지방 유래 중간엽 기질 세포(AdMSC)는 염증과 관련된 질병을 치료하는 데 유용한 강력한 면역 조절 특성을 가지고 있습니다. 쥐 AdMSC와 원발성 혼합 신경교세포를 분리 및 배양하고, AdMSC를 자극하여 항염증 유전자 및 성장 인자를 상향 조절하고, AdMSC의 이동을 평가하고, 원발성 혼합 프리온 감염 신경교세포와 AdMSC를 공동 배양하는 방법을 보여줍니다.
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이 논문에서
요약
초록
중간엽 기질 세포(MSC)는 항염증성 사이토카인, 케모카인 및 성장 인자의 생성을 통해 염증을 강력하게 조절합니다. 이 세포는 프리온 질환 및 기타 단백질 접힘 장애와 같은 신경 퇴행성 질환의 맥락에서 신경 염증을 조절하는 능력을 보여줍니다. 프리온 질환은 산발적이거나, 후천적이거나, 유전적일 수 있습니다. 이는 뇌에서 프리온 단백질의 잘못된 접힘과 응집으로 인해 발생할 수 있습니다. 이러한 질병은 항상 치명적이며 사용할 수 있는 치료법이 없습니다.
질병의 초기 징후 중 하나는 성상교세포와 미세아교세포의 활성화 및 관련 염증으로, 이는 감지 가능한 프리온 응집과 신경 세포 손실 이전에 발생합니다. 따라서 MSC의 항염증 및 조절 특성을 수확하여 프리온 질환에서 성상교증을 치료할 수 있습니다. 최근에는 BV2 세포 또는 원발성 혼합 신경교세포와 함께 배양한 지방 유래 MSC(AdMSCs)가 파라크린 신호전달을 통해 프리온 유발 염증을 감소시킨다는 것을 보여주었습니다. 이 논문은 프리온 유발 염증을 줄이기 위해 자극된 AdMSC를 사용하는 신뢰할 수 있는 치료법에 대해 설명합니다.
AdMSC의 이형접합 집단은 쥐 지방 조직에서 쉽게 분리하고 배양에서 확장할 수 있습니다. 염증성 사이토카인으로 이러한 세포를 자극하면 프리온에 감염된 뇌 균질화로 이동하고 이에 대한 반응으로 항염증 조절제를 생성하는 능력이 향상됩니다. 이러한 기법은 프리온 감염에 대한 MSC의 치료 가능성을 조사하는 데 사용할 수 있으며 다른 단백질 접힘 및 신경 염증성 질환에도 적용할 수 있습니다.
서론
신경교세포 염증은 파킨슨병, 알츠하이머병, 프리온 질환 등 다양한 신경퇴행성 질환에서 중요한 역할을 합니다. 비정상적인 단백질 응집은 질병 발병 기전과 신경 퇴행의 많은 원인에 기인하지만, 신경교세포(glial cell)도 이 1,2,3을 악화시키는 역할을 합니다. 따라서 신경교세포 유발 염증을 표적으로 하는 것은 유망한 치료법입니다. 프리온 질환에서 세포 프리온 단백질(PrPC)은 질병 관련 프리온 단백질(PrPSc)로 잘못 접혀 올리고머를 형성하고 응집하여 뇌의 항상성을 방해합니다 4,5,6.
프리온 질환의 초기 징후 중 하나는 성상교세포(astrocyte)와 미세아교세포(microglia)의 염증 반응입니다. 미세아교세포(microglia)를 제거하거나 성상세포(astrocyte)를 변형시켜 이러한 반응을 억제하는 연구는 일반적으로 동물 모델에서 질병 발병기전을 개선하....
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프로토콜
마우스는 콜로라도 주립 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)가 승인한 프로토콜 #1138에 따라 국제 실험실 동물 관리 평가 및 인증 협회(Association for Assessment and Accreditation of Lab Animal Care International)의 인증을 받은 콜로라도 주립 대학의 실험실 동물 자원(Lab Animal Resources)에서 사육 및 유지되었습니다.
1. 프리온으로 원발성 피질 혼합 아교세포를 분리하고 감염시키는 것
- 성상교세포(astrocyte)와 미세아교세포(microglia)를 모두 포함하는 원발성 혼합교세포(primary mixed glia)를 분리하기 위해, 0일에서 2일 된 생쥐 새끼 C57Bl/6을 획득합니다.
참고: 이 프로토콜은 이전 프로토콜 15,16에서 조정되었습니다. - 참수로 한 번에 한 마리씩 새끼를 안락사시키고 뇌를 추출하여 소뇌와 뇌간을 분리하고 폐기합니다.
- 2x 페니실린/스트렙토마이신/네오마이신(PSN)....
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결과
TNFα 또는 인터페론 감마(IFNγ)로 AdMSC를 24시간 동안 자극하면 항염증 분자 및 성장 인자의 발현 변화를 유도합니다. AdMSC를 TNFα 또는 인터페론 감마(IFNγ)로 처리하면 TNF 자극 유전자 6(TSG-6) mRNA가 증가하는 반면, TNFα는 IFNγ가 아닌 형질전환성장인자베타-1(TGFβ-1) mRNA가 증가합니다. TNFα 또는 IFNγ로 자극하면 혈관 내피 성장 인자(VEGF) mRNA의 증가를 유도하지만 섬유아세포 성장 인자(FGF) mRNA의 발현에는 변화가 없습니다(그림 1A). 이러한 데이터는 AdMSC가 프리온에 감염된 뇌 균질체의 요인, 즉 사이토카인(cytokine) 및 손상 관련 분자 패턴(DAMP)의 환경일 가능성이 있음을 시사합니다 18,19,20.
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토론
여기에서는 신경교세포 모델에서 프리온 유발 염증을 감소시키는 지방 유래 중간엽 기질 세포(AdMSCs)의 효과를 평가하기 위한 신뢰할 수 있고 상대적으로 저렴한 프로토콜을 보여줍니다. AdMSC는 배양에서 쉽게 분리하고 증식하여 1주일 이내에 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 면역형광 및 유세포 분석에 의해 중간엽 기질 세포의 마커와 일치하는 마커를 발현하는 이종 세포 집단을 일관되게 생성하고, 사이토카인 또는 프리온 감염 뇌 균질액에 도입될 때 면역학적 기능을 유지한다 14. 여기에 표시된 데이터는 AdMSC가 이러한 자극에 노출될 때 항염증성 사이토카인과 성장 인자를 상향 조절한다는 것을 나타냅니다. 이 특성은 AdMSC를 "자극"하여 염증 감소를 촉진하는 분자를 생성하도록 할 수 있습니다. 전염증성 사이토카인으로 AdMSC를 자극하면 항염증 유전자 및 TSG-6, TGFβ-1 및 VEGF와 같은 성장 인자를 포함한 특정 관심 유전자.......
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공개 사항
저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.
감사의 글
저자는 Lab Animal Resources의 축산업에 감사를 표합니다. 이 원고의 자금 출처에는 Boettcher Fund, Murphy Turner Fund, CSU College of Veterinary Medicine 및 Biomedical Sciences College Research Council이 포함됩니다. 그림 2A, 그림 2C 및 그림 3A 는 BioRender.com 로 만들어졌습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.25% 트립신 | 싸이티바 | SH30042.01 | |
| 5mL 혈청학적 피펫 | Celltreat | 229005B | |
| 6웰 조직 배양 플레이트 | Celltreat | 229106 | |
| 10cm 세포 배양 접시 | 피크 세럼 | PS-4002 | |
| 10ml 혈청학적 피펫 | Celltreat | 229210 | |
| 15mL 원뿔형 튜브 | Celltreat | 667015B | |
| 50 mL 원뿔형 튜브 | Celltreat | 667050B | |
| BV2 마이크로아교세포 세포주 | AcceGen Biotech | ABC-TC212S | |
| 세포 리프터 | Biologix Research Company | 70-2180 | |
| 크리스탈 바이올렛 | 전자 현미경 과학 | 12785 | |
| Dispase | Thermo Scientific | 17105041 | |
| DMEM/F12 | Caisson Labs | DFL14-500ML | |
| DNase-I | Sigma Aldrich | 11284932001 | |
| 필수 아미노산 | Thermo Scientific | 11130051 | |
| Ethanol (100%) | EMD Millipore | EX0276-1 | |
| Fetal bovine serum (heat | Peak Serum | PS-FB4 | 는 실험실에서 열 비활성화 또는 비활성화로 구매할 수 있습니다. |
| 포름알데히드 | EMD Millipore | 1.04003.1000 | |
| Glass 10 mL 혈청학 피펫 | Corning | 7077-10N | |
| 행크 s Balances Salt Solution | Sigma Aldrich | H8264-500ML | |
| 혈구계/Neubauer 챔버 | Daigger | HU-3100 | |
| High Glucose DMEM | Cytiva | SH30022.01 | |
| 저혈당 DMEM 함유 L-글루타민 | Cytiva | SH30021.01 | |
| MEM/EBSS | Cytiva | SH30024. FS | |
| 비필수 아미노산 | Sigma-Aldrich | M7145-100M | |
| 파라포름알데히드 (16%) | MP Biomedicals | 219998320 | |
| Penicillin/streptomycin/neomycin | Sigma-Aldrich | P4083-100ML | |
| 인산염 완충 식염수 | Cytiva | SH30256.01 | |
| 재조합 마우스 IFN-감마 단백질 | R& D 시스템 | 485-MI | |
| 재조합 마우스 TNF-알파(AA 80-235) 단백질, CF | R& D Systems | 410-MT | |
| RNeasy 미니 키트 | Qiagen | 74104 | |
| Sigmacote | Sigma Aldrich | SL2-100ML | Sigmacote에서 위아래로 두 번 흡인하고 완전히 건조시켜 유리 피펫 내부를 코팅합니다. 알루미늄 호일로 싸고 24시간 후에 오토클레이브 피펫 |
| Stemxyme | Worthington Biochemical Corporation | LS004106 | Collagenase/Dispase 혼합물 |
| 멸균, 개별 포장된 면봉 | Puritan Medical | 25-8061WC | |
| Thincert 조직 배양 인서트, 24 웰, 기공 크기 = 8 &마이크로; m | Greiner Bio-One | 662638 | |
| Thincert 조직 배양 인서트, 6 웰, 기공 크기 = 0.4 &마이크로; m | 그라이너 바이오-원 | 657641 |
참고문헌
- Liddelow, S. A., et al. Neurotoxic reactive astrocytes are induced by activated microglia. Nature. 541 (7638), 481-487 (2017).
- Smith, H. L., et al. Astrocyte unfolded protein response induces a specific reactivity state t....
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