방법 논문

중간엽 줄기세포를 이용한 In Vivo Endochondral Ossification Through Integrated Bone Formation

DOI:

10.3791/65573

⸱

2023년 7월 14일

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Craniofacial Embryology, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Tokyo Medical and Dental University, 2Department of Maxillofacial Surgery, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Tokyo Medical and Dental University, 3Department of Regenerative and Reconstructive Dental Medicine, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Tokyo Medical and Dental University

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

중간엽 줄기세포에서 생산된 인공 연골 조직을 이식하여 내연골 골화를 통한 뼈 치료는 기존 치료법의 단점을 우회할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 히알루론산 하이드로겔은 균일하게 분화된 연골 이식편을 확대하고 생체 내에서 융합된 이식편 사이에 혈관을 형성하여 통합된 뼈를 만드는 데 효과적입니다.

초록

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중간엽줄기세포(MSC)를 이용한 기존의 골재생치료는 혈관신생을 유도하는 기전이 없기 때문에 임계치보다 큰 뼈결손에는 적용이 어렵다. MSC로 제작된 인공 연골 조직을 이식하면 내연골 골화(ECO)를 통해 생체 내 혈관신생 및 뼈 형성을 유도합니다. 따라서 이러한 ECO 매개 접근법은 미래에 유망한 뼈 재생 치료법이 될 수 있습니다. 이 ECO 매개 접근법의 임상 적용의 중요한 측면은 뼈 결함을 복구하기 위해 이식할 수 있는 충분한 연골을 준비하기 위한 프로토콜을 수립하는 것입니다. 특히 실제 뼈 결손의 모양과 일치하는 크기의 이식된 연골 덩어리를 설계하는 것은 실용적이지 않습니다. 따라서 이식하는 연골은 여러 조각을 이식할 때 뼈를 일체로 형성하는 성질을 가져야 합니다. 하이드로겔은 임상적 요구 사항을 충족하기 위해 내연골 골화를 위한 조직 공학 이식편을 확장하는 데 매력적인 도구가 될 수 있습니다. 많은 자연 유래 하이드로겔이 in vitro 및 ECO in vivo에서 MSC 연골 형성을 지원하지만, 임상 응용 분야의 요구 사항을 충족하는 최적의 스캐폴드 재료는 아직 결정되지 않았습니다. 히알루론산(HA)은 연골 세포외 기질의 중요한 구성 요소이며 생분해성 및 생체 적합성 다당류입니다. 여기에서 HA 하이드로겔은 MSC 기반 연골 조직의 in vitro 분화를 지원하고 in vivo 내연골 형성을 촉진하는 우수한 특성을 가지고 있음을 보여줍니다.

서론

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자가 뼈는 여전히 외상, 선천적 결함 및 외과적 절제로 인한 뼈 결함을 복구하기 위한 황금 표준입니다. 그러나 자가 골 이식술은 기증자의 통증, 감염 위험, 환자로부터 분리할 수 있는 제한된 골량 등 상당한 한계가 있다 1,2,3,4. 천연 또는 합성 고분자를 인산칼슘 또는 하이드록시아파타이트 5,6과 같은 광물화 물질과 결합한 수많은 생체 재료가 뼈 대체품으로 개발되었습니다. 이러한 공학적 물질의 골 형성은 일반적으로 줄기세포가 막내 골화(intramembrane ossification, IMO) 과정을 통해 조골세포(osteoblast)로 직접 분화할 수 있도록 하기 위해 광물화된 물질을 프라이밍 물질로 사용하여 이루어진다7. 이 과정은 혈관신생 단계가 결여되어 이식편 후 이식편의 생체내 혈관화가 불충분하므로8,9,10 이러한 과정을 이용한 접근법은 큰 뼈 결손을 치료하는 데 최적이 아닐 수 있다 11.

발달 중 골격 형성의 타고난 메커니즘인 내연골 골화(ECO) 과정을 재현하기 위해 적용된 전략은 전통적인 IMO 기반 접근 방식과 관련된 중요한 문제를 극복하는 것으로 나타났습니다. ECO에서 연골 템플릿의 연골 세포는 혈관 내피 성장 인자(VEGF)를 방출하여 혈관 침투 및 연골 템플릿의 뼈12로의 리모델링을 촉진합니다. 골절 복원 중에도 활성화되는 연골 리모델링 및 혈관신생을 통한 골형성에 대한 ECO 매개 접근법은 MSC에서 유래한 인공적으로 생성된 연골 조직을 프라이밍 재료로 사용합니다. 연골세포는 뼈 결손의 저산소증을 견디고, 혈관신생을 유도하며, 혈관이 없는 연골 이식편을 혈관신생 조직으로 전환할 수 있습니다. 수많은 연구에서 MSC 기반 연골 이식편이 이러한 ECO 프로그램 13,14,15,16,17,18,19,20,21을 구현하여 생체 내에서 뼈를 생성한다고 보고되었습니다.

이 ECO 매개 접근법의 임상 적용을 위한 필수 요건은 임상 환경에서 원하는 양의 연골 이식편을 준비하는 방법입니다. 실제 뼈 결손에 맞는 크기의 임상 연골을 준비하는 것은 실용적이지 않습니다. 따라서 이식편 연골은 여러 개의 절편을 이식할 때 뼈를 일체로 형성해야 한다22. 하이드로겔은 내연골 골화(endochondral ossification)를 위한 조직 공학 이식편을 확장하기 위한 매력적인 도구가 될 수 있습니다. 많은 자연 유래 하이드로겔은 시험관 내 MSC 연골 형성 및 생체 내 ECO 23,24,25,26,27,28,29,30,31,32; 그러나 임상 적용 요구 사항을 충족하기 위한 최적의 지지 재료는 아직 결정되지 않았습니다. 히알루론산(HA)은 연골33의 세포외 기질에 존재하는 생분해성 및 생체적합성 다당류입니다. HA는 CD44와 같은 표면 수용체를 통해 MSC와 상호 작용하여 연골 분화 25,26,28,30,31,32,34를 지원합니다. 또한, HA 스캐폴드는 인간 치아 치수 줄기 세포(35)의 IMO 매개 골형성 분화를 촉진하고, 콜라겐과 결합된 스캐폴드는 ECO 매개 골형성(36,37)을 촉진한다.

여기에서, 우리는 골수 유래 성인 인간 MSC를 사용하여 HA 하이드로겔을 제조하는 방법 및 시험관내 비대성 연골형성 및 후속 생체내 내연골 골화에 대한 사용 방법을 제시한다 38. HA의 특성을 MSC를 이용한 골조직공학에 널리 적용되는 물질이자 내연골형성을 위한 인공이식편을 확대하는 데 유용한 물질인 콜라겐의 특성과 비교하였다17. 면역 저하 마우스 모델에서, 인간 MSC로 파종된 HA 및 콜라겐 구조체는 피하 착상에 의해 생체 내 ECO 전위에 대해 평가되었습니다. 그 결과, HA 하이드로겔은 ECO를 통해 뼈를 형성할 수 있는 인공 연골 이식편을 만들기 위한 MSC의 발판으로 탁월하다는 것을 보여줍니다.

프로토콜은 두 단계로 나뉩니다. 먼저, 히알루론산 하이드로겔에 파종된 인간 MSC의 작제물을 제조하여 in vitro에서 비후성 연골로 분화합니다. 다음으로, 분화된 구조체를 누드 모델에 피하 이식하여 생체 내 연골 골화를 유도합니다(그림 1).

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프로토콜

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이 프로토콜은 생후 4주 된 수컷 누드 마우스를 사용합니다. 22-24°C 및 50%-70% 상대 습도에서 12시간 명암주기 하에 케이지에 4마리의 쥐를 수용합니다. 모든 동물 실험은 도쿄 의과 치과 대학 기관 동물 관리 및 이용 위원회가 승인한 지침(승인 ID: A2019-204C, A2020-116A, A2021-121A)에 따라 수행되었습니다.

1. 완충액 및 시약의 준비

  1. MSC 기초 배지에 MSC 성장 배지의 보충 키트를 첨가하여 중간엽 줄기세포 성장 배지(MSC growth medium)를 제조하고 4°C에서 보관합니다.
  2. 배지에 10% 소 태아 혈청(FBS), 50μg/mL 겐타마이신, 200μM L-알라닐-L-글루타민 및 1ng/mL 염기성 섬유아세포 성장 인자를 첨가하여 Dulbecco's Modified Eagle 배지 및 Ham's F12(DMEM/F-12) 배지를 준비하고 4°C에서 보관합니다.
  3. 사용 직전에 DMEM에 1% ITS-G 보충제, 0.12% 소 혈청 알부민, 50μg/mL 겐타마이신, 0.35mM L-프롤린, 100nM 덱사메타손, 10ng/mL TGF-β3를 첨가하여 연골 배지를 준비합니다.
  4. 사용 직전에 DMEM에 10mM β-글리세로포스페이트, 0.12% 소 혈청 알부민, 10nM 덱사메타손, 200μM 아스코르브산염-2-포스페이트, 50nM L-티록신, 50μg/mL 겐타마이신, 50pg/mL IL-1β를 첨가하여 비대 배지를 준비합니다.
  5. 24웰 배양 접시에 60°C에서 예열된 200μL의 녹인 파라핀을 코팅합니다. 파라핀이 굳을 때까지 실온에 두십시오.

2. 인간 MSC의 확대

참고: 실험을 시작하기 전에, MSC 연골형성 가능성이 높은 MSC는17에 기술된 바와 같이 미세 질량 배양에서 선택해야 합니다.

  1. 제조업체의 지침에 따라 5% CO2 및 95% 가습 공기 인큐베이터에서 37°C에서 밀도가 5 x 103 cells/cm2인 10cm 접시에 MSC 성장 배지를 사용하여 1차 인간 골수 유래 MSC(통로 2)를 배양합니다.
  2. 2-3일마다 매체를 교체하십시오. 세포가 80%-90% 밀도에 도달하면 진공 펌프를 사용하여 세포 배양 접시에서 배지를 흡인하고 5mL의 PBS로 세척한 다음 진공 펌프로 용액을 흡인합니다.
  3. 0.05% 트립신/0.02% EDTA 용액 1mL를 접시에 추가합니다. 37 °C에서 5-10분 동안 접시를 배양합니다.
  4. 효소 반응을 중지하기 위해 MSC 성장 배지 1mL를 추가합니다. 세포 현탁액을 50mL 튜브로 옮깁니다.
  5. 50mL 튜브에 다른 접시의 셀 현탁액을 넣고 얼음 위에 보관합니다.
  6. 세포 카운터를 사용하여 세포 현탁액 10μL와 0.4% 트리판 블루 염색 10μL를 혼합하여 세포를 계수합니다.
  7. 나머지 셀 현탁액을 실온에서 220 x g 에서 3분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 mL당 1.0 x 106 세포의 농도로 동결 보존 용액을 추가합니다.
  8. 세포 현탁액 1mL를 각 cryotube에 분주하고 액체 질소로 옮기기 전에 -80°C에서 12시간 동안 보관합니다. 결과 동결 재고(통로 3)가 이 프로토콜에 사용됩니다.
  9. 실험을 위해 5 x 103 cells/cm2의 밀도로 10cm 접시에 비축된 MSC를 시드합니다. DMEM/F-12 배지에서 80%-90%가 합류할 때까지(통로 4) 세포를 배양합니다.

3. MSC 캡슐화된 하이드로겔의 제조

  1. 세포를 트립시화하고 2.3 - 2.6 단계에 설명된 대로 세포 현탁액을 준비합니다.
  2. 10개의 작제물(작제물당 2.5 x 10 5개 세포)을 만들기 위해2.5 x 106 개의 세포를 포함하는 세포 현탁액을 1.5mL 마이크로튜브에 분주합니다.
  3. 서스펜션을 220 x g 에서 3분 동안 원심분리하고 진공 펌프로 상층액을 제거하고 얼음 위에 보관합니다.
  4. 티올 변성 히알루론산(HA), 티올 반응성 교차결합제, 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트 및 가스가 제거된 물병을 실온에 보관합니다.
  5. 멸균 상태에서 바늘이 달린 주사기를 사용하여 HA 함유 병에 1.0mL의 탈기수를 추가합니다(제조업체 지침 참조).
  6. 용액이 맑아질 때까지 소용돌이를 때때로 37°C로 데운 다음 얼음 위에 놓습니다. 고체가 완전히 용해되는 데 30분 미만이 걸립니다.
  7. 멸균 조건에서 바늘이 있는 주사기를 사용하여 0.5mL의 탈기된 물을 가교제 병에 추가합니다. 여러 번 뒤집어 녹인 다음 얼음 위에 놓습니다.
  8. 용해된 HA 용액 120μL를 분취 세포 펠릿(2.5 x 106 세포)에 추가합니다. 앞뒤로 피펫팅하여 세포 펠릿을 재현탁합니다.
  9. HA와 세포가 들어 있는 튜브에 용해된 가교제 용액 30μL를 추가하고(단계 3.8) 튜브를 두드려 결합한 다음 잠시 스핀 다운합니다. HA 솔루션과 가교제 솔루션을 4:1 비율로 결합합니다.
  10. MSC(2.5 x 105 세포)가 포함된 혼합 용액 15μL를 파라핀 코팅된 24웰 플레이트에 떨어뜨리고 37°C에서 30분 동안 응고시킵니다(그림 2). 점도가 높기 때문에 셀/하이드로겔 혼합물을 필요한 양보다 최소 10% 이상 더 준비하십시오.
    참고: 하이드로겔의 특성은 이전에설명되었다 39.

4. In vitro 분화 조건

  1. 0.5mL의 콘드로겐 분화 배지를 MSC 시드 HA 하이드로겔 구성물에 추가합니다. 2-3일마다 매체를 교체하십시오.
  2. 3주 후 비대 분화 배지(웰당 0.5mL)로 전환하고 추가로 2주 동안 작제물을 배양합니다.

5. MSC의 In vivo 이식

  1. 시험관 내 배양의 총 5주 후, 앞서 기술한 바와 같이 누드 마우스의 뒤쪽에 작제물을 피하 착상한다38,40.
  2. 마우스의 체중을 측정하고, 0.75mg/kg 체중(b.w.) 메데토미딘, 4.0mg/kg b.w. 미다졸람, 및 5.0mg/kg b.w. 부토르파놀로 제조된 복합 마취제를38에 기재된 바와 같이 복강내 주사에 의해 투여한다.
  3. 수술 자극에 부동성으로 적절한 마취를 확인하고 수술 중 주기적으로 분홍색 점막의 색으로 느리고 규칙적인 흉부 움직임과 적절한 산소 공급으로 호흡 깊이를 모니터링합니다. 마취 중 건조함을 방지하기 위해 눈에 수의학 연고를 사용하십시오.
  4. 엎드린 자세로 멸균 수술용 드레이프에 마우스를 놓고 50ppm 차아염소산수(pH 5.0; HAW)를 선택하고 마우스 위에 구멍이 뚫린 수술용 드레이프를 놓습니다.
    알림: 오토클레이브, 산화에틸렌 가스 또는 HAW에서 모든 수술 재료를 멸균하십시오. 외과 의사는 손가락을 씻고 수술 가운과 장갑을 착용해야 합니다.
  5. 척추 중심선을 따라 어깨와 엉덩이 부위를 2cm 간격으로 5mm 길이의 피부 절개 2개를 가위로 합니다.
  6. 절개 부위를 통해 주걱을 피하 삽입하여 피하 주머니를 만듭니다.
  7. 2-3개의 작물(각각 ~15μL, 5.1단계)을 겸자로 각 포켓에 삽입합니다. 동일한 포켓에 이식된 HA 구조체는 매우 자주 융합되기 쉽습니다. 융합을 방지하려면 각 포켓에 하나의 HA 구조를 삽입합니다.
  8. 4-0 꼰 실크 봉합사로 절개 부위를 봉합합니다. 기술된 바와 같이 0.75 mg/kg b.w. 아티파메졸로 제조된 마취제에 대한 길항제를 마우스에 주사한다38.
  9. 생쥐가 마취에서 회복되는 동안 사료와 물병이 없는 멸균 바닥 침구가 포함된 멸균 회수 케이지에 생쥐를 넣고 체온, 맥박 및 호흡을 지속적으로 모니터링합니다.
  10. 쥐가 흉골 누운 상태를 유지하기에 충분한 의식을 회복할 때까지 쥐를 방치하지 마십시오. 완전히 회복되면 다른 동물들과 함께 사육실로 돌려보냅니다.
  11. 가능한 합병증이 있는지 치유 기간 동안 이틀에 한 번씩 동물을 모니터링하십시오. 이식 후 4주 및 8주에 거의 고통 없이 이산화탄소 흡입으로 쥐를 안락사시킵니다.
  12. 이식 부위의 피부를 절개하고 집게로 이식된 구조물을 제거합니다. 16시간 동안 4% 파라포름알데히드에 구조물을 고정한 다음 분석을 실시합니다.

6. 통계 분석

  1. 정량적 데이터를 평균 ± 표준 편차(SD)로 보고합니다. 상용 소프트웨어를 사용하여 통계 분석을 수행합니다.
  2. 스튜던트 t-검정 또는 일원 분산 분석을 사용한 후 Tukey의 다중 비교 검정을 사용하여 그룹 간의 유의한 차이를 확인할 수 있습니다. p<0.05와 p<0.01은 두 그룹 간에 유의한 차이를 나타냅니다.

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결과

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MSC-캡슐화된 HA 하이드로겔은 연골 형성41 의 유도인자인 TGFβ3가 보충된 연골 형성 배지에서 배양하였다(단계 4.1). HA의 특성을 콜라겐의 특성과 비교했는데, 콜라겐은 앞서 설명한 바와 같이 내연골 골화를 위한 MSC 기반 인공 연골 이식편을 만드는 데 효과적인 것으로 나타났습니다38. 미분화 MSC는 골형성 분화(즉, 막내 골화)에 의해 뼈를 생성하기 위해 프라이밍 기질로 광물화된 표면이 필요하다는 것이 입증되었기 때문에 이 연구에서 음성 대조군으로 포함되지 않았습니다7.

히알루론안 하이드로겔의 크기는 도립 현미경으로 측정한 직경을 기준으로 판단했을 때 체외 배양 기간 내내 변하지 않은 반면, 비교에 사용된 콜라겐 하이드로겔은 배양이 시작된 직후 줄어들기 시작했습니다. 시험관 내 배양 후 HA와 콜라겐 구조...

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토론

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비후성 연골에서 뼈로의 전환을 촉진하는 적절한 스캐폴드 재료를 사용하는 것은 MSC 기반 엔지니어링 비대성 연골 이식편을 확장하고 임상적으로 중요한 크기의 뼈 결함을 치료하는 유망한 접근 방식입니다. 여기에서, 우리는 HA가 시험관내에서 MSC 기반 비대성 연골 조직의 분화를 지원하고 생체내에서 내연골골 형성을 촉진하는 우수한 스캐폴드 물질임을 보여준다 38. 더욱이, 생체내에서, HA 구조체는 하나의 통합된 뼈를 형성하기 위해 동일한 포켓에 이식된 다수의 구조체의 융합을 촉진하는 것으로 나타났다. MSC와 스캐폴드 재료의 상호 작용은 연골 및 비후성 연골 형성에 큰 영향을 미치기 때문에 ECO에 적합한 스캐폴드 재료를 선택하는 것은 임상적으로 효과적인 조직 공학 연골 이식편을 생성하는 데 중요합니다. HA 하이드로겔에 매립된 세포는 중앙에서 주변부로 연골세포의 둥근 형태 특성을 균일하게 나타내며, 이는 히알루론산이 하이드로겔 전체에 걸쳐...

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공개 사항

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저자들은 상충되는 이해관계가 존재하지 않는다고 선언했다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 일본과학진흥회(JSPS)의 과학연구지원금(KAKENHI)의 지원을 받았습니다. JP19K10259 및 22K10032에서 MAI로).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.25w/v% 트립신-1mmol/L EDTA.4Na 용액FUJIFILM Wako Pure Chemical 209-16941
AntisedanNippon Zenyaku Kogyo
아스코르브산염-2-인산Nacalai Tesque13571-14
BambankerGC LymphotecCS-02-001
기본 섬유아세포 성장 인자ReprocellRCHEOT002 
소 세럼 알부민FUJIFILM Wako Pure Chemical 012-238817.5 w/v%
Countess 자동 세포 카운터, 세포 계수 챔버 슬라이드 및 Trypan Blue 염색 0.4%InvitrogenC10283
덱사메타손, MerckD8893
DomitorNippon Zenyaku Kogyo
DormicumAstellas Pharma
Dulbecco's Modified Eagle MediumMerckD6429고포도
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 HamMerckD6421
Fetal bovine serumHycloneSH30396.03
Gentamicin sulfateFUJIFILM Wako Pure Chemical 1676045  10 mg/mL
Haccpper 발전기TechnoMaxCH-400-5QB50 ppm 하이포아염소산 물
인간 중간엽 줄기 세포LonzaPT-2501
HyStem 세포 배양 스캐폴드 키트MerckHYS020
IL-1ßPeproTechAF-200-01B
ITS-G 보충제FUJIFILM Wako Pure Chemical 090-06741&타임스; 100
L-Alanyl-L-GlutamineFUJIFILM Wako 순수 화학제품 016-21841200mmol/L (× 100)
L-프롤린Nacalai Tesque29001-42
L-ThyroxineMerckT1775
MSCGM 중간엽 줄기 세포 성장 매체
BulletKit		LonzaPT-3001
파라핀FUJIFILM Wako Pure Chemical 165-13375
PBS / pH7.4 100ml메디카고09-2051-100
TGF-&베타; 3 ProteintechHZ-1090
VetorphaleMeiji Seika Kaisha
Visiocare 연고SAVAVET/SAVA Healthcare
β-글리세로인산염 FUJIFILM Wako Pure Chemical TEL.048-34332
염 당

참고문헌

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