방법 논문

LC-TIMS-TOF MS/MS를 사용한 펜타닐 아날로그 스크리닝

DOI:

10.3791/65562

⸱

2024년 11월 8일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, Florida International University, 2Bruker Daltonics Inc., 3Miami-Dade County Medical Examiner Department, 4Biomolecular Sciences Institute, Florida International University

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

펜타닐 유사체의 머무름 시간, 이동성 및 질량 분석 단편화 패턴을 기반으로 하는 스크리닝 방법.

초록

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최근 수십 년 동안 펜타닐의 사용과 펜타닐 유사체의 출현은 지역 사회 전반에 대한 우려가 커지고 있습니다. 펜타닐과 그 유사체는 미국에서 치명적이거나 치명적이지 않은 과다 복용의 주요 원인입니다. 가장 최근의 펜타닐 관련 과다 복용 사례는 불법적으로 제조된 펜타닐 및 이와 관련된 극단적인 효능과 관련이 있습니다. 본 연구에서는 펜타닐 유사체 스크리닝을 위한 고처리량 분석 프로토콜에 대해 설명합니다. 상보적 액체 크로마토그래피, 트랩 이온 이동성 분광법 및 탠덤 질량 분석법을 사용하면 단일 스캔으로 단일 샘플에서 수백 개의 펜타닐 유사체를 분리하고 할당할 수 있습니다. 설명된 접근 방식은 모빌리티 트랩에서 병렬 축적을 사용한 후 충돌 유도 해리를 사용한 순차적 단편화를 사용하여 데이터 종속 수집 및 데이터 독립 수집의 최근 개발을 활용합니다. 펜타닐 유사체는 머무름 시간, 이동성 및 MS 단편화 패턴에 따라 자신 있게 할당됩니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

펜타닐과 그 유사체는 미국에서 치명적이거나 치명적이지 않은 과다 복용의 주요 원인입니다 1,2. 미국 질병통제예방센터(CDC)는 2013년부터 2021년까지 합성 오피오이드 관련 과다 복용 사망자 수가 25만8000명을 넘어섰다고 보고했다. 2021년 한 해에만 68,000명 이상의 과다 복용 사망자가 합성 오피오이드로 인한 것으로 추정되며, 이는 미국 내 모든 오피오이드 과다 복용 관련 사망자의 82%에 해당합니다3. 2013년 이래로 수백 개의 펜타닐 유사체가 확인되었으며, 그 효능은 다양하다4. 불법적으로 제조된 펜타닐 유사체의 출현으로 Schedule II 합성 오피오이드 자체는 미국에서 사용 가능한 가장 인기 있는 합성 오피오이드로 남아 있습니다3. CFSRE(Center for Forensic Science Research and Education)에 따르면 2022년에 가장 많이 보고된 펜타닐 유사체는 플루오로펜타닐이었으며, 현재 비펜타닐 관련 합성 오피오이드가 빠른 속도로 휘발성 의약품 시장 공급에 도입되고 있습니다5.

마약 시장에서 유통되는 펜타닐 및 펜타닐 관련 유사체의 압도적인 양으로 인해 DEA는 마약 압수를 기원으로 되돌리기 위해 이러한 화합물을 합성하는 데 사용되는 방법론을 추적하기 위해 Operation Death Dragon이라는 펜타닐 서명 프로파일링 프로그램을 시행했습니다6. 2018년 압수된 약물 발작의 94%는 얀센 방법으로 합성된 것으로 확인되었고, 나머지 6%는 지그프리드 방법6으로 합성되었습니다. 두 방법의 주요 차이점은 Janssen 분석법에서 불순물로 검출된 펜타닐 유사체인 벤질 펜타닐의 존재와 펜타닐의 대사체/전구체인 데스프로피오닐 펜타닐(4-ANPP)의 존재는 Siegfried 분석법7로 합성할 때 검출된 불순물입니다.

합성 오피오이드의 표적 스크리닝 및 정량화를 위해 질량 분석법(각각 GC-MS 및 LC-MS)과 함께 가스 및 액체 크로마토그래피를 사용하는 것은 독성학 실험실에서 정기적으로 구현됩니다. GC-MS는 생물학적 표본에서 남용 약물 검출을 위한 황금 표준으로 간주되어 왔습니다. 공개적으로 사용 가능한 질량 스펙트럼 라이브러리8 및 플러그 앤 플레이 시스템9으로 판매되는 기기에 대한 액세스는 GC-MS가 포괄적인 스크리닝 및 표적 정량 분석을 위한 실험실에서 필수적인 부분으로 남아 있는 몇 가지 이유입니다 9,10. 그러나 문헌에 나타난 현재의 GC-MS 정량 분석법은 분석물11의 범위가 제한적이고 빠르게 구식이 되어 현재의 사례 연구에는 적용할 수 없는 경향이 있습니다. 더 중요한 것은 검출 및 정량화의 한계가 LC-MS 분석법(< 1ng/mL)12과 비교할 수 없으므로 위음성 결과의 가능성이 높아진다는 것입니다. 사후 검체를 조사한 GC-MS와 LC-MS의 비교 결과, 현재까지 가장 강력한 합성 오피오이드 중 하나인 카펜타닐이 양성으로 확인된 134건 중 104건에서 GC-MS13을 사용한 카펜타닐에 대해 음성 판정을 받았다. 약물 분석 실험실에서 GC-MS는 분석된 샘플의 농도가 높기 때문에 합성 오피오이드에 더 자주 사용되고 수정이 가능합니다. 그러나 GC-MS는 이러한 화합물의 확인을 위해 푸리에 변환-적외선 분광법(FT-IR) 및 주사 전자 현미경(SEM)과 같은 추가 기술과 함께 여전히 활용되고 있습니다14. 법의독성학에서 생물학적 시료 분석에 GC-MS를 적용하려면 액체-액체 추출(LLE) 또는 고체상 추출(SPE)을 사용하여 이러한 화합물을 추출하는 것을 포함하는 시료 전처리 방법이 필요합니다15. LLE는 다양한 용매로 수행할 수 있지만 생산성이 높은 실험실에서는 LLE가 비용 효율적이거나 시기가 적절하지 않을 수 있습니다. LLE는 많은 양의 용매와 시료량을 소비하는 반면, 대안인 SPE는 자동화가 가능하며 최소 시료량16이 필요합니다. 최근 GC-MS 연구에서는 3개의 개별 GC 열 프로그램을 사용하여 20개의 서로 다른 이성질체 펜타닐 유사체를 분리했다고 보고했습니다17. 이성질체 간의 기준선 분리는 성공적이었지만 관련 법의학 사례 및 워크플로우에 이 방법을 적용할 수 있는 가능성은 제한적입니다.

LC-MS는 특히 비휘발성 및 열에 민감한 화합물18,19에 대한 GC-MS의 한계로 인해 법의학 테스트에서 인기를 얻고 있습니다. QQQ(Triple Quadrupole) 및 이온 트랩 기기를 활용한 LC-MS 스크리닝은 낮은 농도(<1ng/mL)12,20,21,22,23,24에서 합성 오피오이드를 검출하는 데 성공했습니다. 일반적으로 이러한 LC-MS 분석법은 면역분석 및/또는 GC-MS 결과를 보완하기 위한 2차 확인 분석법으로 사용됩니다. 2017년 마이애미-데이드 카운티 검시관실(MDME) 독성학 실험실의 Shoff 등은 초고압 액체 크로마토그래피(UHPLC)-이온 트랩-MSn 13을 사용하여 44개의 오피오이드 관련 화합물에 대한 포괄적인 스크리닝 방법을 개발했습니다. 표적 MRM 분석법과 유사하게, 이 이온 트랩 분석법은 머무름 시간, 전구체 표적 이온 및 가능한 경우 MS3 스펙트럼 단편화를 위한 1차 딸 이온을 포함하는 스케줄링 프리커서 목록(SPL)을 활용했습니다. 이 스크리닝 방법을 삼중 사중극자 및 선형 사중극자 이온 트랩에서 개발된 방법과 구분하는 것은 스펙트럼 데이터에 제공되는 추가 세부 정보입니다. 이 스크리닝 방법이 제공할 수 없는 것은 이온 트랩 기기에서는 거의 개발되지 않은 정량 분석과 미지 물질의 식별이다13. 합성 오피오이드에 대한 LC-QQQ 분석법은 사전 정의된 표적 목록을 동시에 스크리닝하고 정량화할 수 있습니다. 화합물의 식별 및 정량화를 위한 다중 반응 모니터링(MRM) 전이의 사용은 신뢰할 수 있는 데이터 수집 기법이며 합성 오피오이드 검출을 위한 문헌에서 사용되는 가장 일반적인 기법입니다12,20. 합성 오피오이드 어레이의 정량화를 위해 보고된 선형 범위는 0.01-100ng/mL에 걸쳐 있으며, 카르펜타닐과 같은 더 강력한 합성 오피오이드는 sub-ng/mL 범위1 1,24,25,26,27에서 검출됩니다.

이성질체 합성 오피오이드의 분리는 LC-MS 분석법에서 다루어졌습니다. 이러한 방법 중 하나는 비페닐 컬럼28을 사용하여 16분 런타임 내에 174개의 이성질체 펜타닐 유사체를 분리했습니다. 또한 컬럼 효율, 이동상 pH 및 압력 변화와 같은 LC 종속 파라미터의 변동으로 인해 일관된 모니터링과 더 큰 수집 창(>0.4분)을 가진 표적 분석에서 고려해야 하는 머무름 시간 이동이 발생하며, 이로 인해 한 번 분해된 이성질체가 잠재적으로 중복될 수 있습니다. 2차원 액체 크로마토그래피(2D-LC)29의 사용을 포함하여 이성질체 분리를 위한 추가 크로마토그래피 기술이 탐구되었습니다. 그리고 이 기법은 화합물의 직교 분리를 제공할 수 있는 능력을 가지고 있지만, 과도한 실행 시간, 비용, 방법 개발의 어려움 및 대안적인 분리에 비해 유용성을 포함한 단점이 장점보다 더 큽니다30.

고분해능 질량분석법(HRMS)은 합성 오피오이드 식별을 위해 점점 더 신뢰할 수 있게 되고 있습니다. 몇몇 계측 회사들은 복잡한 생물학적 매트릭스 19,28,31에서 광범위한 합성 오피오이드를 식별하기 위해 개발된 표적 방법을 판매했습니다. 이러한 방법은 이전에 논의한 방법과 달리 소급 분석을 위해 분석 데이터를 저장할 수 있습니다. 따라서 이전에 분석된 결과가 불분명한 표본은 나중에 새로 식별된 화합물을 발견하기 위해 다시 검토할 수 있습니다. HRMS와 QQQ를 구분하는 것은 정확한 질량 식별입니다. 두 MS 기법 모두 낮은 농도에서 정확하게 정량화할 수 있지만, HRMS는 미지의 화합물 32,33,34의 초기 스크리닝 및 발견에 더 효과적인 것으로 입증되었습니다. HRMS, 특히 TOF(Time-of-Flight) MS 분석기는 NPS 발견의 최전선에 있었으며, 법의학 테스트 실험실은 새로운 화합물에 대한 시간에 민감한 데이터를 법 집행 기관과 과학계 모두에 제공하여 이러한 화합물 중 일부의 확산을 확대하는 동시에 인식과 교육을 높일 수 있습니다33. 남용 약물 검출을 위한 TOF의 사용은 10분 크로마토그래피 프로그램 내에서 분리된 600개 이상의 화합물을 포함하는 분석법을 통해 매우 포괄적이 되었습니다. 이전 연구에서는 이성질체 오피오이드35의 검출 및 분리를 위해 TOF와 결합된 트랩 이온 이동성 분광법(TIMS)의 이점이 보고되었습니다.

액체 크로마토그래피, 포획 이온 이동도 분광법 및 질량 분석법 간의 직교성을 활용하여 제시된 방법은 머무름 시간, 동위원소 패턴, 이동성 및 단편화 패턴을 기반으로 펜타닐 유사체의 광범위한 특성화를 제공합니다.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 시료 전처리

  1. 펜타닐 아날로그 스크리닝 키트를 받은 후에는 -20°C에서 보관하십시오. 500 μL의 순수 LC/MS 등급 메탄올을 첨가하여 각 샘플을 최종 농도 400 μg/mL로 재현탁시킵니다.
  2. 플레이트 믹서 또는 볼텍서를 사용하여 400rpm에서 1시간 동안 또는 15분 동안 중간 속도로 와류를 사용하여 혼합합니다. 재현탁 후 바이알을 -20°C에서 보관하십시오.
  3. 순수 LC/MS 등급 메탄올을 사용하여 각 표준물질을 최종 농도인 1ng/mL로 희석합니다.
  4. 각 그룹에 이성질체 표준물질이 포함되지 않도록 표준을 그룹으로 그룹화합니다. 펜타닐 표준물질의 14개 그룹에 대한 분석은 보충 표 1 을 참조하십시오.

2. HPLC 이동상 준비

  1. 0.05% 포름산(85%)과 함께H2O에 5mM/L 포름암모늄(NH4HCO2)을 사용하여 이동상 A(MPA)를 제조합니다.
    1. 0.078g의 NH4HCO2 의 무게를 측정하고 250mL 부피 플라스크에 붓고 약 2/3까지 물을 채웁니다. 잘 섞이도록 휘젓는다.
    2. 완전히 용해되면 0.125mL의 포름산(85%)을 추가합니다. 주입선(250mL)까지 물을 채우고 섞는다.
  2. 1:1 메탄올 아세토니트릴 혼합물에 0.05% 포름산을 사용하여 이동상 B(MPB)를 준비합니다.
    1. 125mL의 아세토니트릴을 용량 플라스크에 붓고 주입선에 도달할 때까지 메탄올을 추가합니다.
    2. 잘 섞이도록 휘젓는다. 플라스크에 0.05% 포름산 0.125mL를 넣고 섞어 균질화합니다.

3. HPLC 분석법 개발

  1. LC 소프트웨어를 홈 화면으로 엽니다. 창 중앙에 있는 샘플 테이블에서 새 프로토콜을 만듭니다.
    1. 바이알 컬럼에 샘플 위치에 주석을 추가합니다. YYYYMMDD_NAME(대표 설명자) 형식을 사용하여 샘플 ID 열에 주석을 추가합니다. 원하는 주입 부피(15 μL)로 부피 컬럼에 주석을 추가합니다.
  2. 데이터 경로 열에 데이터가 저장될 위치에 주석을 추가합니다.
  3. HPLC 분석법 입력
    1. 화면 중앙에 있는 샘플 테이블의 막대에서 새로 만들기 를 선택합니다. 분리 방법 아래에서 드롭다운 화살표를 선택하고 팝업 창에서 새 방법을 클릭합니다.
    2. 분리 방법이라고 표시된 새 창이 나타나면 여기에서 획득 시간 또는 ICF(Instrument Control Framework) 시스템 방법을 편집합니다.
    3. 그림 1과 같이 ICF 시스템의 Edit Method 단추를 두 번 클릭하여 이진 그라데이션을 편집할 수 있는 팝업을 엽니다.
    4. 이진 그래디언트 탭에서 그래디언트의 시각적 표현은 왼쪽에 있고 그래디언트의 분석은 오른쪽에 있으며 타임스탬프, 유속, MPA 및 MPB 농도를 설정합니다.
    5. 정지 시간이 18분으로, 유속이 0.400mL/분으로, 압력 한계가 0psi 및 6000psi에서 최소 및 최대로 설정되어 있는지 확인합니다.
    6. 타임스탬프 농도를 다음과 같이 설정합니다.
      0.00분에서 B 농도를 20.0으로 설정합니다.
      1분 50초에 B 농도를 25.0으로 설정합니다.
      3.00분에서 B 농도를 27.0으로 설정합니다.
      6.00분에 B 농도를 27.0으로 설정합니다.
      6분 50초에 B 농도를 30.0으로 설정합니다.
      7.00분에 B 농도를 95.0으로 설정합니다.
      16.00분에 B 농도를 95.0으로 설정합니다.
      16분 50초에 B 농도를 20.0으로 설정합니다.

4. HPLC 초기화

  1. HPLC 컬럼 섹션에서 LC 컬럼(모놀리식 C18 HPLC 컬럼 100mm x 4.6mm)과 컬럼 가드(가드 컬럼 5mm x 4.6mm)를 삽입합니다. 최소 및 최대 컬럼 압력에 주의하십시오.
  2. 샘플 블랭크(동일한 버퍼 용액)를 실행하여 누출을 테스트하고 기준선을 만듭니다. 누출을 찾으십시오. 누출은 컬럼 압력 변동으로 관찰될 수 있습니다. 누출이 있는 경우 누출이 발생할 수 있는 위치를 확인하고 연결을 조입니다.
  3. 원하는 LC 프로그램을 사용하여 샘플 블랭크(동일한 버퍼 용액)를 실행하여 컬럼을 전처리합니다.

5. timsTOF MS/MS 분석법 개발

  1. timsControl 애플리케이션을 엽니다. 창 왼쪽에는 MS 및 TIMS 설정이 있습니다.
    1. MS 설정에서 스캔 시작과 끝을 각각 50m/z 및 1800m/z로 설정합니다. 이온 극성에 대해 positive mode를 선택하고 scan mode에 대해 parallel accumulation-serial fragmentation을 선택합니다.
    2. TIMS 설정에서 모드를 사용자 지정으로, 1/K0 시작을 0.40 Vs/cm2로, 1/K0 끝을 1.85 Vs/cm2로, 램프 시간을 150.0ms로, MS 평균을 1로 설정합니다.
  2. Source(소스) 아래의 아래쪽 탭 선택에서 두 개의 설정 상자에서 다음 변경 작업을 수행합니다.
    1. 소스에서 엔드 플레이트 오프셋을 500V로, 모세관을 4500V로, 분무기를 3.0bar로, 건조 가스를 10.0L/min으로, 건조 온도를 200°C로 설정합니다.
    2. 시린지 펌프 설정에서 시린지가 Hamilton 1mL이고, 활성이 활성화되어 있으며, 유속이 80.0μL/h로 설정되어 있는지 확인합니다.
  3. Tune 탭에서 General, Processing 및 TIMS에 대한 설정 탭에서 다음과 같은 변경 작업을 수행합니다.
    1. General settings(일반 설정) 탭에서 transfer(전송), collision cell(충돌 셀), Quadrupole(사중극자), focus pre TOF(초점 pre TOF) 및 detection(감지) 섹션을 설정합니다.
      1. 전송 설정에서 편향 1 델타를 70.0V로, 퍼널 1 RF를 341.0Vpp로, CID 에너지를 0.0eV로, 퍼널 2 RF를 300.0Vpp로, 다극 RF를 300.0Vpp로 설정합니다.
      2. 충돌 셀 설정에서 충돌 에너지가 6.0eV로 설정되고 충돌 RF가 1200.0Vpp로 설정되어 있는지 확인합니다.
      3. 사중극자 설정에서 이온 에너지가 6.0eV로 설정되고 저질량이 250.00m/z로 설정되었는지 확인합니다.
      4. focus pre TOF 설정에서 전송 시간을 75.0 μs로 설정하고 프리 펄스 저장을 5.0 μs로 설정합니다.
    2. Processing settings(처리 설정) 탭에서 mass spectra peak detection(질량 스펙트럼 피크 검출) 및 mobility peak detection(이동성 피크 검출) 섹션을 설정합니다.
      1. 질량 스펙트럼 피크 설정에서 강도의 합(면적)을 선택 취소하고 절대 임계값을 667로 설정합니다.
    3. TIMS 탭에서 offsets, ion change control 및 advanced parameters 섹션을 설정합니다.
      1. 오프셋 설정에서 Δt1 - -20.0 V, Δt2 - -100.0 V, Δt3 - 40.0 V, Δt4 - 80.0 V, Δt5 - 0.0 V, Δt6 - 120.0 V, 콜리전 셀 IN을 250.0 V로 설정합니다.
      2. 이온 전하 제어 설정에서 상자를 클릭하여 활성화하고 목표 강도를 5.00M로 설정합니다.
      3. 고급 매개변수에서 이동성 범위에 대한 잠금 누적을 활성화합니다.
  4. MS/MS 탭에서 스캔 모드를 병렬 축적-직렬 단편화로 설정하고 전구체 이온, 스케줄링, 활성 배제, 충돌 에너지 설정, 절연 폭 설정 및 TIMS 스테핑 섹션을 설정합니다.
    1. precursor ions에서 parallel accumulation-serial fragmentation ramps의 수를 8로, 최소 충전을 1로, 최대 충전을 5로 설정합니다.
    2. scheduling settings(스케줄링 설정)에서 precursor repetitions(프리커서 반복)를 활성화합니다. active exclusion(활성 제외)에서 확인란을 선택하여 활성화하고 릴리스를 0.40분 후로 설정합니다.
    3. 충돌 에너지 설정 및 격리 폭 설정을 조정하지 마십시오. TIMS 스테핑 박스(TIMS Stepping Box )를 클릭하여 활성화합니다.

6. 이동성 및 질량 교정

  1. m/z 및 모빌리티 도메인 모두에 대한 보정을 수행합니다. m/z 캘리브레이션 설정에서 드롭다운 메뉴에 나타나는 참조 목록 상자의 사전 로드된 튜닝 믹스 프로필 중 하나를 선택합니다.
  2. 보정하려면 TOF용 주사기에 튜닝 믹스 용액을 로드합니다. 창 오른쪽에서 다양한 보정 유형에 대한 보정 모드라는 설정을 사용하여 가장 높은 점수를 달성하도록 설정합니다.
  3. 점수가 가능한 한 100%에 가까운지 확인합니다. 선형, 사분면 및 향상된 2차 사이를 전환하여 최고의 점수를 얻을 수 있습니다.
  4. m/z 보정에 사용되는 6.1-6.3단계에 따라 이동성을 보정합니다.
  5. 보정이 완료되면 상단 표시줄에서 Method 탭을 선택하여 MS Method를 저장합니다. 드롭다운 메뉴에서 Save As(다른 이름으로 저장 )를 선택하여 새 MS Method 파일을 생성합니다.

7. dia(data independent acquisition) 병렬 축적-직렬 단편화 방법 생성

  1. 데이터 세트가 dda(data dependent acquisition) 병렬 축적-직렬 단편화로 수집되면 dia로 실험을 실행합니다. ion mobility 소프트웨어 응용 프로그램을 열고 6.5단계에서 저장한 dda Method를 로드합니다.
  2. MS 설정에 대해 모든 설정을 동일하게 유지하고 병렬 누적-직렬 단편화에서 dia-parallel accumulation-serial 단편화로 변경합니다.
  3. 패널 하단에서 MSMS 탭을 선택한 다음 Window Editor 를 클릭하여 그림 2와 같은 창 팝업을 엽니다.
  4. 팝업 창 상단에 있는 분석 열기 버튼을 사용하여 이전에 저장한 dda 데이터 세트(.m 파일)를 로드합니다.
  5. 히트 맵이 왼쪽 하단에 나타나 그래프를 대각선으로 가로지르는 창의 다각형이 있는 창을 표시합니다. 클릭하고 드래그하여 히트 맵의 데이터에 맞도록 폴리곤의 크기를 조정합니다(모서리는 측면 선을 두 번 클릭하여 선택할 수 있습니다. 드래그하고 크기를 조정할 수 있는 점이 나타납니다).
  6. 창 오른쪽에는 창 설정이 있습니다. 질량 너비를 설정하고(50은 이동) 수평 겹침을 설정하며, 둘 다 Da에서 가능합니다.
  7. 질량 너비와 수직 겹침당 이동성 창의 수를 설정합니다.
  8. 팝업의 오른쪽 하단에 있는 Windows 계산 을 클릭하여 새 설정으로 표시된 창을 확인합니다. 적절해지면 Apply dia-PASEF Windows to Method(dia-PASEF Windows to Method)를 클릭합니다. 그러면 팝업이 닫히고 홈 화면으로 다시 이동합니다.

8. HPLC 이온 이동성 TOF 데이터 처리

  1. 데이터 분석 소프트웨어를 엽니다. 왼쪽 상단에서 파일 탭을 클릭하고 드롭다운에서 열기 를 선택합니다. 새 파일 창에서 원하는 파일을 선택하고 열기를 클릭합니다.
  2. 보정을 확인하십시오. 분석 상자 아래의 파일 이름을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 속성을 선택합니다. 파일 name_analysis 속성이라고 표시된 창이 나타납니다. 캘리브레이션 상태를 선택합니다.
  3. 드롭다운 상자에서 Mass Spectrometer에 대한 Instrument Calibration을 선택합니다. 오류가 1μg/mL 이하인지 확인합니다. Initial Mobility Calibration(초기 이동성 보정 )을 선택하고 오류가 1μg/mL 이하인지 확인합니다.
  4. 아래 설명에 따라 데이터 분석 소프트웨어에서 크로마토그램을 준비합니다.
    1. 파일 이름 아래의 크로마토그램 을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 크로마토그램 편집을 선택합니다. 유형에서 드롭다운 상자를 클릭하고 Extracted Ion Chromatogram(추출된 이온 크로마토그램)을 선택합니다.
    2. 필터에서 모든 MS 를 선택하고 스캔 모드에서 모두를 선택합니다. 이것은 관심 분자의 단편만이 아닌 관심 분자의 피크를 보기 위한 것입니다.
    3. 그 아래에서 분자 선택을 위한 두 가지 필터 옵션(파란색으로 강조 표시된 질량 또는 공식)을 찾으십시오.
    4. 질량을 사용하여 이온을 추출하는 경우 관심 분자의 이론적 m/z를 삽입합니다. 이 경우 (대표 결과의 경우 질량) m/z를 선택합니다.
    5. 공식을 사용하여 이온을 추출하는 경우 분자에 대한 공식과 크로마토그램에 대한 관심 이온 형태를 삽입합니다. 이 경우 양성자 이온 [M+H]+를 선택합니다.
    6. 극성을 포지티브 모드로 설정합니다.
  5. 질량 스펙트럼
    1. 화합물 피크의 기준선을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 피크의 다른 가장자리로 드래그합니다. 이렇게 하면 해당 머무름 시간 내에 단편의 질량 스펙트럼이 생성됩니다.
  6. Mobilogram의 생성
    1. mobilogram이라는 제목의 왼쪽 탭을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 Edit Mobilogram을 선택합니다. edit mobilogram traces(mobilogram 추적 편집)라는 제목의 창이 나타납니다. 크로마토그램을 편집하려면 8.4.2-8.4.7 단계를 따르십시오.
    2. 머무름 시간 입력에서 관심 피크의 머무름 시간 범위를 추가합니다.
    3. 매개 변수를 선택했으면 Add 를 클릭한 다음 edit mobilogram traces 창의 오른쪽 상단에 있는 Ok 를 클릭합니다.
    4. 잠시 후 소프트웨어가 원하는 선택 항목을 처리하고 크로마토그램을 출력합니다. 혼합물의 모든 이온에 대해 8.6.1-8.6.3단계를 반복합니다.
    5. 화합물 스펙트럼 생성
      1. 스펙트럼 보기 창 하단에서 Profile MS and Fragment MS를 선택합니다. 이렇게 하면 전체 스캔 및 PASEF의 이온을 포함할 수 있습니다.
      2. 스펙트럼 보기에서 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 Copy Compound Spectra를 선택합니다. 오른쪽에 표시되는 스펙트럼 데이터를 통해 분해능 분해능, 강도 및 신호 대 잡음비(S/N)와 같은 화합물에 대한 자세한 정보를 찾을 수 있습니다.
    6. 데이터 처리
      1. 데이터를 처리하려면 크로마토그램과 이동도 피크를 수동으로 통합하여 관심 분자에 대한 중요한 정보를 얻을 수 있습니다.
      2. 찾기를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 크로마토그램만 통합(Integrate only chromatogram) 또는 모빌로그램(mobilogram)을 선택합니다. 마우스 왼쪽 버튼을 클릭하고 드래그하여 원하는 피크를 강조 표시합니다. 머무름 시간, 면적, S/N 및 이동성을 포함한 정보가 표시됩니다.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

250개의 아날로그 표준으로 구성된 펜타닐 아날로그 스크리닝 키트는 m/z 간섭을 피하기 위해 17개의 아날로그로 구성된 12개 그룹과 16개의 아날로그로 구성된 2개 그룹의 14개 그룹으로 나뉩니다. 각 아날로그는 m/z, 머무름 시간(RT), 이동성(K) 및 MS/MS 단편화 패턴으로 더욱 특성화됩니다.

이성질체 분리의 예는 각각 C22H28N2O2 및 C21H28N2OS 화학식에 대한 도 3 및 도 4에 도시되어 있다.

펜타닐 아날로그 스크리닝 키트에는 C22H28N2O2 화학식을 가진 4 개의 이성질체가 포함되어 있습니다 ( 그림 3 참조). 그림 4 의 검사는 [M+H]+ 추출된 이온 크로마토그램, 모빌로그램, 동위원소 패턴 및 MS/MS 단편화 패턴을 보여줍니다. 메톡시아세틸 펜타닐 및 펜타닐 카바메이트는 파라-메톡시 아세틸 펜타닐 및 B-하이드록실 펜타닐과 LC 및 이동성 영역에서 잘 분리됩니다. 그러나 파라-메톡시 아세틸 펜타닐과 B-하이드록실 펜타닐 사이의 명확한 구분은 단편화 패턴에 의해 달성됩니다.

펜타닐 아날로그 스크리닝 키트에는 C21H28N2OS 화학식을 가진 3개의 이성질체가 포함되어 있습니다. 그림 4 의 검사는 [M+H]+ 추출된 이온 크로마토그램, 모빌로그램, 동위원소 패턴 및 MS/MS 단편화 패턴을 보여줍니다. a-메틸 티오펜타닐 및 (±)-트랜스-3-메틸 티오펜타닐은 LC 영역에서 분리되지만 이동성 영역에서는 분리되지 않습니다. 또한, (±)-트랜스-3-메틸 티오펜타닐 및 (±)-시스-3-메틸 티오펜타닐은 LC 영역이 아닌 이동성 영역에서 분리됩니다. 이는 LC와 이동성 분리의 상보성을 보여주며, 영역의 직교성을 통해 이성질체 종의 식별을 향상시킵니다. 그림 4D 는 LC와 모빌리티가 제공하는 이 결과를 요약한 것입니다.

figure-results-1
그림 1: 소프트웨어의 그래디언트 램프. ICF 시스템 방법 대화 상자는 B 농도의 백분율에 따라 분리 중에 적용된 시점을 그래디언트합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-2
그림 2: dia-PASEF 창 설정 dia-PASEF MS 분석법에서는 MS/MS 설정이 고유합니다. 왼쪽 그래프는 dda-PASEF 방법으로 기록된 데이터에서 조정된 창 다각형을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-3
그림 3: 이성질체 오피오이드에 대한 일반적인 추출 이온 크로마토그램, 추출된 모빌로그램 및 증폭된 MS 투영 . (A) 메톡시아세틸 펜타닐, 파라-메톡시 아세틸 펜타닐, β-하이드록시 펜타닐, 펜타닐 카바메이트의 구조 및 각각의 (B) 일반적인 머무름 시간, (C) 일반적인 이동성, (D) 이성질체 신호, (E) 주요 단편 및 (F) 단편화의 표현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-4
그림 4: 이성질체 오피오이드에 대한 일반적인 추출된 이온 크로마토그램 및 추출된 모빌로그램. (A) α-메틸 티오펜타닐, (±)-트랜스-3-메틸 티오펜타닐 및 (±)-시스-3-메틸 티오펜타닐의 구조. 각각의 이성질체에 대해 (B) 일반적인 머무름 시간, (C) 전형적인 이동성, (D) 머무름 시간과 이동성 사이의 직교성. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 1: 혼합물 그룹. 이 표는 이 절차를 위해 생성된 14가지 혼합물 각각에 어떤 오피오이드가 있는지 간략하게 설명합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

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이성질체 함량이 높은 생물학적 시료의 분석적 분리는 분석적으로 까다로울 수 있습니다. 이 논문에서 설명된 방법은 250개의 오피오이드 표준 키트에서 총 185개의 유사체에 대해 29개의 이성질체 세트를 특성화하는 것을 목표로 합니다. 테스트 그룹을 준비하는 동안 실험적으로 구별할 수 없는 m/z가 있는 두 개의 아날로그가 없는지 확인하는 것이 중요합니다. 여기에 설명된 데이터는 현장 실험에서 이 방법을 사용하는 경우 인간 기반 매트릭스가 아닌 표준을 사용합니다. 분석법의 적용 가능성을 보장하기 위해 관심 매트릭스를 사용한 추가 시험이 필요하다. 매트릭스로 인해 분석물질이 매트릭스가 없는 실험에서와 다르게 이온화될 수 있으므로 어떤 일반적인 이온 형태가 관찰될지 결정하는 것이 필수적입니다. 분석에서 식별은 가장 풍부한 형태(예: [M+H]+1 및 [M+Na]+1)의 동위원소 패턴을 기반으로 합니다.

LC 프로그램의 선택은 이성질체가 이동성 영역에서 분리되지 않는 경우에 매우 중요합니다. 그래디언트의 기울기를 줄이면 크로마토그래피 피크 간의 차이를 증가시켜 분석법의 특이성을 높일 수 있습니다.

데이터 분석 중에는 머무름 시간과 이동성을 결정할 때 관련 없는 신호를 무시하는 것이 중요합니다. HRMS의 장점은 추가적인 이동성 필터링과 함께 좁은 m/z 창(일반적인 질량 분해능 ~50,000)을 허용하여 화학적 노이즈를 줄입니다.

여기에 설명된 방법은 알려지지 않은 샘플에서 펜타닐 유사체를 스크리닝하기 위한 참조 라이브러리를 제공합니다. 보고된 RT, K, 동위원소 및 MS 단편화 패턴은 데이터 처리 및 알 수 없는 할당 중에 한정자로 사용됩니다. 기존의 MRM LC-QQQ 분석과 비교할 때 유사한 LOD를 달성할 수 있지만13,19,27 FID 키트를 사용하여 생성된 데이터베이스에 포함되지 않은 대체 오피오이드를 스크리닝할 수 있다는 장점이 있습니다. 각각의 새로운 오피오이드는 최종 검증을 위해 합성 표준물질을 사용한 분석이 필요합니다.

공개 사항

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Matthew Willetts와 Melvin A. Park는 timsTOF Pro2 상업용 기기 제조업체인 Bruker Daltonics Inc.의 직원입니다. 다른 모든 저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

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저자는 초기 분석법 개발 과정에서 Cesar Ramirez 박사의 초기 지원에 감사를 표하고자 합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Fluka17843-50G용 암모늄 포름산염
; Snap-Cap 마이크로 원심분리기 Safe-Lock TubesFisher05-402-25
ESI-L 저농도 튜닝 믹스AgilentG1969-85000
펜타닐 아날로그 스크리닝 (FAS) 키트 Cayman Chemical9003237, 9003286, 9003380, 9003381250개의 snthetic opioids, 210개의 펜타닐 유사체로 구성된 키트, 하나의 키트와 emergent panel versions 1-4로 나뉩니다
Formic acid Optima LC/MSFisherA117-50
Onyx guard column (5 x 4.6 mm) PhenomenexCHO-7649가드 컬럼 C18
Onyx monolithic C18 HPLC 컬럼 (100 x 4.6 mm)PhenomenexCHO-7643역상 C18 LC 컬럼
Optima 등급 아세토니트릴 FisherA996-4
Optima 등급 메탄올FisherA454-4
Optima 등급 물FisherW7-4
피펫Fisher05-719-5101-10 µ 키트; L, 10-100 &마이크로; L 및 100-1000 &마이크로; L 피펫
피펫 팁 10µ LFisher94060100
피펫 팁 1000&마이크로; LFisher94056710
피펫 팁 200µ LFisher94060310
플레이트 믹서IKA MS 3 D S1IKA MS 3 digtital
Prominence LC-20 CE 초고속 액체 크로마토그래프Shimadzu, 일본DGU-20A5, LC-20AD, SIL-20AC, CTO-20A, SPD-M20A, CBM-20A, SPD-20A
timsTOF ProBruker Daltonics Inc., Billerica, MAtimsTOF 기기 PASEF가 장착되어 있습니다 
HPLC Eppendorf. 컬럼용

참고문헌

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