(^{14, 15})을 밝혀냈다. 앙상블 평균화를 줄이는 것은 모델 시스템을 넘어 광범위한 이질성이 종종 발견되는 생물학적 전지, 전기 촉매 및 배터리와 같은 응용 시스템에 대한 이해를 향상시키는 데 특히 중요합니다 16,17,18,19,20,21,22.

지난 10여 년 동안 단일 실체 전기 화학 1,2,9,10,11,12를 연구하는 기술이 등장했습니다. 이러한 전기화학적 측정은 여러 시스템에서 작은 전기 및 이온 전류를 측정할 수 있는 기능을 제공하고 새로운 기본 화학적 및 물리적 특성을 밝혀냈습니다(23,24,25,26,27,28). 그러나, 전기화학적 측정은 전극 표면(29,30,31,32)에서 분자 또는 중간체의 정체 또는 구조에 대한 정보를 제공하지 않는다. 전극-전해질 계면의 화학 정보는 전기화학 반응을 이해하는 데 핵심적인 역할을 합니다. 계면 화학 지식은 전형적으로 전기 화학을 분광법과 결합시킴으로써 얻어진다^31,32. 라만 산란과 같은 진동 분광법은 수성 용매(³⁰)를 주로 이용하는 전기화학 시스템에서 전하 이동 및 관련 이벤트에 대한 보완적인 화학 정보를 제공하는 데 매우 적합하다. 현미경과 결합된 라만 산란 분광법은 빛의 회절 한계^33,34까지 공간 분해능을 제공합니다. 그러나, 회절은 나노입자 및 활성 표면 부위가 광학 회절 한계보다 길이가 작기 때문에 한계를 나타내며, 따라서 개별 개체⁽³⁵)에 대한 연구를 배제한다.

표면 강화 라만 산란(SERS)은 전기화학 반응 20,30,36,37,38에서 계면 화학을 연구하는 데 강력한 도구임이 입증되었습니다. SERS는 반응물 분자, 용매 분자, 첨가제 및 전극의 표면 화학의 진동 모드를 제공하는 것 외에도 국소 표면 플라즈몬 공명으로 알려진 집단 표면 전자 진동을 지원하는 물질의 표면에 국한된 신호를 제공합니다. 플라즈몬 공명의 여기는 금속 표면에서 전자기 복사의 집중으로 이어지며, 따라서 표면 흡착물에 대한 빛의 플럭스와 라만 산란을 모두 증가시킵니다. Ag 및 Au와 같은 나노 구조 귀금속은 가시 광선 플라즈몬 공명을 지원하기 때문에 일반적으로 사용되는 플라즈몬 재료이며, 이는 매우 민감하고 효율적인 전하 결합 장치로 방출을 감지하는 데 바람직합니다. SERS의 가장 큰 향상은 나노 입자^39,40의 응집체에서 비롯되지만, 개별 나노 입자에서 SERS 측정을 할 수있는 새로운 SERS 기판 인 갭 모드 SERS 기판 (그림 1)^41,42이 개발되었습니다. 갭 모드 SERS 기판에서는 금속 미러가 제작되고 분석물로 코팅됩니다. 다음으로, 나노 입자는 기판 위에 분산된다. 원형 편광 레이저 광을 조사하면 나노 입자와 기판의 결합에 의해 형성된 쌍극자 플라즈몬 공명이 여기되어 단일 나노 입자에 대한 SERS 측정이 가능합니다. SERS 방출은 광축을 따라 배향되는 쌍극자 플라즈몬 공명^43,44,45에 결합됩니다. 방사 전기 쌍극자 및 수집 광학 장치의 병렬 정렬로 고각 방출 만 수집되어 뚜렷한 도넛 모양의 방출 패턴^(46,47,48,49)을 형성하고 단일 나노 입자를 식별 할 수 있습니다. 기판 상의 나노입자의 응집체는 광축⁽⁵⁰)에 평행하지 않은 방사 쌍극자를 함유한다. 이 후자의 경우, 저각 및 고각 방출이 수집되어 고체 방출 패턴(⁴⁶)을 형성한다.

여기에서는 갭 모드 SERS 기판을 제조하기 위한 프로토콜과 SERS를 사용하여 단일 Ag 나노입자에서 전기화학적 산화환원 이벤트를 모니터링하기 위한 작동 전극으로 사용하는 절차를 설명합니다. 중요한 것은 갭 모드 SERS 기판을 사용하는 프로토콜이 SERS 이미징을 통해 단일 나노 입자를 명확하게 식별 할 수 있다는 것인데, 이는 단일 나노 입자 전기 화학의 현재 방법론에 대한 핵심 과제입니다. 모델 시스템으로서, 우리는 주사 또는 계단식 전위 (즉, 순환 전압 전류법, 크로노 암페로 메 측정법)에 의해 구동되는 단일 Ag 나노 입자에서 나일 블루 A (NB)의 전기 화학적 환원 및 산화에 대한 판독 값을 제공하기 위해 SERS를 사용하는 것을 보여줍니다. NB는 다중 양성자, 다중 전자 환원/산화 반응을 거치며, 여기서 그의 전자 구조는 여기 소스와 공명하여 변조되며, 이는 상응하는 SERS 스펙트럼(10,51,52)에서 대비를 제공한다. 여기에 설명된 프로토콜은 비공명 산화환원 활성 분자 및 전기화학 기술에도 적용할 수 있으며, 이는 전기 촉매와 같은 응용 분야와 관련될 수 있습니다.

프로토콜

1. 갭 모드 SERS 기판 준비

1. 아래 설명된 대로 아세톤과 물 세척제를 사용하여 1번 커버슬립( 재료 표 참조)을 청소합니다. 클린룸에서 이 단계를 수행하여 커버슬립에 파편이나 기타 원치 않는 물질이 쌓이지 않도록 합니다.
   1. 커버슬립을 슬라이드 랙에 놓습니다. 커버슬립/기판을 이동할 때는 핀셋을 사용하십시오. 슬라이드 랙을 유리 용기에 넣고 아세톤으로 채웁니다.
      주의 : 아세톤은 가연성이 높으며 건강에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 환기가 잘 되는 곳에서 장갑, 고글, 마스크를 착용하고 다루십시오.
   2. 초음파 발생기의 전력 제어를 8로 조정하고 슬라이드 랙으로 유리 용기를 15 분 동안 초음파 처리합니다.
   3. 용기에서 슬라이드 랙을 꺼내고 슬라이드 랙과 커버슬립을 초순수(저항 18.2MΩ·cm) 물로 완전히 헹굽니다.
   4. 커버슬립이 있는 슬라이드 랙을 유리 용기에 넣고 초순수로 채웁니다. 동일한 설정을 사용하여 슬라이드 랙으로 유리 용기를 15 분 더 초음파 처리합니다.
   5. 용기에서 슬라이드 랙을 제거하고 슬라이드 랙과 커버슬립을 초순수로 철저히 씻으십시오.
   6. 스프레이 건을 사용하여 고순도 N₂ 가스 흐름으로 커버슬립을 건조시킵니다.
2. 청소된 커버슬립에 Cu와 Ag를 묻습니다. 이렇게 하려면 공식 사용 설명서에서 제조업체가 권장하는 표준 절차에 따라 전자빔 박막 증착 시스템을 사용하십시오.
   알림: 다른 증착의 경우 기관 시설⁵³에 제공된 대로 제조업체가 제공한 지침을 따르십시오.
   1. 플래튼 위치를 180°로 설정하고 진공 챔버를 환기시킵니다.
   2. 깨끗한 커버슬립이 겹치지 않도록 기기의 플래튼에 나란히 배열합니다. 내열 접착 테이프(폴리이미드 필름)를 사용하여 커버슬립을 플래튼에 부착합니다.
      알림: 이렇게 하면 절차 중에 커버슬립이 움직이거나 떨어지지 않습니다.
   3. 흑연 도가니를 Cu 펠릿으로 반쯤 채우고 도가니 홀더에 삽입합니다. 두 번째 도가니에서 Ag에 대해서도 동일한 작업을 수행합니다. 진공 챔버를 닫고 펌핑을 시작합니다. 권장 증착 압력은 10-7 – ^10-6 Torr 정도입니다.
   4. Cu 특성을 센서의 응용 분야에 로드합니다. 20RPM에서 플래튼 회전을 켭니다. 플래튼 위치를 225°로 설정합니다.
      알림: 이것은 전자빔이 뷰 포트에서 볼 수 있는 방식으로 플래튼의 바닥에 거울을 배치합니다.
   5. 전자빔 전원 차단기를 켜고 2분 이상 기다립니다. 전자빔을 켜고 2분 더 기다립니다. 기판 셔터를 엽니다.
      알림: 이렇게 하면 빔과 도가니가 거울을 통해 보입니다.
   6. 센서가 10Å/s에 가까운 증착 속도를 읽을 때까지 점진적으로(약 10mA/min에서) 방출 전류를 증가시킵니다. 셔터를 닫고 플래튼 위치를 0°로 설정합니다.
      알림: 이 과정에서 빔의 모양이 바뀔 수 있습니다. 이 단계에서 정기적으로 확인하고 해당 노브를 사용하여 위치, amplitude 및 주파수. 빔은 도가니의 내용물을 고르게 가열해야 합니다. 이 시점에서 셔터를 닫으면 플래튼이 회전하여 증발된 금속의 경로에 커버슬립을 배치할 때 샘플에 금속이 증착되지 않습니다.
   7. 셔터를 열어 증착을 시작하고 센서에 표시된 두께를 모니터링합니다. 증착 센서에 의해 결정된 대로 원하는 두께(Cu의 경우 1nm)에 도달하면 셔터를 닫습니다.
   8. 센서가 0A에 가까워지지만 전류가 도가니를 볼 수 있을 만큼 충분히 높을 때까지 전자빔의 전류를 점차적으로 감소시킵니다.
   9. 플래튼의 위치를 225°로 설정하고 셔터를 열어 도가니를 볼 수 있도록 합니다.
   10. 손잡이를 사용하여 도가니 홀더를 돌려 빔이 Ag 펠릿으로 도가니를 향하도록 합니다.
   11. Ag 속성을 센서의 응용 프로그램에 로드합니다. 1.2.6 – 1.2.7 단계를 반복하되 Ag에 대해 20Å/s의 증착 속도와 25nm의 두께를 사용합니다.
   12. 전류를 0A로 서서히 낮추고 전자빔과 차단기를 끕니다. 플래튼의 위치를 180°로 설정하고 진공 챔버를 환기시킵니다. 진공 챔버를 엽니다.
   13. 커버슬립은 이전과 같은 위치에 있어야 하며 이물질이나 먼지 입자가 없고 거울처럼 보여야 합니다. 내열 접착 테이프를 천천히 조심스럽게 제거합니다.
       알림: 플래튼 표면과 평행하게 테이프를 뒤로 당깁니다. 커버슬립이 파손될 위험이 있습니다. 필름은 균질하고 부분적으로 투명해야 합니다( 그림 2A 참조).
3. Ag 박막을 아래에 설명된 대로 Nile Blue 용액으로 배양합니다.
   1. Ag 박막 표면에 50μL의 50μM NB 용액을 추가합니다.
   2. 15분 후 Ag 박막을 초순수로 완전히 헹구어 약하게 흡착된 NB 분자를 제거합니다. Ag 박막을_N2 가스로 건조시킨다.
   3. NB 배양 된 Ag 박막 상에 Ag 나노 입자를 드롭 캐스트합니다. Ag 나노 입자 콜로이드의 100x 희석액 500 μL를 NB 용액을 드롭 캐스팅하고 배양 한 Ag 박막의 동일한 영역에 첨가합니다.
      주의 : 금속 나노 입자는 인체에 독성이 있습니다. 통풍이 잘되는 곳에서 장갑과 고글을 사용하여 다루십시오.
   4. 20분 후 초순수(갭 모드 SERS) 기판을 헹굽니다. 기판을_N2 가스로 건조시킨다.

2. 갭 모드 SERS 기판 특성화

1. 자외선-가시광선 분광법
   1. 전원 버튼을 눌러 악기를 켭니다. 바탕 화면에서 바로 가기를 두 번 클릭하여 스캔 소프트웨어를 실행합니다.
   2. 설정을 클릭하여 설정 창을 엽니다. Y 모드에서 모드 드롭다운 메뉴를 클릭하고 %T를 선택하여 투과율을 측정합니다. X 모드에서 Start(시작)를 800으로, Stop(중지)을 200으로 변경하여 800nm에서 200nm로 스캔합니다.
   3. 베이스라인(Baseline) 탭에서 베이스라인 수정(Baseline correction) 라디오 버튼을 선택하고 설정 창을 닫습니다. 베이스라인(Baseline)을 클릭하여 대기로 배경 보정을 수행합니다.
   4. 시료 구획을 엽니다. Ag 필름의 한쪽 끝을 빔 경로에 수직으로 샘플 홀더에 테이프로 붙입니다.
   5. Start( 시작 )를 클릭하여 샘플에서 투과율 스펙트럼을 얻습니다.
2. 원자력 현미경(AFM) 측정
   1. AFM을 컴퓨터에 연결하고(USB 포트 사용) AFM 기기의 전원을 켠 다음 Nanosurf Easyscan 2를 실행합니다.
   2. s에서 AFM 헤드(밑면에 AFM 캔틸레버가 있음)를 부드럽게 제거합니다.ample stage, 그리고 거꾸로 놓아둡니다.
   3. 테이프를 사용하여 Ag 박막 기판을 샘플 스테이지에 고정합니다. 샘플 단계 위에 AFM 헤드를 놓습니다. AFM 헤드가 s와 평행한지 확인하십시오.ample stage(레벨 표시기가 있는 모니터). AFM 헤드와 샘플이 수평이 아닌 경우tage, 수평 조절 나사를 사용하여 s를 조정합니다.tage 수평 조절 기포를 레벨 표시기 내부의 중앙에 배치합니다.
   4. 측면 및 상단 사용 view 소프트웨어에서 s를 부드럽게 움직입니다.ample stag접촉 없이 AFM 헤드(AFM 캔틸레버)에 최대한 가까이 stag이. 샘플 stage가 AFM 헤드의 AFM 캔틸레버에 닿지 않도록 합니다.
   5. Acquisition 탭에서 Phase Contrast를 이미징 모드로 선택하고 PPP-XYNCHR을 캔틸레버 유형으로 선택합니다. Laser Align(레이저 정렬)을 클릭하여 레이저가 캔틸레버 팁에 초점을 맞추고 팁에서 반사된 빔이 포토다이오드 검출기의 중앙에 부딪히도록 합니다.
   6. 주파수 스윕 버튼을 클릭하여 AFM 소프트웨어로 캔틸레버의 공진 진동 주파수를 측정하고 주파수 곡선이 종 모양인지 확인합니다. 접근을 클릭하여 Ag 박막 표면에 캔틸레버 팁을 착지합니다.
   7. 이미징 마법사에서 이미징 크기를 10.8 μm x 10.8 μm로 선택하고 스캔 속도를 0.5 s/line으로 선택합니다. Z-컨트롤러에서 50%의 설정값, 2,500의 P-게인, 2,500의 I-게인을 사용합니다. 모드 속성에서 300mV의 자유 진동 진폭을 사용합니다.
   8. 시작을 클릭하여 이미지를 획득합니다. 이미지를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 저장하고 복사를 선택한 다음 이미지 프로세서에 붙여넣습니다.
   9. AFM 소프트웨어에서 처리할 이미지를 클릭하여 선택합니다. 분석( Analysis ) 탭에서 각각 선 거칠기 계산(Calculate Line Roughness ) 및 면적 계산(Calculate Area)을 클릭하여 영역 및 선 거칠기 분석을 수행합니다.
   10. Withdraw(철회)를 클릭하여 Ag 박막 표면에서 캔틸레버 팁을 빼냅니다. 샘플 스테이지를 팁에서 멀리 이동시켜 측면 및 상단 뷰를 사용하여 움직임을 모니터링합니다. 샘플을 제거합니다.
3. 주사전자현미경(SEM) 측정⁵⁴
   1. 30 μL의 As-received-received Ag 나노 입자 콜로이드를 Si 웨이퍼에 떨어 뜨리고 완전히 자연 건조시킨다. 양면 전도성 테이프를 사용하여 샘플 스텁에 Si 웨이퍼를 고정합니다.
   2. 기기의 사용자 인터페이스를 사용하여 SEM 챔버를 환기시킵니다. SEM 챔버를 밀어서 열고 stub을 s의 구멍 중 하나에 장착합니다.tag이자형.
   3. SEM 챔버를 닫고 기기의 사용자 인터페이스를 사용하여 SEM 챔버를 펌핑합니다.
   4. 전자빔 건에서 약 10mm 떨어진 곳에 샘플을 배치합니다. 기기의 사용자 인터페이스를 사용하여 전자빔을 켭니다.
   5. 스폿 크기가 6이고, 빔 전류가 25pA이며, 고전압이 5kV인 Everhart-Thornley 검출기를 사용하여 샘플을 이미징합니다.
   6. 전자총의 관심 영역을 두 번 클릭하면 전자빔이 자동으로 정렬됩니다. 기기의 사용자 인터페이스를 사용하여 3,500x 배율로 이미징을 수행합니다(그림 3A).
   7. 이미징이 완료되면 전자빔을 끄고 샘플을 전자빔 총에서 최소 20mm 떨어진 곳으로 이동합니다.
   8. SEM 챔버를 환기시킵니다. SEM 챔버를 밀어 열고 s를 제거합니다.amps에서 스텁 stag이자형. SEM 챔버를 닫고 기기의 사용자 인터페이스를 사용하여 펌프를 내립니다.

3. 전기화학 전지의 제조

1. 아래 설명과 같이 유리관 절단기로 유리관을 절단하여 5cm 길이의 유리 우물을 얻습니다.
   1. 유리관 절단기의 체인을 튜브 주위에 감습니다. 체인의 마지막 부분을 공구의 다른 쪽에 부착합니다.
   2. 한 손으로 공구의 손잡이를 잡습니다. 다른 손으로 유리관을 잡습니다. 체인의 바퀴가 유리를 자르기 시작하도록 유리관을 계속 돌립니다.
   3. 핸들에 점차적으로 더 많은 힘을 가하여 도구를 부드럽게 쥐십시오. 소리가 미끄러짐에서 긁힘으로 바뀌면 유리 조각(우물)이 유리관에서 분리되려고 할 때입니다.
   4. 유리의 깨진 끝을 120방 (또는 더 거친) 사포로 매끄럽게 만듭니다. 220방 (또는 더 미세한) 사포로 광택하십시오.
2. 아래 설명된 대로 다이아몬드 스크라이브로 갭 모드 기판을 자릅니다.
   1. 갭 모드 기판을 평평한 표면에 놓습니다. 기판 표면에 가벼운 압력을 가하면서 갭 모드 기판의 중간에서 다이아몬드 스크라이브를 위아래로 움직입니다.
   2. 스크래치가 보이면 수동으로 기판을 두 조각으로 나눕니다.
3. 아래 설명된 대로 절단된 유리 웰(3.1단계에서)을 기판 표면에 부착합니다.
   1. 작은 알루미늄 호일 시트에 두 부분으로 된 에폭시 수지를 분배합니다. 교반 스틱 또는 피펫 팁을 사용하여 제품을 혼합하십시오.
   2. 유리 웰의 하단 테두리에 혼합물을 바릅니다. 셀의 내부로 수지가 퍼지는 것을 최소화하기 위해 절단 된 유리의 테두리를 잘 덮기 위해 가능한 최소한의 혼합물을 도포하십시오.
   3. 유리를 갭 모드 기판의 표면에 잘 붙입니다. 나머지 혼합 제품을 기판과 만나는 웰 외부에 도포하여 유리 웰 내부에 부은 용액의 누출 가능성을 제거합니다( 그림 4A 참조).
   4. 에폭시 경화를 방해하지 않고 5분 동안 그대로 두십시오.
4. 아래 설명된 대로 갭 모드 SERS 기판에 전기 연결을 연결합니다.
   1. 5cm 길이의 구리선을 구합니다. 작은 알루미늄 호일 시트에 2액형 전도성 에폭시 수지를 분배합니다. 구리선을 사용하여 제품 구성 요소를 혼합하십시오.
   2. 기판 표면에 와이어를 부착합니다(웰 외부에 있지만 전도성 Ag 박막에 부착됨, 그림 4A 참조). 전도성 에폭시가 권장 시간 동안 방해받지 않도록 하십시오.
      참고: Ag 필름 기판의 열 어닐링을 최소화하기 위해 전도성 에폭시를 실온에서 경화시키는 것이 좋습니다.

4. 벌크 순환 전압전류법 측정

1. 10mL의 0.5mM NB와 0.1M 인산염 완충액(pH = 5)을 20mL 비커에 추가합니다. 기계적으로 연마된 Ag 디스크 전극, Pt 와이어 및 Ag/AgCl(3M KCl) 전극을 전해질 용액에 삽입합니다.
2. 각 전극을 해당 전위차 클립에 부착합니다(전위차 조절기 제조업체에서 결정). 전극이 서로 접촉하지 않도록 하십시오.
3. 50 mV/s의 스캔 속도로 0 - −0.6 V의 순환 전압전류법(CV)을 수행합니다.

5. 단일 나노 입자 전기 화학 SERS 현미경 및 분광학 측정

1. 갭 모드 SERS 기판을 이용하여 제조된 전기화학 전지를 도립 광학 현미경의 스테이지 위에 올려놓는다.
2. 기판의 가장자리를 현미경 스테이지에 테이프로 붙여서 전지를 전위차에 연결하는 와이어의 장력으로 인해 분광전기화학적 측정 중에 움직이지 않도록 합니다( 그림 4B 참조).
3. Ag/AgCl(3M KCl) 기준 전극을 집에서 만든 스탠드에 놓고 전극 홀더 스탠드의 나사를 조여 위치를 고정합니다.
4. 기준 전극을 전위차 조절기의 기준 전극 악어 클립(흰색)에 끼웁니다. Pt 와이어 카운터 전극을 전위차 조절기의 카운터 전극 악어 클립(빨간색)에 끼웁니다. Ag 필름에 부착된 Cu 와이어를 전위차 조절기의 작동 전극 악어 클립(녹색)에 끼웁니다.
5. 악어 클립과 함께 Pt 와이어를 전극 홀더에 삽입하고 나사를 조여 위치를 고정합니다.
6. 전극 홀더를 전기화학 전지 위에 놓아 전지에 전극을 삽입합니다. 전극이 Ag 필름에 닿지 않도록 주의하십시오. 이것은 단락을 형성할 뿐만 아니라 필름을 손상시킬 수도 있습니다.
7. 분광계와 EMCCD 카메라를 켜고 "LightField" 소프트웨어를 실행합니다.
8. 642nm 레이저를 켜고 레이저를 500μW의 출력으로 조정합니다.
   주의 : 레이저 광선에 노출되면 눈과 피부에 영구적인 손상을 줄 수 있습니다. 해당 국가/지역의 관련 공식 규제 기관의 안전 지침을 참조하고 따르십시오.
9. 대물렌즈에 침지 오일 한 방울을 추가합니다. 포커스 노브를 움직여 오일이 기판 바닥에 닿을 때까지 대물렌즈를 조심스럽게 올립니다.
   알림: 셀이 테이프로 고정되어 있기 때문에 대물렌즈를 기판에 강제로 올리면 셀이 파손되거나 대물렌즈가 손상될 수 있습니다.
10. 갭 모드 SERS 기판의 표면에 레이저를 집중시킵니다. 갭 모드 SERS 기판(유리 웰로 덮음)을 스캔하여 현미경 스테이지를 이동하여 분리된 도넛 모양의 NB SERS 방출 패턴을 검색합니다( 그림 5A 참조).
    알림: NB의 농도가 낮을수록 도넛 모양의 방출 패턴을 찾기가 더 어려워지지만 최종 도넛 모양의 방출 패턴이 분리될 가능성이 높아집니다. 커피 링은 시작하기에 좋은 곳이며, 갭 모드 SERS 기판의 NB 및 Ag 나노 입자 배양 영역에 대해 안쪽으로 이동할 수 있습니다. 카메라(다음 단계 참조)는 갭 모드 SERS 기판 주변을 스캔할 때 사람의 눈보다 빛에 더 민감하기 때문에 이 프로세스에 유용합니다.
11. 현미경 전화 어댑터에 전화기를 연결합니다. 휴대폰의 카메라를 어댑터의 렌즈에 맞추려면 휴대폰의 카메라 응용프로그램을 켜고 렌즈를 통해 볼 수 있도록 장치의 위치를 변경합니다.
12. 현미경의 접안렌즈 중 하나를 제거하고 그 자리에 어댑터를 삽입합니다. 카메라 응용 프로그램에서 모드를 비디오로 변경하고 가능한 한 많이 확대합니다. 도넛 모양의 방출 패턴을 명확하게 볼 수 있습니다.
13. 도넛 모양의 방출 패턴이 명확하게 발견되면 현미경의 광 전환 레버를 움직여 방출된 빛을 분광계로 향하게 합니다.
14. LightField의 실험(Experiment) 탭에서 공통 획득 설정(Common Acquisition Settings) 을 클릭하고 노출 시간(Exposure Time) 을 0.1초로, 저장할 프레임(Frames to Save) 을 50으로 조정합니다. 데이터 내보내기에서 수집된 데이터 내보내기를 선택하고 파일 형식을 CSV(.csv)로 변경합니다.
15. Regions of Interest( 관심 영역)에서 Custom Regions of Interest(사용자 지정 관심 영역 ) 라디오 버튼을 선택합니다. ROI 편집을 클릭하고 새 창에서 X, Y, W, H 값을 변경하여 도넛 모양의 방출 주위에 25픽셀 x 25픽셀 ROI를 생성합니다.
16. 분광계에서 600g/mm, 750nm 블레이즈 격자를 선택합니다. 중심 파장을 642nm로 변경합니다. Acquire(획득)를 클릭하여 측정을 시작합니다.
17. 수집이 완료되면 데이터 탭으로 이동합니다. 마지막으로 수행한 실험을 열고 프로세스를 클릭한 다음 프레임 조합을 클릭합니다.
18. 결합된 스펙트럼에서 가장 높은 강도가 관찰되는 레이저 파장을 기록해 둡니다.
19. 실험으로 돌아가서 분광계에서 nm을 클릭합니다. 팝업 창에서 측정 모드를 상대 파수로 변경하고 측정된 레이저 파장을 상자에 입력합니다. 스톡스 시프트 라만 산란을 약 400/cm에서 1,600/cm로 감지하기 위해 격자 위치를 1,000/cm로 변경합니다.
20. 0.1초의 노출 시간을 사용하여 최소 50프레임의 NB SERS 스펙트럼을 수집하고 합산합니다( 그림 5C 참조). 방출이 NB에서 발생하는지 확인하기 위해 592/cm에서 강한 피크를 찾으십시오( 그림 5C 참조)⁵². 배경 신호를 보상하기 위해 도넛 모양의 방출 패턴(방출이 없는 영역)에 인접한 영역의 SERS 스펙트럼을 취합니다.
21. 레이저 광을 도넛 모양의 방출 패턴에 집중시키면서 5mL 조절식 피펫을 사용하여 0.1M 인산염 완충 용액(pH = 5) 3mL를 전기화학 셀에 추가합니다.
    참고 : 전해액이 첨가되면 도넛 모양의 방출 패턴이 사라질 수 있으며 광축에서 벗어난 단일 나노 입자의 쌍극자 모드가 전해질 및 용매 분자의 SERS 스펙트럼을 방출하기 때문에 고체 방출 패턴이 나타날 수 있습니다.
22. 필요한 경우 초점을 다시 맞추고 레이저 광이 여전히 방출 패턴에 초점을 맞추고 있는지 확인합니다.
23. 전위차 조절기의 소프트웨어에서 Ag/AgCl(3M KCl) 및 50mV/s의 스캔 속도에 대해 0에서 -0.6V까지 최소 3개의 주기로 주기적 전압암광 실험을 준비합니다. 스펙트럼 및 전기화학적 데이터 수집을 동기화하기 위해, 분광계의 스펙트럼 획득에 의해 트리거되도록 전위차기를 구성하십시오.
24. CV 및 SERS 실험을 동시에 실행합니다. NB SERS 스펙트럼은 갭 모드 SERS 기판에 적용된 전위에 의해 변조되어야 합니다( 그림 6B 참조).
25. 빛이 휴대폰 카메라로 향하도록 조명 전환 레버를 움직입니다. 비디오 녹화를 시작하고 설명된 대로 CV 실험을 실행합니다. SERS 이미지 강도는 갭 모드 SERS 기판에 적용된 전위에 따라 변조되어야 합니다( 그림 6A의 삽입 참조).

6. 이미징 분석

1. 수집된 이미지를 처리하여 아래 설명된 대로 선명도와 대비를 향상시킵니다.
   참고 : 이미지 처리는 Python의 OpenCV 라이브러리를 사용하여 수행되었으며 스크립트는 GitHub (github.com/jvhemmer/jove_specsers)에서 사용할 수 있습니다.
   1. 이미지를 잘라 대부분의 빈 공간을 제거하고 방출 패턴을 중심으로 가운데에 배치합니다.
   2. 프레임의 녹색 및 파란색 채널을 삭제합니다. 프레임의 가우시안 흐림 마스크를 빼서 선명도를 높입니다.
   3. 전원 상승 연산자로 동적 범위 확장으로 대비를 높입니다.
2. 아래 설명과 같이 ImageJ를 사용하여 이미지에 스케일 막대를 추가합니다.
   1. 휴대폰 카메라 어댑터를 사용하여 현미경 보정 슬라이드와 같이 알려진 치수로 물체를 이미지화합니다.
   2. ImageJ를 사용하여 수집된 이미지를 로드합니다. 알려진 치수로 이미지화된 개체의 영역에 세그먼트를 그립니다.
   3. 배율 설정(즉, 단위 거리당 픽셀 수)은 Set Scale 함수를 사용하여 그려진 세그먼트의 길이를 기준으로 합니다. 배율 도구를 사용하여 배율을 추가합니다.

7. 나노 입자 크기 분석

1. SEM 이미지를 ImageJ에 로드합니다. 측량기에서 제공하는 스케일 바에 세그먼트를 그리고 스케일 설정 기능을 사용하여 설정합니다.
2. 이미지 > 유형 > 16비트로 이동합니다. Image(이미지)로 이동하여 Adjust > Auto(자동 임계값> 조정합니다. 드롭다운 메뉴에서 기본값을 선택합니다.
3. 직사각형 도구를 사용하여 단일 나노 입자가 아닌 피쳐를 선택하고 삭제합니다.
4. 파티클 분석 도구를 사용합니다. 원형을 가정하여 얻은 영역을 가진 입자의 직경을 계산합니다.

8. 분광 전기 화학 데이터 분석

1. 수집된 스펙트럼 데이터에 대해 배경 보정을 수행합니다. MATLAB에서 데이터 처리 및 플로팅을 수행합니다. 스크립트는 앞에서 언급한 것과 동일한 GitHub 리포지토리에서 사용할 수 있습니다.
2. 세 가지 다른 배경 실험(SERS 방출 패턴과 함께 수집된 스펙트럼 데이터)의 스펙트럼 데이터를 평균화합니다. 샘플의 스펙트럼에서 평균 배경 스펙트럼을 뺍니다.
3. 0부터 총 실험 시간(순환 전압전류법)까지의 시간 배열을 생성하며, 여기서 간격은 노출 시간, EMCCD 판독 시간, 셔터 개폐 시간의 합입니다.
4. 레이저 파장을 사용하여 파장 측정값을 라만 시프트로 변환합니다.
5. MATLAB의 메쉬 함수를 사용하여 폭포수 플롯을 생성하며, 여기서 X는 라만 편이, Y는 시간, Z는 강도입니다.

결과

도 2A 는 전자빔 금속 증착 시스템을 이용하여 제조된 Ag 박막 기판을 나타낸다. 그림 2A 에 표시된 "양호한" 기판은 유리 커버슬립 위에 Ag 금속의 균일한 커버리지를 갖는 반면, "나쁜" 기판은 Ag의 불균일한 커버리지를 갖습니다. "좋은" Ag 박막의 자외선-가시광선 스펙트럼은 도 2B에 도시되어 있으며, 이는 전자기 스펙트럼의 가시광선 부분에 대해 필름이 부분적으로 투명하다는 것을 보여준다. "좋은" Ag 박막 기판은 현재 프로토콜에서 분광전기화학 실험에 사용되는 642nm 레이저 광에 대해 34%의 광학 투명도를 가지고 있습니다. 도 2C 는 "양호한" 기판의 10.8 μm x 10.8 μm 영역의 대표적인 AFM 이미지를 나타낸다. 대표 영역의 제곱 평균 제곱근 거칠기 값은 0.7 nm이며, 이는 Ag ...

토론

깨끗한 커버슬립에 Cu 및 Ag 박막 금속 필름을 증착하는 것은 최종 필름의 거칠기가 2-4개의 원자층(또는 약 0.7nm 이하의 평균 제곱근 거칠기)을 갖도록 하는 데 중요합니다. 금속 증착 전에 커버슬립에 존재하는 먼지, 긁힘 및 파편은 도넛 모양의 방출 패턴을 생성하는 데 필요한 매끄러운 필름의 제작을 방해하는 일반적인 문제입니다. 따라서 금속 증착 전에 다른 용매에서 커버 슬립을 초음파 처리하고 가능하면 클린 룸에서이 공정을 수행하는 것이 좋습니다. 또한, 증착 절차에 세심한 주의를 기울여야 한다. 진공 챔버 내부의 모든 표면(팬 홀더 서랍 포함)과 팬은 먼지와 파편이 쌓이는 경향이 있으므로 청소해야 할 수 있습니다.

금속 증착 공정 동안 사용되는 높은 증착 속도는 증착된 필름이 원자적으로 매끄럽게 되도록 하지만 제어하기가 더 어려울 수도 있습니다. 필름 두께 센서를 잘못 판독하면 필름이 불균일하거나 지나치게 두껍거나 얇아질 수 있습니다. 금속 필름이 너무 얇 으면 연속적...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
아세톤, 마이크로 전자 등급	J. T. Baker	9005-05
조절식 피펫, Eppendorf Reference 2 5000 mL	Eppendorf	4924000100
분석 저울, AB54-S/FACT	Metter Toledo	N.A.
원자력 현미경, 쉬운 스캔 2	Nanosurf	N.A.
AXXIS 전자빔 박막 증착 시스템	Kurt J. Lesker	N.A.
캐리 60 UV-Vis 분광 광도계	애질런트	N.A.
전도성 에폭시, 두 부분	전자 현미경 과학	12642-14
구리 펠릿, 99.99% 순수	Kurt J. Lesker	EVMCU40EXE
구리선, 베어, 18 AWG	VWR	66248-040
도가니, 흑연 E-빔	Kurt J. Lesker	EVCEB-23
다이아몬드 스크라이버	Ted Pella	54484
EMCCD 카메라, ProEM HS : 1024BX3	텔레 다인 프린스턴 악기	NA
에폭시, 클리어	고릴라 접착제	N.A.
유리관 절단기	Wheeler-Rex	69012
유리관, 붕규산염(OD 0.75", ID 0.62", L 12")	McMaster-Carr	8729K45
이멀젼 오일, F형	Olympus	IMMOIL-F30CC
도립 현미경, IX73	Olympus	NA
레이저, Excelsior One 642 nm 여유 공간	스펙트럼 물리학	N.A.
LightField	, Teledyne, 프린스턴 인스트루먼트,	N.A.
MATLAB 2022b:	매스웍스	N.A.
마이크로 커버 유리(커버슬립), 24회; 60mm No. 1	VWR	48404-455
현미경 스마트 폰 카메라 어댑터	qhma	QHMC017A-S01
나일 블루 A, 순수	Acros 유기물	415690100
질소, 초순수, 압축	특수 가스	N.A.
목표, UPLanXApo 100× 오일 이멀젼	Olympus	14-910
폴리이미드 필름, Kapton	3M	16089-4
인산칼륨 단일염기	성 VWR	P285
포텐시오스타트, 660E	CH 악기	N.A.
Pt 철사	Alfa Aesar	10956-BS
주사 전자 현미경, Apreo C SEM	열 Fischer 과학	적인 N.A.
Si 웨이퍼	Ted Pella	16006
은 나노 입자 (나노 구체), 2 mM 구연산	나노 Composix	AGCN60
실버 펠릿, 99.99 % 순수	Kurt J. Lesker	EVMAG40EXE-A
슬라이드 랙, Wash-N-Dry	Diversified Biotech	WSDR-2000
스마트 폰, iPhone 13 mini	Apple	NA
인산 나트륨 이염기성 헵타 하이드레이트	VWR	0348
분광계, IsoPlane SCT320	텔레 다인 프린스턴 악기	N.A.
티슈 와이퍼, 라이트-듀티	VWR	82003-820
핀셋, KS-04	Kaisi 하드웨어	N.A.
Utrasonic 발전기, 스윕SONIK	Blackstone-NEY 초음파 809379
정수기, Sartorius Arium 미니	Sartorius	N.A.