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방법 논문

비슷한 용량의 쥐 골수 호중구를 분리하기 위한 독특한 접근법

3.4K 조회수

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DOI:

10.3791/65506

⸱

2024년 4월 26일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiovascular Surgery, West China Hospital, Sichuan University, 2Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Sichuan Provincial Pancreatitis Centre, West China Hospital, Sichuan University, 3West China-Liverpool Biomedical Research Centre, West China Hospital, Sichuan University, 4Cardiovascular Surgery Research Laboratory, West China Hospital, Sichuan University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 연구는 쥐의 골수에서 풍부한 호중구 세포외 트랩(NET)을 분리하는 두 가지 기술을 간략하게 설명합니다. 한 가지 방법은 상용 호중구 분리 키트와 밀도 구배 원심분리를 결합하는 반면, 다른 방법은 밀도 구배 원심분리만 사용합니다. 두 접근법 모두 말초 혈액 호중구의 NET을 능가하는 기능적 NET을 산출합니다.

초록

이 연구의 주요 목표는 쥐 골수에서 호중구 세포외 트랩(NET)을 분리하기 위한 신뢰할 수 있고 효율적인 접근 방식을 개발하는 것이었습니다. 이러한 노력은 말초 혈액에서 NET을 추출하는 전통적인 방법과 관련된 제한으로 인해 발생했으며, 주로 분리에 사용할 수 있는 호중구가 부족하기 때문입니다. 이 연구는 골수에서 쥐 호중구를 얻기 위한 두 가지 뚜렷한 방법론, 즉 만족스러운 정제 수준을 산출하는 간소화된 1단계 절차와 향상된 정제 효율을 나타내는 더 많은 시간 집약적인 2단계 프로세스를 보여주었습니다. 중요한 것은, 두 기술 모두 쥐 한 마리당 5천만에서 1억 마리에 이르는 상당한 양의 생존 가능한 호중구를 산출했다는 것입니다. 이 효율성은 인간과 쥐 공급원 모두에서 호중구를 분리하여 얻은 결과를 반영했습니다. 의미심장하게도, 쥐의 골수에서 유래한 호중구는 말초 혈액에서 얻은 호중구와 비교할 때 NET을 분비하는 능력이 비슷했습니다. 그러나 골수 기반 방법은 지속적으로 호중구와 NET을 모두 현저하게 더 많이 생산했습니다. 이 접근법은 추가 다운스트림 응용 분야를 위해 이러한 세포 구성 요소를 훨씬 더 많이 얻을 수 있는 잠재력을 보여주었습니다. 특히, 이러한 분리된 NET과 호중구는 염증, 감염 및 자가면역 질환의 영역에 걸쳐 다양한 응용 분야에 대한 가능성을 가지고 있습니다.

서론

호중구는 선천성 면역 반응에서 중추적인 역할을 하는 백혈구의 중요한 하위 집합을 구성합니다. 이들은 다양한 프로테아제와 항균 펩타이드를 함유하는 다엽 핵과 과립을 특징으로 한다1. 호중구는 주로 탈과립화, 식균작용 및 NET의 형성을 통해 기능합니다. NET의 관찰은 1996년 Takei et al.이 호중구를 phorbol myristate acetate(PMA)2로 자극하는 실험에서 처음 이루어졌습니다. 그 후, NET 형성 과정은 2004년 Brinkmann et al.3에 의해 "NETosis"라는 용어로 만들어졌습니다. 그들의 연구는 호중구 매개 항균 반응에서 NET의 중요한 역할을 더욱 조명했습니다. NET은 크로마틴, 히스톤 및 항균 단백질로 구성된 거미줄 모양의 구조로, 감염성 및 염증성 자극에 반응하여 활성화된 호중구에서 방출됩니다. NET은 침입하는 병원체를 가두고 고농도의 항균 펩타이드와 프로테아제에 노출시켜 고정시키고 죽일 수 있습니다 1,3. 또한 NET은 자가사멸 세포의 청소에 기여하고 염증 해결에 관여합니다. 최근 연구에 따르면 NET의 과도한 형성 또는 NET 분해 장애는 조직 손상, 자가면역 질환, 혈전 형성 및 혈관 재형성 장애를 유발할 수 있습니다 4,5,6,7,8,9,10.

심근경색 및 심실동맥류 형성에 따른 조절되지 않는 섬유증에서 NET의 병원성 역할은 혈관 주위 섬유증의 확장을 통해 입증되었습니다 4,11. 심근 경색 모델과 생쥐의 골수에서 호중구를 분리하는 것은 모두 잘 확립되어 있습니다. 인간의 혈액에 풍부한 백혈구의 일종인 다형핵(PMN) 백혈구는 인간 호중구를 분리하는 훌륭한 공급원 역할을 합니다. 이 방법은 골수를 채취할 필요가 없어 안전성과 효율성이 향상됩니다.

NET은 심장 리모델링과 관련된 심방세동에서도 중요한 역할을 합니다. 그러나, 개나 돼지와 같은 큰 동물을 이용하여 심방세동을 모델링하였는데, 이는 마우스는 특정 이온 채널이나 신호전달 경로가 녹다운되거나 녹아웃되지 않는 한, 재진입 주기 또는 AF 모델을 확립할 수 있을 만큼 충분히 큰 심방이 없기 때문이다12. 앞서 설명한 바와 같이 쥐의 심방세동을 유도하고 쥐의 말초 혈액에서 호중구를 분리하는 것이 가능하지만, 연구자들은 말초 혈액에서 2 x 105-5 x 105 호중구만 분리할 수 있다는 한계에 부딪혔습니다(쥐당 10mL). 각 시점에서 충분한 NET을 추출하려면 약 10-25마리의 쥐(총 5 x 106 개의 호중구)가 필요했으며, 그 결과 시간이 많이 걸리고 비용이 많이 들며 종종 수율이 낮은 공정이 발생했다13. 이와 관련하여, Li He와 동료들은 쥐로부터 적절한 NET을 얻기 위한 골수 지향 전략을 제시한다14. 이 논문에서 그들은 쥐 골수에서 호중구를 분리하는 방법에 대한 포괄적인 설명을 제공하고 쥐 말초 호중구와 골수 호중구의 NET 분비 능력을 비교합니다. 개괄된 두 가지 방법은 서로 다른 실험 목표를 충족하며, 둘 다 필요한 쥐의 수를 줄이면서 충분한 양의 쥐 골수 호중구를 생성합니다. 2단계 분리 방법은 우수한 호중구 정제를 입증한 반면, 1단계 분석법은 허용 가능한 정제 수준으로 시간 효율적인 것으로 입증되었습니다. 또한, 연구진은 쥐의 골수 호중구와 말초 호중구 사이의 NETosis 및 NET 형성을 비교하여 PMN과 동일한 효능을 발견했습니다. 이러한 발견은 심방세동의 호중구 관련 연구에 크게 기여하고 호중구 분포가 다른 다양한 실험 동물에서 호중구 분리를 위한 다양한 소스를 유연하게 선택하는 것의 중요성을 강조합니다.

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프로토콜

이 연구는 쓰촨 대학 화서부 병원 동물 윤리 위원회의 동물 관리 및 사용에 대한 지침에 따라 쓰촨 대학교 중국 서부 병원 동물 윤리 위원회가 부여한 프로젝트 라이선스(No. 20211404A)에 따라 수행되었습니다. 윤리 지침에 따라 이 연구에 사용된 쥐는 12시간 명암 주기, 온도 22-24°C 및 습도 50%-60%의 통제된 환경에서 유지되었습니다. 쥐들은 음식과 물을 자유롭게 이용할 수 있게 되었다. 이 연구에 사용된 동물은 6-8주 된 Sprague Dawley(SD) 수컷 쥐였으며 무게는 약 250g이고 특정 병원체가 없었습니다. 동물은 상업적 출처에서 얻었다( 자료표 참조).

1. 쥐 호중구의 분리

  1. 골수 채취
    1. 마취를 위해 쥐를 적절한 용기에 넣으십시오( 재료 표 참조). 동물이 의식을 잃을 때까지 쥐에게 3% 이소플루란을 투여합니다. 마취 깊이를 확인하기 위해 발가락 꼬집기 또는 꼬리 꼬집음에 반응이 없는지 확인하십시오.
    2. 쥐가 깊이 마취되면 쥐를 등에 눕히고 한 손으로 꼬리를 잡고 다른 손으로 머리를 잡고 경추 탈구를 수행합니다. 경추가 절단될 때까지 머리를 아래로 당기면서 꼬리에 갑작스럽고 강한 위쪽 힘을 가하여 목을 빠르고 단단히 탈구시킵니다. 호흡 정지 및 심장 박동 부족과 같은 사망 확인이 확인될 때까지 기다렸다가 조직 채취 또는 폐기를 진행합니다.
    3. 쥐를 75% 에탄올에 담그고 몇 분 동안 그대로 두어 털과 피부를 살균합니다. 쥐를 눕히고 엉덩이에서 하지를 절단하여 대퇴골 머리를 보호합니다. 해부 가위를 사용하여 족관절의 인대를 절단하고 무릎 관절을 뒤로 접어 대퇴골과 경골을 노출시킵니다.
    4. 집게와 가위를 사용하여 뼈에 연결된 근육, 힘줄 및 기타 조직을 조심스럽게 제거합니다. Hank's Balanced Salt Solution(HBSS)으로 뼈를 헹구어 남아 있는 조직 파편과 혈액을 제거합니다. 두 번 더 반복하여 총 세 번 세탁합니다. 깨끗이 씻은 뼈를 멸균 용기에 넣습니다.
    5. 바늘이 달린 5mL 또는 10mL 주사기를 사용하여 뼈의 양쪽 끝을 통해 골수를 찔러 골수 기질을 풉니다. 눈에 보이는 골수를 씻어낼 수 없을 때까지 다른 주사기로 10-15mL Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 배지로 골수를 헹굽니다.
    6. 골수 세포를 300 x g 에서 20°C에서 10분 동안 원심분리합니다. 5-10mL 적혈구 용해 완충액( 재료 표 참조)을 추가하여 세포를 재현탁시키고 실온에서 3분 동안 배양합니다. 혼합물에 HBSS 부피의 4배를 추가합니다. 실온에서 600 x g 에서 5분 동안 세포를 원심분리하고 피펫으로 상층액을 버리고 생성된 펠릿을 추가 사용을 위해 사용합니다.
  2. 골수에서 호중구 분리
    1. 2단계 방법의 경우 다음 추가 단계를 수행합니다.
      1. 제조업체의 지침에 따라 상용화된 쥐 호중구 분리 키트를 사용하여 골수 세포를 분리합니다( 재료 표 참조).
      2. 새로운 15mL 원심분리 튜브에 55% 퍼콜 시약 2mL( 재료 표 참조), 65% 시약 2mL, 70% 시약 2mL, 80% 시약 2mL를 적층하여 밀도 구배를 준비합니다. 20°C에서 40분 동안 800 x g 에서 튜브를 원심분리하고 가속을 5로 설정하고 감속을 0 또는 1로 설정합니다.
      3. 멸균 피펫을 사용하여 65%와 70% 그래디언트 시약 사이의 경계에 있는 세포층을 포함하여 70% 그래디언트 층을 수집합니다. 세포 현탁액을 새 15mL 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 튜브에 HBSS 15mL를 넣고 튜브를 여러 번 부드럽게 뒤집어 세포를 세척합니다. 실온에서 10분 동안 튜브를 300 x g 으로 원심분리하여 세포를 펠트합니다.
    2. 1단계 방법의 경우 다음 추가 단계를 수행합니다.
      1. 쥐 호중구 분리 키트를 사용하지 않고 골수 세포를 그래디언트에 적용하십시오.
      2. 멸균 피펫을 사용하여 65%와 70% 그래디언트 사이의 경계에 있는 세포층을 포함하여 70% 그래디언트 층을 수집합니다. 세포 현탁액을 새로운 50mL 원심분리 튜브로 옮기고 HBSS로 세포를 세척합니다. 실온에서 400 x g 에서 5분 동안 튜브를 원심분리하여 세포를 펠트합니다.
      3. 혈구계를 사용하여 분리된 호중구를 계수하고 트리판 블루 염색을 사용하여 생존율을 평가합니다.
        참고: 프로토콜은 쥐의 수와 원하는 분리된 호중구 수에 따라 수정할 수 있습니다. 이 방법을 새로운 실험 환경에서 처음 사용할 때 세 마리의 쥐로부터 허용 가능한 양의 뼈를 얻습니다. 모든 절차는 멸균 상태에서 수행해야 합니다. 골수에서 호중구를 분리하는 것은 세포 손상과 생존력 손실을 최소화하기 위해 가능한 한 빨리 수행되어야 합니다.

2. 쥐그물 획득

  1. 0.5 x 108-1 x 108 분리된 호중구를 4mL RPMI 배지(10% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 보충)에 재현탁하여 멸균된 10cm 페트리 접시에 담습니다.
  2. NETosis를 유도하기 위해 호중구 현탁액에 500nM PMA( 재료 표 참조)를 추가합니다. 37 °C 및 5 % CO2에서 3 시간 동안 배양합니다.
  3. 음성 대조군의 경우 DNase I(10U/mL)을 호중구 현탁액에 첨가하여 분비된 NET을 분해합니다.
  4. 그물을 수확하려면 배지를 제거하고 페트리 접시에 부착된 그물을 HBSS로 부드럽게 씻으십시오. 그런 다음 각 플레이트에 대해 4mL의 새 배지로 강하게 세척하여 플레이트에서 그물을 분리합니다.
  5. NET의 완전한 재현탁을 위해 세척 매체와 피펫을 자주 수집하십시오.
  6. 현탁액을 300× g 에서 20°C에서 10분 동안 원심분리하여 부유 셀을 제거합니다.
  7. NET이 포함된 현탁액을 멸균 튜브로 옮기고 2주 이내에 추가로 사용할 수 있도록 -20°C에서 보관합니다.
    알림: NET은 열화에 민감하므로 최상의 결과를 얻으려면 갓 수확한 재료를 사용하는 것이 좋습니다.

3. NET의 존재 여부 확인

  1. 4% 파라포름알데히드가 있는 커버슬립에 세포(2.4단계에서)를 15분 동안 고정하고 NET(2.7단계에서)을 30분에서 1시간 동안 고정합니다.
  2. 파라핀 필름으로 덮인 시험관 스탠드의 PBS/PBST 물방울에 커버슬립을 뒤집고 각각 5분씩 세척 과정을 세 번 반복합니다.
  3. 실온에서 10분 동안 0.5% Triton-X-100으로 세포를 투과시키고 PBS/PBST에서 각각 1분씩 3회 세척합니다. 10% 일반 당나귀 혈청( 재료 표 참조)으로 실온에서 1시간 동안 세포를 밀봉합니다.
  4. 항-쥐 호중구 엘라스타제 항체 및 항-쥐 골수과산화효소 항체( 재료 표 참조)로 세포를 4°C에서 밤새 배양합니다. 그런 다음 PBS/PBST에서 커버슬립을 각각 5분 동안 세 번 세탁합니다.
  5. 2차 항체 A488-conjugated donkey anti-rabbit IgG(H + L), A594-conjugated donkey anti-mouse IgG(H + L) 및 A594-conjugated goat anti-Mouse IgG1( 재료 표 참조)을 어두운 곳에서 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 PBS/PBST에서 커버슬립을 각각 5분 동안 세 번 세탁합니다.
  6. 10mg/mL DAPI의 염색 세포 핵 및 NET 골격. 그런 다음 PBS/PBST에서 커버슬립을 각각 5분 동안 세 번 세탁합니다.
  7. 유리 슬라이드에 장착 매체 한 방울을 놓고 셀이 있는 커버슬립을 뒤집습니다. 침지 렌즈로 현미경 분석을 위해 1시간 동안 건조시키십시오. 그렇지 않으면 검사할 준비가 된 것입니다.
    알림: NET은 매우 깨지기 쉽고 준비 중에 쉽게 손실될 수 있으므로 고정 후에도 조작할 때 세심한 주의를 기울여야 합니다.

4. NET의 정량화

  1. 제조업체의 지침에 따라 Tris-EDTA(TE) 완충액 및 PicoGreen(dsDNA 분석 시약) 작업 용액을 준비합니다( 재료 표 참조).
  2. 스톡 DNA를 1ng/mL, 10ng/mL, 100ng/mL 및 1μg/mL의 농도로 희석하여 표준물질을 준비합니다.
    참고: NET의 농도를 정량화하기 위해 dsDNA 분석 키트( 재료 표 참조)를 사용하여 제조업체의 지침을 준수했습니다. Tris-EDTA(TE) 완충액 및 dsDNA 분석 시약은 각각 19배 부피의 이중 증류수 또는 199배 부피의 TE 완충액을 사용하여 준비되었습니다. 이어서, 표준 용액(1ng/mL, 10ng/mL, 100ng/mL 및 1μg/mL)을 제조하고, 각 50μL의 시료를 450μL의 TE 완충액과 결합하였다.
  3. 각 샘플의 50μL를 450μL TE 버퍼에 추가합니다.
  4. 표준물질 및 샘플을 포함하여 동일한 부피의 분석 시약 작업 용액과 함께 100μL의 표준물질 또는 샘플을 96웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다.
  5. 직사광선을 피하고 실온에서 2-5분 동안 접시를 배양합니다.
  6. 방출 스펙트럼이 약 530nm이고 흡광도 스펙트럼이 약 480nm인 형광 마이크로플레이트 리더를 사용하여 샘플을 판독합니다.
  7. 표준물질에 의해 생성된 표준 곡선을 사용하여 각 샘플의 NETs 농도를 계산합니다.

5. 세포세포분석에 의한 NETs 분비 분석

  1. 96웰 플레이트에서 배양한 세포에 핵 염색( 재료 표 참조)을 추가하여 최종 농도 10ng/mL에 도달하고 30분 동안 배양합니다.
  2. cell-free DNA(cfDNA, 재료 표 참조) 염색을 세포에 추가하여 최종 농도 300nM에 도달하고 10분 동안 배양합니다.
  3. 부드러운 피펫팅으로 형광 염료를 혼합합니다. 상층액을 버리거나 펠릿을 세척하지 마십시오.
  4. 샘플 플레이트를 유세포 분석기 기기에 로드합니다.
  5. 다양한 채널의 초점 및 노출 시간에 대한 매개변수를 설정합니다: 파란색(예: 377/50nm, em: 470/22nm), 일반적으로 30,000ms의 노출, 녹색(예: 483/32nm, eM: 536/40nm), 일반적으로 5,000ms의 노출.
  6. 다양한 채널에서 전체 플레이트의 매우 균일한 이미지를 캡처합니다.
  7. 다양한 그룹에 대한 핵 염색 수를 분석합니다. 유사하다면 cfDNA 염색 횟수로 NET 분비를 측정할 수 있습니다.

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결과

여기에 요약된 프로토콜은 두 가지 뚜렷한 방법을 설명하며, 각 방법은 개선된 정제 또는 간소화된 단계를 특징으로 합니다. 두 방법 모두 쥐 당 약 0.5 x 108-1 x 108 호중구를 산출했습니다. annexin V-FITC/PI 세포사멸 검출 키트를 사용한 유세포 분석 분석은 생쥐 및 인간과 유사한 90% 이상의 세포 생존율을 보였습니다(그림 1). 골수에서 호중구를 분리하는 동안 림프구 오염이 불가피한 것처럼 보였지만, 2단계 분석법은 1단계 분석법이 달성한 50%에 비해 90%의 향상된 순도 수준을 보여주었습니다(그림 2).

NET 분비에 대한 유사한 반응은 PMA 자극에 관계없이 말초 호중구와 골수 호중구 간에 식별 가능했습니다(그림 3). 또한, 쥐 NET은 서로 제한된...

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토론

호중구의 분리는 NETosis를 연구하는 데 있어 중추적인 단계를 구성하며, 신뢰할 수 있는 결과를 얻기 위해서는 적절한 분리 방법을 선택하는 것이 가장 중요합니다. 고려해야 할 중요한 요소는 격리 중 림프구 오염의 발생입니다. 이 문제를 해결하는 것은 골수에서 쥐 호중구를 분리할 때 특히 중요합니다. 림프구(1.0337-1.0765, 최대 1.0526)에 비해 호중구(1.0814-1.0919, 최대 1.0919)의 뚜렷한 밀도 범위에도 불구하고 림프구의 오염은 피할 수 없습니다. 이는 부분적으로 골수에 림프구가 풍부하고 미성숙 림프구의 밀도가 증가했기 때문인 것으로 볼 수 있다15. Percoll 및 Ficoll을 사용하는 것과 같은 밀도 구배 분리와 같은 기술은 림프구 오염을 억제하는 데 도움이 될 수 있지만 림프구를 완전히 제거하는 것은 어려울 수 있습니다. 특정 밀도 구배로 보정된 특수 Percoll 용액을 사용하여 쥐 호중구와 다른 골수 세포 간의 밀도 차이를 활용하여 오염을 ...

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공개 사항

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

자금 지원: 이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단(Nos. 82004154, 81900311, 82100336 및 81970345)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
A488-활용 당나귀 anti-rabbit IgG(H + L)Invitrogen, USAA32790
A594-활용 당나귀 anti-mouse IgG(H + L)Invitrogen, USAA32744
A594-활용 염소 anti-mouse IgG1 Invitrogen, 미국A21125
Anti-rat myeloperoxidaseAbcam, Englandab134132
Anti-rat neutrophil elastaseAbcam, Englandab21595
Celigo Image CytometerNexelom, USA200-BFFL-5C
DNase ISigma,USA 10104159001
소 태아 혈청(FBS)Gibco, USA10099141C
행크 s Balanced Salt Solution (HBSS)Gibco, 미국C14175500BT
HoechstThermofisher, 미국33342
IsofluraneRWD, 중국R510-22-10
MowiolSigma, 미국81381
Normal Donkey SerumSolarbio, 중국SL050
파라포름알데히드biosharp, 중국BL539A
페니실린-스트렙토마이신Hyclone, 미국SV30010
PercollGE, 미국P8370-1L
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)Sigma, USA  P1585
Picogreen dsDNA 분석 키트Invitrogen, 미국P11496
쥐 호중구 분리 키트Solarbio, 중국P9200
적혈구 용해 완충액Solarbio, 중국R1010
Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 매체Hyclone, 미국SH30809.01B
RWD 범용 동물 마취기RWD, 중국R500
Sprague Dawley (SD) 쥐Dashuo, 중국
SytoxGreenThermofisher, 미국S7020
Tris-EDTA (TE) 버퍼Solarbio, 중국T1120
Triton-X-100Biofroxx, 독일1139ML100

참고문헌

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  3. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
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  17. Wong, K. L., et al. Gene expression profiling reveals the defining features of the classical, intermediate, and nonclassical human monocyte subsets. Blood. 118 (5), e16-e31 (2011).
  18. Nauseef, W. M. Isolation of human neutrophils from venous blood. Methods in Molecular Biology. 412, 15-20 (2007).
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  21. Evrard, M., et al. Developmental analysis of bone marrow neutrophils reveals populations specialized in expansion, trafficking, and effector functions. Immunity. 48 (2), 364-379 (2018).

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