행동하는 성인 제브라피쉬의 전뇌 활동에 대한 Two-Photon Calcium Imaging

유전적으로 인코딩된 지표 또는 합성 염료를 사용한 칼슘 형광 이미징은 인간이 아닌 영장류, 설치류, 조류 및 곤충을 포함한 행동하는 동물의 신경 활동을 측정하는 강력한 방법이었습니다¹. 뇌 표면 아래 최대 약 800μm까지 수백 개의 세포 활동을 다광자 이미징 ^2,3을 사용하여 동시에 측정할 수 있습니다. 특정 세포 유형의 활성은 유전적으로 정의된 신경 세포 집단에서 칼슘 지표를 발현하여 측정할 수도 있습니다. 작은 척추동물 모델에 이미징 방법을 적용하면 뇌 영역 전반에 걸쳐 신경 계산 분야에서 새로운 가능성이 열립니다.

제브라피시는 신경 과학 연구에서 널리 사용되는 모델 시스템입니다. 수정 후 약 6일이 지난 제브라피시 유충은 작은 뇌와 투명한 몸체로 인해 칼슘 이미징에 사용되어 왔다⁴. 어린 제브라피시(생후 3-4주)는 감각 운동 경로 ^5,6의 기저에 있는 신경 메커니즘을 연구하는 데에도 사용됩니다. 그러나 연상 학습 및 사회적 행동을 포함한 복잡한 행동에 대한 최대 수행 수준은 ^7,8세의 나이에 도달합니다. 따라서 이미징 방법을 사용하여 성인 제브라피쉬의 뇌에서 여러 인지 기능을 연구하려면 신뢰할 수 있는 프로토콜이 필요합니다. 제브라피시 유충과 어린 제브라피쉬는 생체 내 이미징을 위해 아가로스에 삽입될 수 있지만, 생후 2개월 이상의 성체 제브라피쉬는 이러한 조건에서 저산소증을 앓고 있으며 신체적으로 너무 강해서 아가로스로 억제할 수 없습니다. 따라서 뇌를 안정시키고 아가미를 통해 동물이 자유롭게 숨을 쉴 수 있도록 하는 수술이 필요합니다.

여기에서는 단일 헤드 바의 새로운 설계와 관련된 머리 지지대 프로토콜에 대해 설명합니다. 25분의 단축된 수술 시간은 이전 방법⁹보다 두 배 빠릅니다. 또한 기록 챔버(반 육각형 탱크), 헤드 스테이지 및 두 부분을 결합하는 빠른 잠금 메커니즘⁹의 설계에 대해서도 설명합니다. 마지막으로, 시각적으로 촉발된 뇌 활동과 행동을 연구하기 위해 몰입형 시각적 자극을 제시하는 설정도 설명합니다. 전반적으로, 여기에 설명된 절차는 머리를 고정한 성인 제브라피쉬의 유전적으로 정의된 세포 집단에서 이광자 칼슘 이미징을 수행하는 데 사용할 수 있으며, 이를 통해 다양한 행동 패러다임 동안 뇌 활동을 조사할 수 있습니다.

모든 동물 시술은 Academia Sinica의 Institutional Animal Care and Use Committee의 지침에 따라 승인되고 수행되었습니다. 연구 도구에 대한 자세한 내용은 재료 표에서 확인할 수 있습니다.

1. 기록실의 준비

1. 반 육각형 탱크, 베이스 플레이트 및 헤드 스테이지를 준비합니다(그림 1A; 보충 파일 1-3). 헤드 스테이지는 원형 플레이트에 부착된 두 개의 금속 기둥으로 구성됩니다. 원형 플레이트에는 베이스 플레이트에 잠글 수 있는 홈이 있습니다. 함께 잠긴 후 헤드 스테이지와 베이스 플레이트는 반 육각형 탱크의 바닥에 놓입니다.
2. 반육각형 탱크를 현미경의 실험 플랫폼에 놓습니다. 플랫폼은 변환 단계의 한계에 도달하지 않고 X 및 Y 방향으로 이동할 수 있어야 합니다.
3. 810nm 적외선(IR)과 카메라를 헤드 스테이지로 향하게 하여 동작을 기록합니다. 카메라의 시야가 성인 제브라피쉬가 들어갈 수 있을 만큼 충분히 큰지 확인하십시오.
   1. 이광자 레이저와 시각 자극이 행동 기록을 방해하지 않도록 카메라 앞에 각각 875nm 단거리 통과 필터와 700nm 장역 통과 필터를 설정합니다.
4. 시각적 자극을 표현하려면 반 육각형 탱크의 세 벽 안쪽에 백 프로젝션 필름을 부착합니다(그림 1A).
5. 세 개의 프로젝터를 탱크의 세 표면에 조준합니다. 세 개의 이미지는 연속적인 시각적 장면을 형성하도록 정렬되어야 합니다. 프로젝터 조명이 칼슘 형광 신호를 오염시키는 것을 방지하려면 각 프로젝터 앞에 중성 밀도 필터와 적색 컬러 필터(600nm, 롱패스)를 배치하고 광전자 증배관(PMT) 앞에 대역 통과 필터(510/80nm)를 배치합니다.

그림 1: 머리 지지대 수술에 필요한 기구. (A) 헤드 스테이지의 원형 플레이트와 반 육각형 탱크 내부의 베이스 플레이트 사이의 빠른 잠금 메커니즘. 맞춤형 부품의 CAD(Computer-Aided Design) 파일은 보충 파일 1-4에서 찾을 수 있습니다. (B) 헤드레스트를 위한 Ω형 헤드 바. (C) 헤드 바를 부착 부위에 배치하는 데 사용되는 3축 미세 조작기. 삽입 사진: 점토에서 헤드 바의 방향. (D) 수술 중 물고기를 잡기 위한 대포. 삽입 사진: 대포 안에 있는 물고기의 방향. (E) 물고기 로딩 모듈 및 물고기를 헤드 스테이지에 로드하는 데 사용되는 마이크로 매니퓰레이터. 삽입 사진: 모듈 내 물고기의 방향입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2. 머리구속 수술

1. Ω자형 헤드 바를 준비합니다(그림 1B; 보충 파일 4) 제브라피시 헤드레스트용. 이렇게 하려면 유성 모델링 점토 조각을 3축 마이크로 매니퓰레이터에 부착합니다. 점토가 헤드 바를 고정할 수 있을 만큼 단단하지만 헤드레스트 후 헤드 바에서 분리될 수 있을 만큼 부드러운지 확인하십시오.
2. 헤드 바의 암을 점토에 삽입하고 헤드 바를 수평으로 향하게 합니다(그림 1C). 이렇게 하면 나중에 제브라피쉬에 헤드 바를 부착할 때 수평이 됩니다.
   참고: 헤드 바는 티타늄(24mg) 또는 스테인리스강(43mg)으로 만들 수 있으며 여러 실험에 재사용할 수 있습니다. 헤드 바 재질은 헤드레스트 하에서 성인 제브라피시(체중 범위 300-1,000mg)의 행동에 영향을 미치지 않습니다.
3. 수술 중에 물고기 몸체를 제자리에 고정하기 위한 속이 빈 튜브인 대포를 준비합니다(그림 1D).
4. 어항 물에 0.03% 및 0.01% 트리카인 메탄설포네이트(TMS, 재료 표 참조)를 준비합니다. 이것은 수술 중 물고기를 마취하고 진정 상태로 유지하는 데 사용됩니다.
5. 두개골의 부착 부위에서 과도한 피부와 물을 제거하기 위해 4개의 조직 면봉을 준비합니다. 각 면봉을 준비하려면 종이 타월을 3cm 정사각형으로 자르고 대각선을 따라 접어 튜브 모양의 구조를 만듭니다. 튜브의 끝을 미세한 지점으로 비틀십시오. 부착 부위가 매우 작기 때문에 미세한 포인트로 면봉을 더 세밀하게 제어할 수 있습니다.
6. 마이크로 매니퓰레이터를 위한 물고기 로딩 모듈을 준비합니다(그림 1E).
   알림: 모듈은 직각 포스트 cl로 함께 고정된 두 개의 강철 기둥으로 구성됩니다.amp. 하나의 포스트는 마이크로 매니퓰레이터에 부착되고 다른 포스트는 물고기를 운반하는 회전 포스트 클램프를 고정합니다. 모듈은 물고기를 헤드 스테이지에 배치하는 데 사용됩니다.tage 미세 제어로. 회전 포스트 클램프는 물고기의 피치 각도를 변경하는 피치 조절기 역할을 합니다.
7. 어항 물에서 0.03% TMS로 물고기를 마취합니다. 다음 단계에서 주사기를 사용하여 어항 물에 있는 0.01% TMS를 90초마다 짧은 펄스로 입으로 전달합니다. 관류에서 나오는 물의 흐름은 아가미 움직임을 유도해야 합니다. 이렇게 하면 수술 중 물고기가 40분 이상 생존할 수 있습니다.
   참고: Tg[neuroD:GCaMP6f]는 유충 단계와 성충 단계 모두에서 전뇌의 칼슘 지표가 광범위하게 발현되기 때문에 사용됩니다(¹⁰).
   알림: 선택적으로 중력 관류를 사용하여 양손을 사용하는 수술 기간 동안 입으로 일정한 물 흐름을 제공합니다.
8. 대포 안에 물고기를 담는 캡슐(그림 2A)에 물고기를 감쌉니다.
   1. 마취된 물고기를 꼬리 끝에서 꼬리부터 아가미까지 약 1mm의 축축한 종이 티슈로 감쌉니다. 생선이 조직 밖으로 미끄러지지 않도록 포장이 단단히 되어 있는지 확인하십시오.
   2. 세로 슬릿이 있는 부드러운 플라스틱 튜브(예: 중간 크기의 열수축 튜브를 잘라 열림)를 종이 티슈 주위에 감아 꼬리 끝에서 꼬리에서 아가미까지 약 2mm까지 물고기를 덮습니다. 튜브는 수술 내내 물고기의 몸이 똑바로 유지되도록 합니다.
   3. 종이 타월로 튜브를 대포의 직경과 거의 비슷한 직경으로 감습니다.
   4. 플라스틱 전사 피펫의 전구에서 잘라낸 부드러운 플라스틱 튜브를 종이 타월 주위에 감습니다. 이렇게 하면 캡슐을 대포에 원활하게 장전할 수 있습니다.
   5. 대포에 물고기를 장전하십시오.
9. 메스를 사용하여 부착 부위를 덮고 있는 피부, 즉 소뇌와 아가미 위쪽에 있는 두개골의 두 삼각형 부위를 덮고 있는 피부를 제거한 다음(그림 2B) 부착 부위 사이의 영역을 덮고 있는 피부를 제거합니다. 티슈 면봉을 사용하여 부착 부위를 건조시키고 남아 있는 피부를 제거합니다.
   1. 피부를 제거하는 동안 조절 가능한 플랫폼을 사용하여 머리를 지지하되 수술 중 눈 부상을 방지하기 위해 플랫폼이 눈에 닿지 않아야 합니다.
      참고: 부착 부위의 피부를 철저히 제거하는 것은 이미징 중 모션 아티팩트를 줄이는 데 매우 중요합니다.
10. 10μL 피펫 팁을 사용하여 각 부착 부위의 중앙에 티슈 접착제 한 방울( 재료 표 참조)을 바릅니다.
    알림: 티슈 접착제는 부착 부위를 덮고 빠르게 건조됩니다. 조직 접착제는 두개골과 헤드 바를 접착하는 데 사용되는 치과용 시멘트 사이의 결합 인터페이스를 제공하고 아가미의 물이 부착 부위에 도달하는 것을 방지합니다.
11. 물고기 몸체를 똑바로 세우고 헤드 바를 접착할 준비를 위해 헤드 바를 약간 위로 배치하고 부착 부위에 꼬리를 놓습니다.
12. 치과용 시멘트( 재료 표 참조)를 준비하고 즉시 사용하여 헤드 바를 두개골에 붙입니다(그림 2C). 절차는 시간에 민감하며 45초 이내에 완료해야 합니다.
    1. 폴리머 1 작은 스푼과 퀵 모노머 4 방울 및 촉매 V 1 방울을 혼합하여 혼합물을 15 초 동안 고르게 저어줍니다.
    2. 마이크로피펫과 10μL 피펫 팁을 사용하여 혼합물을 부착 부위와 부위 사이 부위에 도포합니다. 아가미와 눈을 가리지 마십시오.
    3. 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 헤드 바를 시멘트에 부드럽게 누릅니다. 남은 시멘트로 헤드 바를 덮습니다.
    4. 치과용 시멘트가 경화될 때까지 12분 동안 기다리십시오. 시멘트에 물이 닿지 않도록 하십시오.
13. 칼슘 이미징을 위해 전뇌에 대한 광학적 접근을 개선하려면 텔레팔론 위의 피부를 제거합니다. 피부 제거는 메스를 사용하여 5번의 절단으로 3분 안에 완료할 수 있습니다(그림 2D). 두개골 표면에 부착된 지질 방울이 제거되었는지 확인하십시오.
14. 경화 후 헤드 바에서 점토를 제거합니다.
15. 전체 캡슐을 대포에서 마이크로 매니퓰레이터의 물고기 로딩 모듈에 있는 피치 조절기로 옮깁니다.
16. 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 물고기의 위치를 지정합니다. 헤드 바는 헤드 스테이지의 금속 기둥 위에 위치해야 합니다. 물고기의 피치 각도를 약간 높여 이광자 이미징 중에 전뇌의 표면이 광학 평면에 더 잘 정렬될 수 있도록 합니다.
17. 자외선(UV) 경화 접착제로 헤드 바를 금속 기둥에 붙입니다. 15초의 UV 노출은 경화에 충분합니다.
18. 캡슐에서 물고기를 꺼내고 헤드 스테이지를 반 육각형 수조 내의 베이스 플레이트에 고정합니다.
19. 어항 물에 동물을 담그십시오. 물고기는 호흡을 시작하고 1-2분 이내에 마취에서 회복해야 합니다.
    알림: 선택적으로 주사기 관류를 사용하여 입에 신선한 물을 전달합니다.

그림 2: 머리 지지대 수술 중 주요 단계 . (A) 대포 내부의 캡슐 구성. (B) 두개골의 부착 부위(빨간색). 빨간색 화살표는 혈관 부위를 나타냅니다. (C) 상단: 물고기 두개골에 부착된 헤드 바. 아래: 헤드 스테이지에 적재된 물고기. (D) 전뇌 위의 피부를 제거하는 데 필요한 절개. 숫자는 절단 순서를 나타냅니다. 동물의 출혈을 방지하기 위해 표시된 부위(화살촉)에서 피부를 제거하지 마십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

3. 이광자 이미징

1. 레이저를 켜고 전원이 안정화될 때까지 30분 동안 기다립니다. 샘플에서 파장을 920nm로 설정하고 전력을 약 50mW로 설정합니다.
   알림: 공진 스캐너에 의해 제어되는 레이저 빔은 스캔 경로의 턴어라운드 지점에서 천천히 움직입니다. 조직 손상을 방지하기 위해 Pockels 셀을 사용하여 턴어라운드 지점에서 레이저 출력을 줄입니다.
2. 머리에 고정된 제브라피시가 들어 있는 기록 챔버를 실험 플랫폼에 놓습니다(그림 3A). 플랫폼은 변환 단계의 한계에 도달하지 않고 X 및 Y 방향으로 이동할 수 있어야 합니다.
3. 대물 렌즈를 전뇌 표면에 최대한 가깝게 배치하십시오. 대물 렌즈는 동공의 앞쪽 가장자리를 향해야 합니다(그림 3B).
4. 레이저 셔터를 열고 PMT를 활성화합니다. 형광 이미지에서 등쪽 전뇌가 드러날 때까지 대물 렌즈(~1mm)를 점차적으로 올립니다(그림 3C).
5. 기록되는 뉴런의 수를 늘리려면 피에조 액추에이터를 사용하여 여러 깊이(15μm 간격의 6개 이미지 평면)에서 이미지를 획득합니다. 이렇게 하면 프레임 속도를 희생하는 대신 데이터 수율이 증가합니다. 빠른 Z축 스캐닝을 통해 피에조 액추에이터를 제어할 수 있습니다(균일 모드, 슬라이스 수 = 6, 스텝 크기 = 15μm, 파형 = 톱니, 플라이백 시간 = 4ms, 액추에이터 지연 = 8ms).
6. 행동 기록을 위해 탱크 양쪽에 있는 810nm 적외선(IR) 조명을 켭니다. 카메라에서 명확하게 보여야 하는 몸 전체를 비추도록 각도를 조정합니다.
7. 프로젝터를 켭니다.
8. 데이터 기록을 시작합니다.

그림 3: 칼슘 이미징, 행동 기록 및 시각적 자극 표시를 수행하기 위한 설정. (A) 3개의 프로젝터가 반육각형 탱크의 벽에 시각적 자극을 제공합니다. 측면의 IR 조명은 제브라피쉬의 몸을 비추는 데 사용됩니다. (B) 대물 렌즈의 위치. 왼쪽: 앞 모습. 오른쪽: 측면도. 16x 대물렌즈와 표적 뇌 영역 사이의 거리는 약 2.5mm입니다. (C) 이광자 이미지의 예. 왼쪽: Tg[neuroD:GCaMP6f]에서 전체 등쪽 전뇌의 최대 투영. 오른쪽: 여러 뇌 영역에 걸쳐 있는 뉴런을 보여주는 확대 이미지. 삽입: 다른 뇌 영역에서 더 높은 배율. 이미지는 5Hz에서 기록된 10초 데이터의 평균입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

프로토콜은 머리 구속 수술과 전뇌의 신경 활동에 대한 이광자 칼슘 영상의 두 부분으로 구성됩니다. 수술의 성공은 동물의 생존과 머리 지지대의 안정성에 의해 결정됩니다. 수술 중 0.01% TMS 용액을 경구로 자주 관류하면 생존율을 크게 향상시킬 수 있습니다. 물고기는 어항 물에 잠긴 후 1-2분 이내에 마취에서 회복되고 활발하게 숨을 쉬어야 합니다. 2광자 칼슘 이미징을 통해 뇌 표면에서 온전한 두개골(두께 ~40μm)을 통해 최대 200μm 깊이에서 등쪽 전뇌의 개별 뉴런의 활동을 기록할 수 있습니다. 이 이미징 범위는 내측 영역(Dm), 중앙 영역의 로스트랄 부분(rDc), 중앙 영역의 꼬리 부분(cDc) 및 측면 영역(Dl)을 포함하여 등쪽 모상뇌(D)의 여러 영역을 포함합니다. 이들은 모두 성체 제브라피쉬의 텔렌체팔론의 30%를 차지합니다(그림 3C). 피에조 액추에이터를 사용한 체적 이미징에서는 일반적으로 Dl 또는 cDc에서 150개의 뉴런 활동을 기록하고 Tg[neuroD:GCaMP6f]10에서 Dm 및 rDc의 300개 뉴런의 활동을 기록합니다. 뇌 영상 촬영 중에 동시 행동 기록이 수행되어 운동 출력의 신경 상관 관계를 식별할 수 있습니다(그림 4).

이광자 이미징 중에 꼬리 움직임이 이미지에서 눈에 띄는 모션 아티팩트를 유도해서는 안 됩니다. 극한의 고군분투 중에 작은(<1μm) 일시적인 움직임을 관찰할 수 있습니다. 이러한 움직임은 일반적으로 가역적이므로 나중에 이미징을 계속할 수 있습니다. 또한 측면 및 축 방향9에서 느린 드리프트(<1μm min-1)를 관찰합니다. 축 시료 표류로 인한 뉴런 손실을 방지하기 위해 일반적으로 이미징 세션을 10분으로 제한합니다. 칼슘 지시약의 광표백은 지정된 레이저 출력에서 10분 이미징 세션 후에 관찰되어서는 안 됩니다.

그림 4: 성체 제브라피쉬의 행동 추적 및 신경 활동 패턴. (A) 행동을 녹화하는 카메라 프레임의 예시 프레임(복부 보기). (B) 전뇌 뉴런의 활동(ΔF/F, 검은색) 및 꼬리 운동 강도(파란색). 꼬리 움직임의 강도는 연속적인 비디오 프레임 간의 절대 픽셀 단위 차이의 평균으로 정량화되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 1: 베이스 플레이트의 디자인. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 2: 원형 플레이트의 설계. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 3: 반 육각형 탱크의 설계. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 4: 헤드 바의 디자인. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 1: 문제 해결 세부 정보. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

저자는 경쟁하는 재정적 이익이 없다고 선언합니다.