골수 유래 대식세포에서 작은 세포외 소포의 펩타이드 식별

Summary

이 프로토콜은 차등 초원심분리에 의해 대식세포로부터 작은 세포외 소포를 분리하고 질량분석법에 의한 식별을 위해 펩티돔을 추출하는 절차를 설명합니다.

Abstract

작은 세포외 소포(sEV)는 일반적으로 다소포체(MVB)의 엑소사이토시스에 의해 분비됩니다. 직경 <200nm의 나노소포는 다양한 체액에 존재합니다. 이 sEV는 단백질, DNA, RNA 및 대사 산물과 같은 화물을 통해 유전자 전사 및 번역, 세포 증식 및 생존, 면역 및 염증과 같은 다양한 생물학적 과정을 조절합니다. 현재 sEV 분리를 위한 다양한 기술이 개발되고 있습니다. 그 중 초원심분리 기반 방법은 황금 표준으로 간주되며 sEV 분리에 널리 사용됩니다. 펩타이드는 길이가 50개 미만의 아미노산을 가진 천연 생체거대분자입니다. 이러한 펩타이드는 호르몬, 신경 전달 물질 및 세포 성장 인자와 같은 생물학적 활성을 가진 다양한 생물학적 과정에 참여합니다. 펩티돔은 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법(LC-MS/MS)을 통해 특정 생물학적 샘플의 내인성 펩타이드를 체계적으로 분석하기 위한 것입니다. 여기에서는 차등 초원심분리에 의해 sEV를 분리하는 프로토콜을 도입하고 LC-MS/MS에 의한 식별을 위해 펩티돔을 추출했습니다. 이 방법은 골수 유래 대식세포에서 수백 개의 sEV 유래 펩타이드를 식별했습니다.

Introduction

직경이 200nm 미만인 작은 세포외 소포체(sEV)는 거의 모든 유형의 체액에 존재하며 소변, 땀, 눈물, 뇌척수액 및 양수를 포함한 모든 종류의 세포에서 분비됩니다¹. 처음에 sEV는 세포 폐기물 처리를 위한 용기로 간주되어 이후 10년 동안 최소한의 연구로 이어졌습니다². 최근 sEV에 특정 단백질, 지질, 핵산 및 기타 대사 산물이 포함되어 있다는 증거가 증가하고 있습니다. 이 분자들은 표적 세포³로 운반되어 세포간 통신에 기여하며, 이를 통해 조직 복구, 혈관신생, 면역4 및 염증^5,6, 종양 발달 및 전이 ^7,8,9 등과 같은 다양한 생물학적 과정에 참여한다.

sEV 연구를 용이하게 하려면 복잡한 샘플에서 sEV를 분리하는 것이 필수적입니다. 밀도, 입자 크기 및 표면 마커 단백질과 같은 sEV....

Protocol

1. 작은 세포외 소포체의 분리

알림: 1.1°C에서 1.11-4단계의 모든 원심분리를 수행합니다.

1. sEVs-free 소 태아 혈청(FBS)의 제조: FBS를 초원심분리기(재료 표 참조)를 통해 4°C에서 110,000 ×g으로 밤새 원심분리하여 내인성 sEV를 제거하였다. 상층액을 수집하고, 0.2μm 한외여과막으로 여과 멸균하고, -20°C에서 보관한다.
2. 약 3 x 10⁷ 불멸화 골수 유래 대식세포(iBMDM)를 150 mm 배양 접시에 담고 20 mL의 DMEM 배양 배지를 첨가한다( 재료 표 참조).
3. sEV를 수집하기 전에 매체를 폐기하십시오. 세포를 PBS(phosphate-buffered saline; 재료표) 10% sEVs-free FBS가 포함된 매체로 교체하십시오.
4. 실험의 필요에 따라 세포 상청액을 수집하여 50mL 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
5. 세포 상층액을 300 × g 에서 10 분 동안 원심 분리하여 세포를 제거하고, 펠렛을 버리고, 상층액을 새로운 50 mL ....

Results

차등 초원심분리(그림 1)로 분리된 sEV의 경우, ISEV(International Society for Extracellular Vesicles)¹⁷에 따라 형태, 입자 크기 분포 및 단백질 마커를 평가했습니다.

먼저, sEV의 형태를 TEM으로 관찰하여 전형적인 컵형 구조를 보여주었습니다(그림 2A). NTA는 분리된 sEV가 대부분 136nm에 집중되어 있음을 보여주었으며(그림 2B), 이는 보고된 크기(30-150nm)와 일치했습니다.¹. 마지막으로, sEV의 단백질 마커는 웨스턴 블롯으로 확인되었습니다. 그 결과 분리된 sEV는 CD9, β-액틴 및 TSG101을 포함한 sEV의 마커가 상당히 풍부하다는 것을 보여주었습니다. .......

Discussion

sEV의 기능을 조사할 때 잠재적인 오염을 피하기 위해 복잡한 생물학적 샘플에서 고순도 sEV를 얻는 것이 필수적입니다. sEVs 분리를 위한 다양한 방법들이 개발되었으며¹³, 이 방법들 중 시차 초원심분리 기반 방법들은 상대적으로 높은 순도의 sEV를 보여주었다. 이 연구에서는 200mL의 세포 상청액을 6시간 동안 수집하고, 약 200-300μg의 sEV를 차등 초원심분리에 의해 얻었습니다. 그러나 sEV 펠릿은 초원심분리(단계 1.8) 동안 보이지 않을 수 있다는 점에 유의해야 합니다. 따라서 가능한 한 튜브 바닥을 피펫팅하는 것이 좋습니다. 이 단계는 매우 중요하며 sEV의 수율에 직접적인 영향을 미칩니다. 또한 sEV가 110,000 × g 에서 침전될 때 원심분리 시간 또는 세포 상청액 수집 기간을 연장하는 등 수율을 개선하기 위해 프로토콜의 추가 최적화가 필요합니다(1.8 및 1.9단계). 차등 초원심분리에 의해 분리된 sEV는 순도가 높지만 시간도 오래 걸.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BCA 단백질 분석 키트	Beyotime Technology	P0012
CD9	Beyotime Technology	AF1192
원심 필터 튜브	Millipore	UFC5010BK
원심분리기 병, 폴리프로필렌	Beckman Coulter	357003	고속 원심분리기
화학발광 기판	Thermo Fisher Scientific	34580
Dithiothreitol	Solarbio	D8220	100 g
DMEM 배양 배지	Cell World	N? GRP94
	세포 신호 전달 기술	20292
고속 원심분리기	Beckman Coulter	Avanti JXN-26	원심분리기 로터(JA-25.50)
불멸 골수 유래 대식세포(iBMDM)	National Institute of Biological Sciences, China		Feng Shao 박사 제공(중국 National Institute of Biological Sciences)
요오도아세트아미드	Sigma	l1149	5 g
마이크로퓨지 튜브 폴리프로필렌	Beckman Coulter	357448	1.5 mL, 테이블탑 초원심분리기
나노 고성능 LC 시스템	Thermo Fisher Scientific	EASY-nLC 1000
나노 입자 추적 분석	Malvern Panalytical	NanoSight LM10	NanoSight NTA3.4
Orbitrap Q Exactive HF-X 질량분석기	Thermo Fisher Scientific	N/A
인산염 완충 식염수	Solarbio	P1020
폴리알로머 원심분리기 튜브	Beckman Coulter	326823	초원심분리기
프로테아제 억제제	Bimake	B14002
SpeedVac, 진공 농축기	Eppendorf	Concentrator plus
, 탁상용 초원심분리기	, Beckman Coulter	Optima MAX-XP	초원심분리기 로터(TLA 55)
투과전자현미경	HITACHI	H-7650B
, TSG101	Sigma	AF8258
초원심분리기	Beckman Coulter	Optima XPN-100	초원심분리기 로터 (SW32 Ti)
초음파 세포 분뇨기	Scientz	SCIENTZ-IID
웨스턴 블롯 이미저	Bio-Rad	ChemiDocXRs	Image lab 4.0 (beta 7)
β-actin	Sigma	A3853