신경 세포 모델에서 미토콘드리아 내막 초세구조를 시각화하기 위한 라이브 셀 STED 이미징 사용

미토콘드리아는 내공생 기원의 진핵 세포 기관으로, 중간 대사 및 ATP 생산, 이온 항상성, 지질 생합성 및 프로그램된 세포 사멸(apoptosis)을 포함한 여러 주요 세포 과정을 조절하는 역할을 합니다. 이러한 소기관은 위상학적으로 복잡하며, 여러 개의 하위 구획(subcompartment)¹을 형성하는 이중막 시스템을 포함한다(그림 1A). 외부 미토콘드리아 막(OMM)은 세포질과 인터페이스하고 직접적인 세포 기관 간 접촉을 설정합니다 ^2,3. 내부 미토콘드리아 막(IMM)은 ATP 합성 및 기타 에너지 필요 프로세스를 구동하기 위해 주로 전기막 전위(ΔΨ_m)로 저장된 이온 구배를 유지하는 에너지 보존 막입니다 ^4,5. IMM은 OMM에 밀접하게 압착되는 내경막(IBM)과 크리스타막(CM)에 의해 결합된 크리스타라고 하는 돌출된 구조로 더 세분화됩니다. 이 막은 크리스탈 내 공간(ICS)과 막간 공간(IMS)에서 가장 안쪽의 매트릭스 구획을 묘사합니다.

미토콘드리아는 다이나민^{슈퍼패밀리}(dynamin superfamily)6의 기계효소(mechanoenzyme)에 의해 지배되는 지속적이고 균형 잡힌 핵분열과 융합 과정을 기반으로 하는 역동적인 형태를 가지고 있다. 융합은 망상망의 연결성과 형성을 증가시키는 반면, 핵분열은 미토콘드리아 단편화를 유발하고 미토파지에 의해 손상된 미토콘드리아를 제거할 수 있게 한다⁷. 미토콘드리아 형태는 조직 유형⁸ 및 발달 단계⁹에 따라 다르며, 세포가 에너지 요구(energetic needs)10,11 및 스트레스 요인^(stressor)12을 포함한 요인에 적응할 수 있도록 조절된다. 네트워크 형성 정도(상호 연결 대 단편화), 둘레, 면적, 부피, 길이(종횡비), 진원도 및 분지 정도와 같은 미토콘드리아의 표준 형태 측정 특징은 이러한 특징의 크기가 빛의 회절 한계(~200nm)보다 크기 때문에 표준 광학 현미경으로 측정하고 정량화할 수 있습니다¹³.

크리스타 아키텍처는 미토콘드리아의 내부 구조를 정의합니다(그림 1B). 크리스타 형태학의 다양성은 크게 편평형(lamellar 또는 discoidal) 또는 관형-소포형(tubular-vesicular¹⁴)으로 분류할 수 있다. 모든 크리스타는 ICS에서 IMS를 분리하고 CM(¹⁵)에서 IBM을 분리하는 역할을 할 수 있는 크리스타 접합(CJ)이라고 하는 관형 또는 슬롯형 구조를 통해 IBM에 부착됩니다. 크리스타 형태는 (1) CJ에 상주하고 IMM-OMM 접촉부 16을 안정화하는 미토콘드리아 접촉 부위 및 크리스타 조직 시스템(MICOS), (2) 크리스타 리모델링(^17,18,19)을 조절하는 시신경 위축 1(OPA1) GTPase, (3) 크리스타 팁(CT)에서 안정화 올리고머 어셈블리를 형성하는_{F1F O} ATP 합성효소를 포함하는 IMM의 주요 단백질 복합체에 의해 조절되며^{, 21}. 또한 IMM은 고도로 구부러진 IMM²²를 안정화하는 비이중층 인지질, 포스파티딜에탄올아민 및 카디올리핀이 풍부합니다. 크리스타는 또한 역동적이며, 다양한 조건하에서 형태학적 변화를 나타내는데, 예를 들어 상이한 신진대사 상태(23,24), 상이한 호흡기 기질(25), 기아 및 산화 스트레스(26,27), 세포사멸(apoptosis) ^28,29, 노화(³⁰) 하에서 나타난다. 최근에는 크리스타가 몇 초 단위의 시간 척도로 대대적인 리모델링 사건을 겪을 수 있다는 사실이 밝혀져 그 역동적인 성격을 강조하고 있다³¹. 개별 크리스타 내 구조물의 치수(예: CJ 너비, 크리스타 길이 및 너비) 및 개별 크리스타를 다른 구조물과 관련시키는 매개변수(예: OMM에 대한 크리스타 내 간격 및 크리스타 입사각)³²를 포함하여 크리스타의 여러 기능을 정량화할 수 있습니다. 이러한 정량화 가능한 크리스타 매개변수는 기능과 직접적인 상관 관계를 보여줍니다. 예를 들어, 미토콘드리아 ATP 생산의 정도는 크리스타 밀도 또는 다른 특징(예: OMM 면적당 크리스타)으로 정규화된 크리스타 수로 정량화된 크리스토의 풍부도와 양의 관련이 있습니다.^33,34,35. IMM 형태는 나노 크기의 특징에 의해 정의되기 때문에 미토콘드리아 초미세 구조로 구성되며, 이를 위해서는 광 회절 한계보다 더 큰 해상도를 제공하는 이미징 기술이 필요합니다. 이하에서 설명되는 바와 같이, 이러한 기술에는 전자 현미경 및 초고해상도 현미경(나노스코피)이 포함된다.

중추신경계(CNS)의 신경 세포와 신경교세포는 특히 미토콘드리아 기능에 의존합니다. 평균적으로 뇌는 전체 체중의 2%에 불과하지만 전체 체내 포도당의 25%를 이용하고 체내 산소 소비량의 20%를 차지하기 때문에 에너지 대사 장애에 취약하다³⁶. 알츠하이머병(AD), 근위축성 측삭 경화증(ALS), 헌팅턴병(HD), 다발성 경화증(MS) 및 파킨슨병(PD)을 포함한 진행성 신경퇴행성 질환(ND)은 이러한 질병의 분자적 토대를 이해하는 것부터 잠재적인 치료 예방 및 개입을 모색하는 것까지 다양한 연구 노력을 통해 현재까지 가장 광범위하게 연구된 병리학 중 일부입니다. ND는 미토콘드리아 전자 수송 사슬(ETC)³⁷에 의해 생성된 활성산소종(ROS)과 미토콘드리아 칼슘 처리(³⁸) 및 미토콘드리아 지질 대사⁽³⁹)의 변화로 인해 부분적으로 발생하는 산화 스트레스 증가와 관련이 있습니다. 이러한 생리학적 변화는 AD 40,41,42,43,44, ALS^45,46, HD^47,48,49, MS ⁵⁰ 및 PD ^51,52,53과 관련된 미토콘드리아 형태학의 현저한 결함을 동반합니다 . 이러한 구조적 및 기능적 결함은 복잡한 인과 관계로 결합될 수 있습니다. 예를 들어, 크리스타 형태가 OXPHOS 효소⁵⁴를 안정화시킨다는 점을 감안할 때, 미토콘드리아 ROS는 ETC에 의해 생성될 뿐만 아니라 ETC가 상주하는 인프라를 손상시키는 역할을 하여 산화 손상에 대한 감수성을 향상시키는 피드 포워드 ROS 회로를 촉진합니다. 또한, 크리스타 무질서는 미토콘드리아 DNA(mtDNA) 방출 및 자가면역, 대사 및 노화 관련 장애와 관련된 염증 경로와 같은 과정을 유발하는 것으로 나타났습니다⁵⁵. 따라서 미토콘드리아 구조 분석은 ND와 그 분자 토대를 완전히 이해하는 데 중요합니다.

투과 전자 현미경, 전자 단층 촬영 및 극저온 전자 단층 촬영(cryo-ET), X선 단층 촬영, 특히 극저온 소프트 X선 단층 촬영을 포함한 널리 사용되는 크리스타 관찰 방법은 중요한 발견을 밝혀냈으며 다양한 시료 유형(56,57,58,59,60)을 이용했다. 최근 소기관 미세구조를 더 잘 관찰할 수 있는 발전이 있었음에도 불구하고, 이러한 방법은 여전히 샘플 고정이 필요하기 때문에 크리스타의 실시간 역학을 직접 캡처할 수 없다는 주의 사항이 있습니다. 특히 구조화 조명 현미경(SIM), 확률적 광학 재구성 현미경(STORM), 광활성화 국소화 현미경(PALM), 팽창 현미경(ExM) 및 유도 방출 공핍(STED) 현미경 형태의 초고해상도 형광 현미경은 기존 광학 현미경 방법을 제한하는 회절 한계 미만의 해상도가 필요한 구조를 보는 데 널리 사용되는 방법이 되었습니다. ExM이 다른 초-분해능 기법과 함께 사용될 때, 결과는 인상적이지만, 샘플은 겔⁽⁶¹)에 고정되고 염색되어야 한다. 이에 비해 SIM, PALM/STORM 및 STED는 모두 라이브 샘플과 함께 성공적으로 사용되었으며, 일반적으로 IMM을 염색하는 새롭고 유망한 염료는 미토콘드리아 크리스타 역학 62,63,64,65,66의 라이브 이미징을 위한 새롭고 쉬운 접근 방식을 제공합니다. 최근 STED 이미징을 위한 생염료의 발전으로 염료의 밝기와 광안정성이 향상되었으며, 이러한 염료는 이전 염료보다 더 높은 특이성으로 IMM을 표적으로 합니다. 이러한 개발을 통해 초고해상도 이미징을 통한 장기 타임랩스 및 z-stack 실험을 수집할 수 있어 미토콘드리아 초미세 구조 및 역학에 대한 더 나은 라이브 셀 분석의 문을 열 수 있습니다.

여기에서는 STED⁶³을 사용하여 PKmito Orange(PKMO) 염료로 염색된 미분화 및 분화된 SH-SY5Y 세포의 라이브 셀 이미징을 위한 프로토콜이 제공됩니다. SH-SY5Y 세포주는 전이성 신경모세포종^67,68,69,70의 골수 생검에서 생성된 부모 세포주 SK-N-SH에서 3회 서브클로닝된 유도체입니다. 이 세포주는 ND 연구, 특히 미토콘드리아 기능 장애가 밀접하게 관련되어 있는 AD, HD 및 PD와 같은 질병에서 일반적으로 사용되는 시험관 내 모델입니다 10,43,71,72,73. 배양 배지 조작을 통해 SH-SY5Y 세포를 뉴런 유사 표현형을 가진 세포로 분화시키는 능력은 일차 신경 세포^10,74에 의존하지 않고 신경 과학 연구에 적합한 모델임이 입증되었습니다. 이 프로토콜에서는 SH-SY5Y 세포의 분화를 유도하기 위해 세포 배양 배지에 레티노산(RA)을 첨가했습니다. RA는 비타민 A 유도체이며 세포주기를 조절하고 신경 세포 분화를 조절하는 전사 인자의 발현을 촉진하는 것으로 나타났습니다⁷⁵. 쥐 해마에서 분리된 뉴런의 배양 및 생세포 이미징을 위한 프로토콜도 제공됩니다. 해마는 미토콘드리아 퇴화의 영향을 받는 것으로 나타났으며, 피질과 함께 노화와 ND 76,77,78,79,80에 중요한 역할을 한다.

1. SH-SY5Y 세포의 증식 및 분화

1. 세포 성장 및 유지를 위한 배지 준비
   1. 최종 1%(v/v) 항생제-항진균제(10,000 단위/mL 페니실린, 10,000 μg/mL 스트렙토마이신 및 25 μg/mL 암포테리신 B)와 다양한 양의 소 태아 혈청(FBS)을 보충한 완전한 고포도당 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM, 4.5g/L D-글루코스, 4mM L-글루타민, 110mg/L 피루브산 나트륨)을 준비합니다( 재료 표 참조). 분화 배지의 FBS 양은 최종 10%, 5% 또는 2%(v/v) FBS까지 다양합니다.
2. 세포 유지 관리
   1. 10 % (v / v) FBS가 보충 된 DMEM의 세포를 유지하고 37 ° C 및 5 % CO₂ 에 배치 한 다음 분화를 위해 5 % (v / v) FBS를 포함하는 DMEM에 시드합니다. 냉동 세포 스톡은 1-2 x 10⁷ cells/mL에서 10%(v/v) 디메틸 설폭사이드(DMSO)와 함께 FBS에 보관했습니다.
3. 레티노산(RA)의 제조
   1. 7.51 mg의 all-trans-RA (재료 표 참조)를 5 mL의 갓 준비된 95 % 에탄올에 용해시켜 5 mM 원액을 얻는다. 에탄올에서 5μM의 원액을 희석하여 제조업체의 프로토콜⁸¹의 제품 정보 시트에서 얻은 350nm(ɛ = 44,300M-1cm-1)에서 흡광도로 농도를 확인합니다. 4°C에서 빛으로부터 보호된 5mM 스톡을 최대 6주 동안 보관하십시오.
4. 커버슬립 코팅을 위한 폴리-D-라이신의 제조
   참고: 공급업체 사이트⁸²의 문서 및 다운로드 섹션에 있는 폴리-D-라이신(PDL) 제품 프로토콜은 다양한 배양 용기 코팅에 대한 정보를 제공합니다.
   1. 이 프로토콜에는 멸균 #1.5 붕규산 커버글라스 바닥이 있는 웰당 면적이 4cm 2인² 웰 챔버 용기를 기반으로 하는 부피가 포함됩니다( 재료 표 참조). PDL의 원액을 Dulbecco의 PBS(DPBS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음)로 50μg/mL로 2배로 희석합니다.
      참고: #1.5 또는 #1.5H 커버글라스는 모두 허용되는 두께이며 이미지 품질에 필수적입니다. 다른 두께는 구면 수차를 유발하므로 피해야 합니다.
5. PDL을 사용한 커버슬립 코팅
   알림: 커버슬립은 추가 살균을 위해 생물 안전 캐비닛에서 10-15분 동안 자외선(UV)에 노출될 수 있습니다.
   1. 세포 배양 캐비닛에 있는 멸균 챔버 커버슬립의 각 웰에 50μg/mL PDL 용액 1.2mL를 바르고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. PDL 용액을 제거하고 3.6mL 증류수로 세 번 헹굽니다. 최종 세척을 완료한 후 코팅된 챔버를 공기에 노출된 2시간 동안 건조시킨 후 헹구고 즉시 사용하거나 밀폐 용기와 함께 4°C에서 최대 2주 동안 보관합니다.
      알림: 과도한 PDL은 세포에 유독할 수 있으므로 커버슬립을 철저히 헹굽니다.
6. RA를 이용한 SH-SY5Y 세포의 분화
   알림: 통로 15 이상의 셀은 사용하지 마십시오. 세포는 80%-90% 밀도로 통과됩니다. 차별화 절차는 다르지만 유사한 단계를 따릅니다. 신경모세포종에서 성숙한 뉴런으로의 추가적인 분화는 뇌 유래 신경영양인자(BDNF)68,83,84,85를 사용한 추가 처리로 얻어지지만^, 이 프로토콜에서는 수행되지 않았다.
   선택 사항: 커버글라스에 파종하기 전에 최소 24시간 동안 세포를 확립합니다. 냉동 스톡에서 세포를 준비하려면 1mL의 냉동 바이알을 빠르게 해동하고 10% FBS가 보충된 9mL의 예열 배지에 첨가한 다음 350 x g 에서 10분 동안 스핀 다운(실온에서)하고 상층액을 폐기하여 DMSO를 제거합니다. 세포 펠릿을 5mL의 예열된 배지에 재현탁시키고 T-25 플라스크에 시드 세포를 재현탁시킵니다. 세포가 80%-90% 밀도에 도달하면 세포를 계수하고 해당되는 경우 분화를 위해 파종하여 세포를 통과시킵니다.
   1. 0일차: 세포를 종자합니다.
      1. 냉동 스톡이나 작동하는 플라스크에서 챔버가 있는 커버글라스에 세포를 심습니다. 1.5 x 10⁴ cells/^cm2의 파종 밀도를 사용합니다.
         참고: 배양 면적이^4cm2 인 표준 2웰 챔버 커버글라스의 단일 웰에는 6.0 x 10⁴ 세포가 필요합니다. 분화되지 않은 상태로 남아 있는 세포는 10%(v/v) FBS가 보충된 DMEM으로 파종해야 하며, 분화될 세포는 5%(v/v) FBS가 보충된 DMEM으로 파종해야 합니다.
   2. 1일차: RA 분화 치료를 시작합니다.
      1. 5%(v/v) FBS, 1%(v/v) 항생제-항진균제 및 동일한 첨가제 부피의 10μM RA 또는 에탄올의 최종 농도가 보충된 DMEM을 준비하여 이 분화 절차를 위한 차량 제어 역할을 합니다. 파종에 사용된 챔버 커버글라스의 배지를 제거하고 1x PBS로 헹구고 새 DMEM을 웰에 추가합니다.
   3. 3일차: 배지를 새로운 RA 또는 에탄올 함유 배지로 교체합니다.
      1. 1일차부터 배지를 제거하고 2%(v/v) FBS, 1%(v/v) 항생제-항진균제, 동일한 첨가제 부피의 10μM RA 또는 95% 에탄올이 보충된 새 배지로 교체하여 이 분화 절차를 위한 차량 제어 역할을 합니다. 파종에 사용된 챔버 커버글라스에서 배지를 제거하고 1x PBS로 헹구고 웰에 새 배지를 추가합니다.
   4. 6일차: 세포 이미징을 수행합니다.
      주의: 세포 분화 시간은 프로토콜에 따라 다르지만, RA에 6일 동안 노출되는 것만으로도 SH-SY5Y 세포(⁸⁶)에서 뉴런-유사 표현형을 유도하기에 충분하다.
      1. 섹션 3과 4의 세부 사항에 따라 실시간 이미징을 수행합니다(그림 2).

2. 1차 쥐 해마 뉴런 배양

1. 쥐 해마 뉴런 분리를 위한 재료 준비.
   1. 신선한 보충 DMEM을 준비합니다.
      1. 10%(v/v) 열 비활성화 FBS, 1%(v/v) 피루브산 나트륨 용액 및 1%(v/v) 페니실린-스트렙토마이신(10,000U/mL)이 보충된 DMEM(고포도당, 피루브산나트륨 없음)의 혼합물을 필터 멸균합니다. 4 °C에서 최대 2주 동안 보관하십시오.
   2. 신선하게 보충된 뉴런 성장 배지를 준비합니다.
      1. 2%(v/v) B27 보충제, 0.25%(v/v) 글루타민 보충제 및 1%(v/v) 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 뉴런 성장 배지의 혼합물을 필터 멸균합니다( 재료 표 참조). 4 °C에서 최대 2주 동안 보관하십시오.
2. 1차 해마 뉴런 배양을 준비합니다.
   1. 이전에 발표된 작업⁽⁸⁷ )에 이어 그리고 해부된 E18 쥐 해마(⁸⁸ )를 수득한 제조업체 현장의 제품 프로토콜로부터 1차 해마 뉴런 배양을 준비한다( 자료표 참조). 이 프로토콜은 <2%의 성상교세포(astrocyte)를 가진 대부분 신경 세포 집단을 생성합니다.
      참고: 이 조직과 함께 배송되는 최대 절전 배지는 이 프로토콜의 향후 단계에 사용됩니다. 버리지 마십시오.
   2. 조직 해리를 위한 재료와 매체를 준비합니다.
      1. 파스퇴르 피펫에 화염을 붙여 조리개 직경을 줄이고 호일에 보관하여 사용할 때까지 오염을 방지합니다. 준비된 DMEM, 1X Hank's Buffered Salt Solution(HBSS) 및 뉴런 성장 배지를 37°C로 예열합니다. 멸균 핀셋으로 DNAase 플레이크 2개를 15mL 원뿔형 튜브에 추가합니다.
   3. 조직 해리를 수행합니다.
      1. DNAase가 들어 있는 15mL 원뿔형 튜브에 조직을 넣고 37°C에서 잠시 배양하기 전에 절개된 E18 쥐 해마가 보관되어 있는 동면 배지를 가능한 한 많이 제거합니다. 900μL의 1X HBSS를 추가한 다음 100μL의 0.5% 트립신을 추가합니다. 조직을 37°C에서 15분 동안 배양합니다.
         참고: PDL 코팅 플레이트는 보관에서 꺼내 이 배양 시간 동안 사용할 때까지 인큐베이터에 넣을 수 있습니다.
   4. 조직 균질화 및 세포 계수를 수행합니다.
      1. 트립신으로 배양한 후 배지를 제거하고 이전 단계에서 예열된 동면 배지-DNAase 1mL를 조직에 추가하고 파스퇴르 피펫으로 균질화합니다. 미디어는 불투명하게 보였다가 균질화가 계속됨에 따라 점차 투명해집니다.
      2. 해리된 뉴런을 4mL의 예열된 DMEM이 있는 새 튜브에 추가한 다음 세포 계수기를 사용하여 세포를 계수합니다.
   5. 세포 도금 및 일차 세포의 성장을 수행합니다.
      1. DMEM에서 약 1.65 x 10⁴ cells/cm² 밀도의 플레이트 셀. 2웰 챔버 커버글라스(4 cm²)의 경우, 웰당 65,000 – 70,000개의 세포를 2 mL DMEM으로 시드합니다. 37°C 및 5%_CO2 에서 2시간 동안 세포를 배양한 후 부착 여부를 확인합니다. 세포가 부착되기 시작하면 1mL의 배지를 제거하고 동일한 용량의 동면 배지로 교체한 다음 부드럽게 교반하여 혼합합니다. 배지가 혼합되면 이 과정을 반복하고 존재하는 배지의 절반을 제거하고 동일한 부피의 뉴런 성장 배지로 교체한 다음 부드럽게 혼합합니다.
         참고: 도금일은 시험관 내 일(DIV) 0으로 간주되며 세포는 DIV 7에서 이미징할 준비가 된 것입니다(그림 2).

3. 살아있는 세포 이미징을 위한 세포 준비

참고: 세포 유형 및 기원(즉, 배양 및 일차 세포)은 염색 요구 사항이 다를 수 있습니다. 자세한 내용은 게시된 보고서^62,63을 참조하십시오.

1. PKmito 오렌지의 준비
   참고: 일반적으로 IMM을 염색하는 다른 염료는^64,65,66으로 보고되었으며 상업적으로 이용 가능합니다. PKMO는 이 프로토콜에서 사용되는 유일한 프로토콜입니다.
   1. 제조업체의 지침⁸⁹에 따라 DMSO에 분말 PKMO(재료 표 참조)를 재현탁합니다. 세포에서 배지를 흡인하고 미리 따뜻해진 페놀-레드 유리 배지로 세척합니다. 제조업체의 지침에 따라 세포를 염색하기 전에 분화 상태에 따라 2%(v/v) FBS 또는 10%(v/v)가 보충된 예열된 페놀 레드-프리 DMEM, 최종 농도 20mM의 HEPES 및 1%(v/v) 항생제-항진균제가 보충된 PKMO 스톡을 준비합니다. PKMO가 없는 이 제형은 살아있는 세포 이미징 배지입니다.
2. PKMO를 이용한 세포 염색
   1. 염료를 사용하여 37 ° C 및 5 % CO₂ 에서 30 분 동안 세포를 배양합니다. 살아있는 세포 이미징 배지로 세포를 세 번 세척하고 최종 세척을 위해 37 ° C, 5 % CO₂에서 30 분 동안 배양합니다.
   2. 신선하고 미리 따뜻해진 살아있는 세포 이미징 배지를 추가합니다. 이제 세포를 이미징할 준비가 되었습니다.
      참고: 급성 치료(예: 약물 및/또는 스트레스 요인)를 사용하는 경우 실시간 이미징 전에 추가됩니다. 토론 섹션과 보충 그림 1을 참조하십시오.

4. STED 현미경 검사로 살아있는 세포 이미징

참고: 이 프로토콜은 도립 현미경을 중심으로 구축된 STED 시스템을 사용하며 시스템은 재료 표에 지정되어 있습니다. 이 시스템에는 펄스 여기 레이저(공칭 출력 ~561μW의 300nm 레이저)와 펄스 775nm STED 공핍 레이저(공칭 출력 1.2W), 연속 조정 가능한 갈바노 스캐너 및 615/20nm 필터 기반 애벌랜치 포토다이오드 검출기(APD)가 장착되어 있습니다. 여기에는 STED용 100x/1.40 오일 이멀젼 렌즈가 사용됩니다. 라이트박스 소프트웨어는 이미지 획득에 사용됩니다. 제공된 모든 세부 정보는 이 소프트웨어 및 시스템 설정과 직접 관련이 있습니다.

1. 이미징에 대한 일반 지침 및 단계
   1. 세포 생존력을 유지하기 위해 스테이지 탑 인큐베이터 또는 환경 챔버를 사용하지만 단기간의 실온 실험도 허용됩니다. 이러한 단계는 위에서 설명한 STED 설정에만 해당됩니다.
   2. 이미징을 위한 레이저 및 필터 세트를 선택합니다.
      1. 염료 목록에서 염색에 사용된 염료 또는 사용된 염료에 가장 가까운 스펙트럼 특성을 가진 염료를 선택하여 주황색 염료에 대한 매개변수를 사용합니다. 두 번 클릭하거나 샘플 목록으로 드래그하여 활성화하면 "Drag dye(s) here"라고 표시됩니다.
   3. 이미지화할 영역을 선택합니다.
      1. 개요에서 직사각형 ROI 버튼을 선택하고 클릭하고 드래그하여 영역을 형성하여 관심 미토콘드리아 주위에 관심 영역( ROI )을 만듭니다. ROI는 ROI 모서리 또는 모서리 위에 마우스를 올려 놓는 동안 나타나는 곡선 모서리를 사용하여 크기를 조정하고 회전할 수 있습니다.
         참고: 제안된 이미징 매개변수의 요약은 표 1에서 찾을 수 있습니다. 이들 파라미터는 이 STED 셋업 및 염료 조합(⁶³)에 대해 이전에 보고된 파라미터들을 사용하여 경험적으로 조정되었다.
   4. 게이팅을 설정합니다.
      1. General(일반) 메뉴 옆에서 Gating(게이팅) 메뉴를 선택하거나 길게 클릭하여 뷰에 메뉴를 추가합니다. 여기에 제시된 대로 STED 검출기 게이팅을 1-1.05에서 7.8-7.85ns로 조정하는 것이 좋습니다. 게이팅 시간은 다양하며 1-1.05에서 7-7.05ns까지 짧을 수 있습니다.
   5. 샘플에 따라 강도를 적절하게 조정하십시오.
      참고: 일반적으로 STED에 사용되는 여기 전력은 컨포칼에 사용되는 전력의 2-3배이므로 컨포칼에 5% 여기 레이저 출력이 필요한 샘플은 STED 획득 중에 10%-15% 여기 레이저 출력을 사용할 수 있습니다.
      1. STED용 여기 레이저를 15%-20%로 설정하고 STED 공핍 레이저를 20%-25%로 설정합니다. 픽셀 크기가 20-25nm인 4μs의 픽셀 체류 시간을 사용합니다. 핀홀은 배양된 세포의 경우 1.0AU, 1차 쥐 해마 세포의 경우 0.7AU로 유지하여 더 조밀하게 밀집된 미토콘드리아의 광학 절편을 개선했습니다.
         참고: 공초점 및 STED 이미지는 나란히 비교하기 위해 모두 획득하거나(그림 3A, B, 그림 4A) STED만 획득할 수 있습니다.
2. 시계열/z 계열에 대한 추가 정보
   1. 시계열을 선택합니다.
      1. 시간 드롭다운 메뉴를 선택합니다. 타임랩스에 대해 원하는 반복 횟수(여기서는 5회 사용)와 시간 간격(여기서는 25초 또는 30초 사용)을 정의합니다(그림 3C, D, 그림 4B).
         참고: 간격이 획득 시간보다 짧으면 반복이 지연 없이 계속됩니다. 타임랩스를 수행할 때 잠재적인 드리프트를 방지하기 위해 완벽한 초점 장치 또는 유사한 초점 추적을 사용하는 것이 좋습니다.
   2. 볼륨 범위를 설정합니다.
      1. Volume 옵션을 활성화하고 범위의 양쪽 끝을 조정하여 z-볼륨 범위를 원하는 대로 설정합니다. 2D 이미징을 위해 이 프로토콜에 사용된 단계 크기는 150-200nm였습니다. 원시 STED의 디콘볼루션에 필요한 나이퀴스트 샘플링에 대한 권장 스텝 크기는 온라인 도구(⁹⁰)로 계산될 수 있다.
         알림: STED 공핍 레이저 출력과 이미징된 평면 수는 염료 광표백 및 세포에 대한 빛 노출을 유해한 수준으로 증가시킬 수 있습니다. 획득 후 광독성 및 광손상의 징후를 확인하십시오.

5. 미토콘드리아 초세구조를 위한 처리 및 분석 도구

참고: 이미지 처리(즉, 디콘볼루션)는 선택 사항이지만 일반적으로 게시를 위해 STED 이미지를 만들고 분석할 때 사용됩니다. 콘트라스트를 개선하고 노이즈를 줄이기 위한 디콘볼루션은 아래에 설명된 대로 개별 크리스타의 최적 분할을 위해 매우 권장됩니다(그림 2).

1. STED 이미지 디콘볼루션
   참고: 이 프로토콜에서 디콘볼루션에 사용되는 소프트웨어는 재료 표에 나와 있습니다.
   1. 이미지의 미세한 매개변수를 설정합니다.
      알림: 현미경 메타데이터가 이미지 현미경 매개변수에 올바르게 입력되었는지 확인하십시오. 여기에는 매체 굴절률 장착이 포함됩니다. 침지 매체; 픽셀 크기; 여기(excitation), 방출(emission), 공핍(depletion) 파장; 및 기타 관련 정보. 이러한 매개변수가 있는 템플릿은 재사용을 위해 저장할 수 있습니다.
   2. 소프트웨어 알고리즘을 사용하여 원시 STED 이미지를 디콘볼루션합니다.
      1. 디콘볼루션 소프트웨어의 자동화된 디콘볼루션 알고리즘에 액세스하면 수동 디콘볼루션 이미지 처리가 가능합니다. 익스프레스( Express ) 버튼을 선택하고 디콘볼루션 타입(deconvolution type)을 고속(Fast), 표준(Standard), 적극적(Aggressive) 또는 보수적(Conservative)으로 설정하여 다양한 수준의 디콘볼루션 파워를 제공합니다. Aggressive 설정으로 Express Deconvolution을 사용한 대표적인 이미지가 나와 있습니다(그림 3, 그림 4 및 그림 5).
      2. 디콘볼루션 소프트웨어의 이미지를 ICS2 형식으로 저장합니다.
   3. 수동 디콘볼루션의 경우 다음 단계를 수행합니다.
      1. 간단히 말해서, 수동 디콘볼루션을 수행할 때 일관성을 위해 디콘볼루션 마법사 템플릿을 저장하고 마법사를 시작할 때 템플릿을 로드할 수 있는 옵션이 있습니다. 수집 설정 및 파라미터로 생성된 경우 측정점 확산 함수(PSF) 정보를 사용합니다.
      2. 필요한 경우 디콘볼루션 소프트웨어가 이미지를 자동으로 안정화하도록 하기 전에 원시 STED 이미지를 자릅니다. 디콘볼루션(deconvolution) 소프트웨어 패키지에 대한 애드온을 사용하면 열 드리프트 및 색수차와 같은 가능한 이미징 아티팩트를 구체적으로 보정할 수 있습니다.
      3. 다음으로, 로그 히스토그램을 생성하여 배경 빼기를 수동 또는 자동으로 수행합니다. 기존의 최대가능도 추정(CMLE) 디콘볼루션 알고리즘을 선택합니다.
         참고: 디콘볼루션의 경우 조정해야 할 주요 값은 신호 대 잡음비 임계값, 반복 횟수 및 품질 임계값입니다. 이러한 값을 조정할 수 있으며 디콘볼루션을 미리 보고 최적의 설정을 결정할 수 있습니다.
2. 분할 및 입자 분석
   참고: 이 프로토콜은 오픈 소스 소프트웨어인 FIJI(Is Just ImageJ)를 사용합니다( 재료 표), 세분화 및 분석을 위해. 이러한 목적으로 CellProfiler, Icy, Ilastik 및 QuPath를 포함한 다른 유사한 소프트웨어를 사용할 수 있습니다.
   1. 분할을 위해 이미지를 준비합니다.
      1. 파일 → 열기로 이동하거나 파일을 클릭하여 ImageJ 도구 모음으로 끌어 디콘볼루션 소프트웨어에서 .obf 원시 STED 이미지 또는 .ics2 파일을 엽니다. 여기에서 이미지를 더 쉽게 분할할 수 있도록 하는 모든 처리를 분할 전에 수행할 수 있습니다.
      2. 변경 사항을 일관되게 유지하려면 플러그인 → 매크로 → 레코드 를 사용하여 함수를 기록하고 플러그인 → 새 → 매크로에서 키 명령을 복사하여 새 매크로 에 붙여넣습니다. 매크로를 실행하기 전에 처리할 이미지를 선택해야 합니다.
         참고: 크기 및 모양의 정량화에 대해 일반적으로 허용되는 변경에는 자르기, z-스택 투영 및 스무딩이 비활성화된 배경 빼기가 포함됩니다. 변경은 데이터 세트 내의 이미지 간에 일관되게 수행되고 보고되어야 합니다.
   2. 훈련 가능한 Weka 분할 설정 조정하기
      참고: 미토콘드리아에 대한 반자동 분할 도구 및 다운스트림 분석 사용에 대한 단계별 지침이 포함된 추가 세부 정보가⁹¹에 게시되었습니다.
      1. Plugins → Segmentation → Trainable Weka Segmentation 아래에 있는 Trainable Weka Segmentation(TWS)⁹² 플러그인에서 디컨벌루션된 STED 이미지를 엽니다. 분할 설정에서 가우시안 블러, 멤브레인 투영 및 소벨 필터 기능을 선택합니다. 멤브레인 두께 기본값은 1이고 멤브레인 패치 크기 기본값은 19입니다.
      2. 클래스 1 또는 2를 "Cristae"로 표시하고 다른 클래스를 "Background"로 레이블을 지정합니다(그림 2). Save classifier 버튼을 사용하여 모델을 저장할 수도 있습니다. 부하 분류자를 선택하여 다른 이미지에 이러한 설정을 다시 사용합니다.
   3. TWS 클래스 추적을 수행하십시오.
      1. 선 도구 또는 다른 모양을 사용하여 크리스타 또는 배경의 일부를 강조 표시합니다. 적어도 일부 배경 선택에는 크리스타 사이에 공백이 포함되어야 합니다. 구조물 위에 선을 그려 두 클래스 중 하나에 할당한 다음, 크리스타 또는 배경에 대해 오른쪽에 있는 추가 버튼을 선택합니다. 추적을 두 번 클릭하여 해당 레이블에서 구조를 제거합니다.
   4. TWS 분류 훈련을 수행하십시오.
      1. 왼쪽에 있는 분류자 학습 단추를 선택하여 플러그인에 제공된 정보를 기반으로 맵을 생성합니다. 세그먼트화된 클래스의 오버레이는 오버레이 토글 버튼으로 켜고 끌 수 있으며, 오버레이의 불투명도는 설정에서 조정할 수 있습니다. 분류자는 추가 레이블을 사용하여 다시 학습할 수 있습니다. 만족스러우면 확률 얻기 버튼을 선택합니다.
   5. 입자를 측정합니다.
      1. 크리스타 확률 맵을 사용하여 이미지를 임계값으로 설정하여 마스크를 생성한 다음 분석 → 입자 분석으로 이동합니다 . 일반적으로 기본 임계값 유형을 사용할 수 있으며 전체 크리스타가 고려되도록 범위를 조정할 수 있습니다. 입자 분석을 통해 제공되는 측정값은 분석 → 측정 설정을 통해 조정할 수 있습니다.
         알림: 전amp크리스타의 면적, 둘레, 원형도 및 종횡비와 같은 크기 및 모양 매개변수의 파일은 선택한 측정값을 기반으로 측정 및 표시됩니다(그림 2, 그림 5A, 보충 표 1).
      2. 선택 사항: 디콘볼루션 이미지와 동일한 차원의 원시 STED 이미지를 선택하고 관리자의 ROI를 적용한 다음 ROI 관리자에서 측정 을 선택하여 강도 값을 얻습니다.
   6. 선 플롯을 구합니다.
      1. 라인 플롯은 디컨볼루션된 STED 이미지로부터 생성되었습니다. 다점 선을 그리고, 노이즈를 평균화하기 위해 선 두께를 몇 픽셀 너비로 조정하고, 미토콘드리아에 맞게 선을 스플라인합니다(그림 2, 그림 5B). 생성된 결과 선 플롯은 특정 범위에서 크리스타의 주기성과 분포를 보고하기 위해 피크 대 피크 거리를 측정하는 데 사용됩니다.
         참고: 이와 관련하여, 크리스타 밀도는 미토콘드리아의 바깥 부분을 측정하여 결정된 주어진 영역 내의 독립적인 크리스타 수로 보고될 수 있습니다. 미토콘드리아 영역은 마스크를 생성하기 위해 디컨볼루션 또는 원시 STED 이미지에 필터를 적용하여 결정할 수 있습니다. 면적을 측정하기 전에 마스크가 미토콘드리아의 윤곽에 정확하게 맞는지 확인하십시오.

이 프로토콜은 살아있는 세포 STED 이미징 및 미토콘드리아 크리스타의 후속 분석에 중점을 두고 배양 및 일차 세포의 세포 성장 조건을 설명합니다. 미분화 SH-SY5Y(그림 3A) 및 RA 분화 SH-SY5Y(그림 3B) 세포의 미토콘드리아의 ImageJ로 투영한 것은 기존 컨포칼 및 STED를 사용하여 z-스택으로 수집할 수 있으며, 원시 STED 이미지를 디컨볼루션할 수 있습니다. 타임랩스 이미징을 수행한 후 디컨볼루션할 수도 있습니다(그림 3C,D). 1차 쥐 해마 뉴런에 대해 약간 다른 이미징 파라미터를 사용하여(표 1), 컨포칼 및 원시 STED 이미지를 z-스택으로 획득할 수 있으며, 원시 STED 이미지를 디콘볼루션할 수 있습니다(그림 4A). 1차 뉴런에서 미토콘드리아의 타임랩스 이미징도 가능합니다(그림 4B). 일반적으로 타임랩스 이미지는 미토콘드리아 동적 이벤트를 보여줄 수 있어야 합니다.

분할에 사용된 샘플의 원시 STED 및 디콘볼루션된 STED z-stack 투영이 일관되게 나타나면 정량적 측정이 수행됩니다. TWS 플러그인은 디컨볼루션된 STED 이미지를 사용하여 확률 마스크를 만들기 위해 분할한 다음 크리스타의 이진 마스크를 만들어 크기 및 모양 매개변수를 얻습니다(그림 5A). 이 마스크의 영역은 ROI 관리자에 저장되며 원하는 경우 원시 STED 이미지에 적용하여 상대 강도의 차이를 측정할 수 있습니다. 디컨볼루션된 STED 투영은 주어진 영역의 크리스타 주기성과 밀도를 결정하는 데에도 사용할 수 있습니다(그림 5B).

그림 1: 미토콘드리아 형태. 미토콘드리아는 서로 다른 하위 구획(A)을 정의하는 2개의 막 시스템을 가지고 있습니다. 크리스타는 특징이 정의된 내막의 안쪽에 있습니다(B). 약어: OMM, 외부 미토콘드리아 막; ICS, 내 공간; IMS, 막간 공간; CM, 크리스타 막; IBM, 내부 경계막; IMM, 내부 미토콘드리아 막; CT, 크리스타 팁; CJ, 크리스타 정션. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 워크플로우 개략도. SH-SY5Y 세포 또는 일차 쥐 해마 뉴런은 PDL 코팅 커버글라스에서 성장합니다. SH-SY5Y 세포는 6일 동안 미분화 상태를 유지하거나 RA 분화를 거치기 위해 병렬로 성장합니다. 1차 쥐의 해마 뉴런은 7일 동안 해마 절편에서 분리한 후 PDL 코팅된 커버글라스에서 성장시켰다. 이미징할 준비가 되면 세포를 PKMO로 염색하고 STED로 이미징했습니다. 그런 다음 원시 STED 이미지를 디컨볼루션하고 디컨볼루션된 이미지를 FIJI에서 처리하여 크리스타 밀도, 면적, 둘레, 원형도 및 종횡비와 같은 크기 및 모양 측정값을 얻습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: SH-SY5Y 세포의 미토콘드리아 이미징. PKMO 염색이 적용된 비분화(A) 및 RA 분화(B) SH-SY5Y 세포의 미토콘드리아의 대표적인 공초점(왼쪽), 원시 STED(가운데) 및 Huygens 디콘볼루션 STED 이미지 z-stack 투영(오른쪽)을 보여줍니다. 30초 간격과 RA 분화된 SH-SY5Y 세포의 5회 반복이 있는 타임랩스가 (C) 보간 없이 해당 영역의 배율 조정된 이미지를 사용하여 (D) 확장된 선택된 영역(흰색 상자)과 함께 표시됩니다. 눈금 막대: A,B, 250 nm; C,D, 1 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 1차 쥐 해마 뉴런의 미토콘드리아 이미징. 대표 공초점(왼쪽), 원시 STED(가운데) 및 Huygens 디콘볼루션 STED(오른쪽) 이미지는 1차 쥐 해마 뉴런에서 미토콘드리아의 z-스택 투영을 보여줍니다(A). 이 뉴런에서 25초 간격과 미토콘드리아의 5회 반복이 있는 타임랩스가 표시됩니다(B). 눈금 막대: A, 250 nm; B, 1 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: ImageJ에서 디콘볼루션된 STED 이미지 처리. 크리스타 크기와 모양을 측정하기 위한 Trainable Weka Segmentation 플러그인의 대표적인 사용이 나와 있습니다(A). 왼쪽에서 오른쪽으로 디컨볼루션된 STED 이미지, TWS 플러그인의 분할을 기반으로 한 확률 맵, 확률 맵을 입력으로 사용하는 FIJI의 임계값 마스크, ROI가 윤곽선으로 표시된 마스크, 원래 디컨볼루션된 STED 이미지에 오버레이된 ROI가 표시됩니다. 이러한 물체에 해당하는 결과 면적, 둘레, 원형도 및 종횡비 측정은 보충 표 1에서 찾을 수 있습니다. 크리스타 밀도에 대한 판독값으로 피크 대 피크 거리를 측정하기 위해 디컨볼루션된 STED 이미지를 사용하는 선 플롯이 표시됩니다(B). 스케일 바: 0.5 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: STED 획득 매개변수 요약. 세포 유형별 2D STED 이미징에 사용되는 설정, 미분화 SH-SY5Y, RA 분화 SH-SY5Y, 1차 쥐 해마 뉴런이 표시됩니다. 모든 타임랩스에 대해 ROI 크기에 따라 다양한 간격으로 5회 반복했습니다.

보충 그림 1: 아밀로이드-β(Aβ)가 추가된 SH-SY5Y 세포의 이미징. PKMO 염색(위) 및 Aβ-HiLyte647(아래)이 있는 RA 분화 SH-SY5Y 세포의 대표 공초점(왼쪽), 원시 STED(가운데) 및 디콘볼루션된 STED(오른쪽) 이미지(A)를 보여줍니다. 원시 PKMO STED(녹색)와 원시 Aβ STED(자홍색)(B) 또는 디컨볼루션된 PKMO STED(녹색)와 디컨볼루션된 Aβ STED(자홍색)(C)의 병합된 z-스택 투영이 표시됩니다. 스케일 바: 0.5 μm. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 1: 분할된 크리스타의 크기 및 모양 측정. 분할된 미토콘드리아에서 그림 5A에 요약된 물체에 해당하는 면적(μm2), 둘레(μm), 원형도 및 종횡비의 크기 및 모양 측정값이 표시됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 2: 아밀로이드 β 샘플을 사용한 획득 파라미터 요약. 미분화 및 RA 분화 SH-SY5Y 세포에서 PKMO 및 Aβ-HiLyte647의 2D STED 이미징에 사용되는 설정이 표시됩니다. Aβ-HiLyte647의 공초점은 분해할 특정 구조가 없기 때문에 단독으로 사용할 수 있습니다. 더 작은 입자 크기에 대해 Aβ-HiLyte647의 STED 이미지가 여기에 나와 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 1: 아밀로이드 β 치료 프로토콜. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

저자는 공개할 것이 없습니다.