Drosophila melanogaster Third Instar 애벌레 뇌의 생세포 이미징

요약

여기에서 우리는 생리학적 조건에서 세포 및 세포 내 역학을 관찰하기 위해 Drosophila melanogaster 세 번째 instar 유충에서 살아있는 외식편 뇌를 준비, 해부, 장착 및 이미지화하는 워크플로에 대해 논의합니다.

초록

초파리 신경 줄기 세포(신경아세포, 이하 NB)는 비대칭 분열을 거쳐 자가 재생 신경아세포를 재생하는 동시에 분화 신경절 모세포(GMC)를 형성하며, 이 세포는 두 개의 뉴런 또는 신경교를 생성하기 위해 한 번의 추가 분열을 겪습니다. NB에 대한 연구는 세포 극성, 방추 방향, 신경 줄기 세포 자가 재생 및 분화의 기초가 되는 분자 메커니즘을 밝혀냈습니다. 이러한 비대칭 세포 분열은 생세포 이미징을 통해 쉽게 관찰할 수 있으므로 유충 NB는 생체 조직에서 비대칭 세포 분열의 시공간 역학을 조사하는 데 이상적입니다. 영양이 보충된 배지에서 적절하게 해부되고 이미지화되면 외식편 뇌의 NB는 12-20시간 동안 강력하게 분열합니다. 이전에 설명한 방법은 기술적으로 어렵고 현장을 처음 접하는 사람들에게는 어려울 수 있습니다. 여기에서는 지방 체내 보충제를 사용하여 살아있는 제3성 유충 뇌 외식편의 준비, 해부, 장착 및 이미징에 대한 프로토콜이 설명됩니다. 잠재적인 문제에 대해서도 논의하고 이 기술을 사용할 수 있는 방법에 대한 예가 제공됩니다.

서론

비대칭 세포 분열(ACD)은 RNA, 단백질 및 세포 소기관과 같은 세포 내 구성 요소가 딸 세포 사이에서 불균등하게 분할되는 과정입니다 ^1,2. 이 과정은 줄기 세포에서 흔히 볼 수 있으며, 줄기 세포는 ACD를 거쳐 다른 발달 운명을 가진 딸 세포를 생성합니다. 초파리 NB는 비대칭으로 분열하여 줄기를 유지하는 하나의 NB와 하나의 신경절 모세포(GMC)를 생성합니다. GMC는 분화 뉴런 또는 신경교를 생성하기 위해 추가 분열을 겪습니다³. 비대칭적으로 분열하는 NB는 현미경을 통해 쉽게 관찰할 수 있는 제3 유충의 발달 중인 뇌에 풍부합니다. 세 번째 instar 애벌레 단계에는 각 중앙 뇌엽 3,4,5,6에 약 100개의 NB가 존재합니다.

비대칭 세포 분열은 매우 역동적인 과정입니다. 생세포 이미징 프로토콜은 세포 극성

프로토콜

참고: 그림 1 은 이 연구를 수행하는 데 필요한 자료를 보여줍니다.

1. 실험에 대한 고려 사항 및 준비

1. 애벌레가 과밀하는 것을 방지하십시오.
   참고: 이식편 유충 뇌의 품질은 해부 전 유충의 건강 및 품질과 직접적인 관련이 있습니다. 과밀로 영양실조에 걸린 유충은 일반적으로 뇌의 질이 낮다⁽³⁰).
   1. 영양실조를 피하기 위해 식사 뚜껑 접시당 20-30마리 이하의 유충이 존재하도록 하십시오. 이러한 예는 그림 2에서 볼 수 있습니다.
2. 사용하기 전에 Schneider의 배지를 필터링하고 분취하십시오.
   1. 각 해부에 대해 분주된 Schneider의 곤충 배지에 1% 소 성장 혈청(BGS)을 보충하여 신선한 이미징 및 해부 배지를 준비합니다. 5mL의 부피의 해부 및 이미징 배지는 일반적으로 이미징 실험에 충분합니다.
   2. 사용하기 전에 보충된 매체를 실온(RT)으로 데우십시오.
3. 수집할 동영상의 길이를 고려하고 이를 사용하여 이미징 매체....

결과

Pins::EGFP 및 Cherry::Jupiter를 발현하는 중추 뇌엽 NB의 해부 및 이미징
이 프로토콜을 보여주기 위해 UAS 구동 Cherry::Jupiter¹³ 및 내인성 태그가 지정된 Pins::EGFP¹⁶(w; worGal4, UAS-cherry::jupiter/CyO; Pins::EGFP/TM6B, Tb)는 멀티웰 이미징 슬라이드를 사용하여 설명된 프로토콜을 사용하여 4시간 동안 이미지화되었습니다(그림 5C,D). UAS에 의해 구동되는 Cherry::Jupiter¹³을 발현하고 내인성으로 태그된 Miranda::EGFP(w; worGal4, UAS-cherry::Zeus/CyO; UAS-Miranda::GFP/TM6B)를 멤브레인 바운드 슬라이드를 사용하여 10시간 동.......

토론

이 프로토콜은 Drosophila melanogaster 유충에서 살아있는 외식편 뇌의 이미징을 위한 한 가지 접근 방식을 설명합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 올바른 실험 조건에서 체외이식편 뇌를 12-20시간 동안 관찰할 수 있도록 합니다. 샘플 준비와 원하는 실험의 설계에 특별한 고려가 이루어져야합니다. 위에서 언급했듯이 해부 된 조직의 품질을 결정하는 가장 중요한 요소 중 하나는 유충의 건강입니다. 가능한 최고 품질을 얻으려면 수집 전에 유충이 잘 먹었는지 확인해야합니다. 건강에 해로운 유충은 가장 일반적으로 과밀에서 비롯됩니다. 이 문제를 해결하려면 수확 빈도를 늘리거나 갓 낳은 달걀로 접시를 빈 접시로 나누어 과밀을 최소화해야 합니다.

이 프로토콜의 또 다른 중요한 요소는 뇌 조직을 분리하는 해부 방법입니다. 뇌와 그 안의 NB는 해부 매체의 온도 및 해부 자체의 침습성과 같은 외부 요인에 매우 민감합니다. 너무 차가운 매체는 미세소관을 해중합하는 경향.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.22 & 마이크로; m 폴리에테르설폰(PES) 멤브레인	Genesee	25-231	진공 구동 필터
한천		20-248	과립 한천
분석 컴퓨터	Dell	NA	Intel Xeon Gold 5222 CPU(64비트 운영 체제에서 Windows 10 실행) 3.80GHz 프로세서 2
성장 혈청	HyClone	SH30541.02
챔버 이미징 슬라이드	Ibidi	80826
컨포칼 현미경	Nikon	NA
맞춤형 금속 슬라이드	NA	NA	사양은 Cabernard and Doe 2013 (Ref. 34) 참조
Dissection Dishes	Fisher Scientific	5024343	3-well porcelain micro spot plate
Dissection Forceps	World Precision Instruments	Dumont #5
해부 현미경	Leica	NA
해부 가위	Fine Science Tools(FST)	15003-08
배아 수집 케이지	Genesee	59-100
성충 파리를 마취하기 위해 CO2에 액세스할 수 있는 플라이패드	Genesee	59-172
가스 투과성 멤브레인	YSI	98095	가스 투과성 멤브레인
유리 커버 슬라이드	전자 현미경 과학	72204-03	# 1.5; 22mm x 40mm 유리 커버 슬립
Imaris	Oxford Instruments	NA	대안 : 피지, Volocity, Aivia
Imaris 파일 컨버터	Oxford Instruments	NA
Instant Yeast	Saf-Instant	NA
당밀	Genesee	62-117
페트리 접시	Greiner Bio-One	628161	60 mm x 15 mm 페트리 접시
바	셀린	NA
Schneider's Insect Medium with L-glutamine and sodium bicarbonate liquid	Millipore Sigma	S0146
SlideBook 획득 소프트웨어	3i	NA
진공 구동 여과 장치 0.22 µ &마이크로; m PES 멤브레인 필터	Genesee Scientific, GenClone	25-231

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