Method Article

인간 줄기세포 유래 중뇌 도파민 뉴런의 표현형 프로파일링

DOI:

10.3791/65570

⸱

July 7th, 2023

 ,  , 
1Ksilink

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 인간 중뇌 도파민 뉴런의 세포 배양에 이어 면역학적 염색 및 획득된 현미경 high-content 이미지에서 신경 세포 표현형 프로파일 생성을 설명하여 유전적 또는 화학적 조절로 인한 표현형 변이를 식별할 수 있습니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

파킨슨병(PD)은 중뇌 도파민(mDA) 뉴런 손실을 유발하는 다양한 세포 생물학적 과정과 관련이 있습니다. 현재의 많은 in vitro PD 세포 모델은 복잡성이 부족하고 여러 표현형을 고려하지 않습니다. 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSC) 유래 mDA 뉴런의 표현형 프로파일링은 PD 관련 세포 유형에서 다양한 뉴런 표현형을 동시에 측정하여 이러한 단점을 해결할 수 있습니다. 여기서는 상업적으로 이용 가능한 인간 mDA 뉴런에서 표현형 프로파일을 얻고 분석하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 뉴런 특이적 형광 염색 패널은 핵, α-시누클레인, 티로신 하이드록실라제(TH) 및 미세소관 관련 단백질 2(MAP2) 관련 표현형을 시각화하는 데 사용됩니다. 설명된 표현형 프로파일링 프로토콜은 384웰 플레이트, 자동 액체 처리 및 고처리량 현미경을 사용하기 때문에 확장 가능합니다. 프로토콜의 유용성은 건강한 기증자 mDA 뉴런과 류신이 풍부한 반복 키나아제 2(LRRK2) 유전자에서 PD 결합 G2019S 돌연변이를 운반하는 mDA 뉴런을 사용하여 예시됩니다. 두 세포주 모두 LRRK2 키나아제 억제제 PFE-360으로 처리하고 표현형 변화를 측정했습니다. 또한 클러스터링 또는 기계 학습 기반 지도 분류 방법을 사용하여 다차원 표현형 프로파일을 분석하는 방법을 보여줍니다. 설명된 프로토콜은 신경 질환 모델링을 연구하거나 인간 신경 세포의 화합물 효과를 연구하는 연구자들에게 특히 흥미로울 것입니다.

Introduction

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파킨슨병(PD)에서는 다양한 세포 생물학적 과정이 방해를 받습니다. 예를 들어, 미토콘드리아 기능 장애, 산화 스트레스, 단백질 분해 결함, 소포 이동 및 엔도리소좀 기능 장애는 중뇌 도파민(mDA) 뉴런 손실과 관련이 있으며, PD1에서 일반적으로 관찰됩니다. 따라서 파킨슨병은 서로 상호작용하고 악화시킬 수 있는 여러 질병 기전을 포함하는 것으로 보입니다. 이 기계론적 상호 작용을 조사하는 한 가지 유용한 방법은 중뇌 도파민(mDA) 뉴런의 포괄적인 표현형 지문 또는 프로필을 생성하는 것입니다.

표현형 프로파일링은 측정 가능한 특성의 모음을 기반으로 샘플의 프로필을 생성하는 것과 관련된 접근 방식이며, 둘째, 이 프로필 2,3을 기반으로 샘플에 대한 예측을 수행하는 것을 포함합니다. 프로파일링의 목표는 다양한 특징을 포착하는 것이며, 그 중 일부는 이전에 질병이나 치료와 관련이 없었을 수 있다3. 결과적으로 프로파일링을 통해 예상치 못한 생물학적 과정을 밝힐 수 있습니다. 표현형 프로파일링은 일반적으로 형광 염색된 세포에 의존하며, 표현형 프로파일을 생....

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 뉴런 파종을 위한 배지 및 플레이트 준비(1일차)

  1. Day-1에 뉴런 파종을 위해 플레이트를 준비하려면 사용 직전에 라미닌을 실온(RT)으로 데우십시오. 라미닌 원액(0.1mg/mL)을 차가운 PBS+/+(Ca 2+ 및 Mg2+ 포함)에 1/10로 희석하여 라미닌 용액을 준비합니다.
    알림: 모든 시약은 재료 표에 나열되어 있습니다. 용액 및 완충액의 조성은 표 1-4에 기재되어 있다.
  2. 그런 다음 25μL의 라미닌 용액을 PDL(Poly-D-Lysine) 사전 코팅된 384웰 플레이트의 각 웰에 추가하고 4°C에서 밤새 배양합니다. 코팅된 플레이트는 4°C에서 최대 1주일 동안 보관할 수 있습니다.
    참고: 프로토콜은 여기에서 최대 1주일 동안 일시 중지할 수 있습니다. 플라스틱 필름을 사용하여 플레이트를 밀봉합니다.
  3. 전체 유지보수 매체를 준비하고 4°C에서 최대 1개월 동안 보관합니다(표 1).

2. 뉴런의 해동(0일차)

  1. 0일째에 뉴런을 해동하려면 수조를 37....

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

mDA 뉴런의 표현형 프로파일링은 세포 생물학의 여러 측면과 실험 조절 중 변화를 정량화하는 효율적인 방법입니다. 이 방법론을 예시하기 위해 이 연구에서는 냉동 보존된 LRRK2 G2019S와 건강한 기증자 mDA 뉴런을 사용했습니다. 이 뉴런은 약 37일 동안 분화되었고, 유사분열 후 발현 뉴런 마커(TUBB3 및 MAP2)와 FOXA2와 결합된 티로신 하이드록실라제(TH)를 포함한 도파민성 뉴런 마커인 반면, 신경교세포 마커인 신경교세포섬유산성 단백질(GFAP)은 결여되어있다 14. 설명된 프로토콜에 따라, 두 세포주를 6일 동안 배양하고 LRRK2 키나아제 억제제인 0.1μM PFE-360으로 처리했습니다. 뉴런은 핵 염색 Hoechst와 α-synuclein, TH 및 MAP2에 대한 항체를 사용하여 염색되었습니다(그림 2).

다음으로, 이미지를 분할하고 표현형 특징을 추출했습.......

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

표현형 프로파일링(Phenotypic profiling)은 형광 염색, 현미경 검사, 이미지 분석 등을 적용하여 세포에서 많은 수의 표현형을 측정하는 기술이다3. 표현형 프로파일을 얻고 세포주 또는 기타 실험 조건에서 비교하여 단일 판독값을 사용할 때 눈에 띄지 않을 수 있는 세포 생물학의 복잡한 변화를 이해할 수 있습니다. 여기서는 PD 세포 생물학17,18,19을 모델링하는 데 자주 사용되는 세포 유형인 인간 iPSC 유래 mDA 뉴런에 대한 표현형 프로파일링의 적용에 대해 설명합니다. mDA 뉴런에서의 표현형 프로파일링은 일반적인 형광 염색(generic fluorescent staining)4, 비뉴런 세포 유형(non-neuronal cell type)

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

모든 저자는 Ksilink에 고용되어 있습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 제시된 프로토콜의 설계로 이어지는 귀중한 도움과 토론에 대해 Ksilink의 모든 동료에게 감사의 뜻을 전합니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
안티 치킨 – Alexa 647Jackson ImmunoRearch703-605-155면역형광
아나콘다https://www.anaconda.com/download
Anti-Map2NovusNB300-213면역형
안티마우스 - Alexa 488Thermo FisherA11001면역형광
안티 토끼 - Alexa 555Thermo FisherA21429Immunofluorescence
Anti-Tyrosine HydroxylaseMerckT2928Immunofluorescence
Anti-α-synucleinAbcam138501Immunofluorescence
Bravo Automated Liquid Handling Platform with 384ST headAgilent액체 핸들러를 사용할 수 없는 경우 전자 멀티채널 파이펫을 사용하는 것이 좋습니다.
컨포칼 현미경 YokogawaCV7000이미지 품질의 일관성을 보장하기 위해 자동 컨포칼 형광 현미경을 사용하는 것이 좋습니다.
Countess 자동 세포 계수기Invitrogen파종 전 세포 계수. 수동 계수 챔버를 사용하여 수행할 수도 있습니다.
DPBS +/+Gibco14040-133
EL406 세탁기 디스펜서 세척용 버퍼 BioTek (애질런트) 액체 처리기를 사용할 수 없는 경우 전동 멀티채널 피펫을 사용하는 것이 좋습니다.
포름알데히드 용액 (PFA 16 %)EuromedexEM-15710-S염색 전 고정
Hoechst 33342InvitrogenH3570핵 염색
iCell 베이스 배지 1FujifilmM1010기본 배지
iCell DPN, Donor#01279, Phenotype AHN, lot#106339, 1MFujifilmC1087겉보기에 건강한 기증자
iCell DPN, Donor#11299, 표현형 LRRK2 G2019S, 표현형 PD lot#106139FujifilmC1149Donor carrying LRRK2 G2019S mutation 
iCell 신경계 보충제FujifilmM1031기본 매체용 보충제
iCell 신경 보충제 BFujifilmM1029기본 매체용 보충제
Jupyter Python Notebook데이터에서 표현형 프로필 시각화 및 분류를 수행하기 위한사내 개발https://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfiling
LamininBiolaminaLN521플레이트 코팅
PFE-360MedChemExpressHY-120085LRRK2 키나아제 억제제
PhenoLink이미지 분석을 위한자체 개발https://github.com/Ksilink/PhenoLink
PhenoPlate 384w, PDL 코팅Perkin Elmer6057500세포 배양 및 이미징을 위한 사전 코팅된 플레이트. 이 플레이트를 사용하면 Yokogawa CV7000 현미경의 모든 대물렌즈를 사용하여 모든 웰을 이미징할 수 있습니다.
저장 플레이트 Abgene 120 µ LThermo ScientificAB-0781Vprep 피펫팅 시스템을 사용한 화합물 분주에 필요합니다. 사용할 수 없는 경우 전동 멀티채널 피펫을 사용하는 것이 좋습니다.
TritonSigmaT9284용해 전 투과화
Trypan BlueSigmaT8154-20ML살아있는 세포
Vprep 피펫팅 시스템의 결정 Agilent매체 변경 및 화합물 디스펜싱. 또는 전동 멀티채널 피펫을 사용할 수 있습니다.
광 뉴런용 원시 Notebook. 소프트웨어

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Panicker, N., Ge, P., Dawson, V. L., Dawson, T. M. The cell biology of Parkinson's disease. The Journal of Cell Biology. 220 (4), 202012095(2021).
  2. Caicedo, J. C., et al. Data-analysis strategies for image-based cell profiling. Nature Methods. 14 (9), 849-863 (2017)....

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