Method Article

중간엽 줄기세포를 이용한 In Vivo Endochondral Ossification Through Integrated Bone Formation

DOI:

10.3791/65573

⸱

July 14th, 2023

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Craniofacial Embryology, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Tokyo Medical and Dental University, 2Department of Maxillofacial Surgery, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Tokyo Medical and Dental University, 3Department of Regenerative and Reconstructive Dental Medicine, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Tokyo Medical and Dental University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

중간엽 줄기세포에서 생산된 인공 연골 조직을 이식하여 내연골 골화를 통한 뼈 치료는 기존 치료법의 단점을 우회할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 히알루론산 하이드로겔은 균일하게 분화된 연골 이식편을 확대하고 생체 내에서 융합된 이식편 사이에 혈관을 형성하여 통합된 뼈를 만드는 데 효과적입니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

중간엽줄기세포(MSC)를 이용한 기존의 골재생치료는 혈관신생을 유도하는 기전이 없기 때문에 임계치보다 큰 뼈결손에는 적용이 어렵다. MSC로 제작된 인공 연골 조직을 이식하면 내연골 골화(ECO)를 통해 생체 내 혈관신생 및 뼈 형성을 유도합니다. 따라서 이러한 ECO 매개 접근법은 미래에 유망한 뼈 재생 치료법이 될 수 있습니다. 이 ECO 매개 접근법의 임상 적용의 중요한 측면은 뼈 결함을 복구하기 위해 이식할 수 있는 충분한 연골을 준비하기 위한 프로토콜을 수립하는 것입니다. 특히 실제 뼈 결손의 모양과 일치하는 크기의 이식된 연골 덩어리를 설계하는 것은 실용적이지 않습니다. 따라서 이식하는 연골은 여러 조각을 이식할 때 뼈를 일체로 형성하는 성질을 가져야 합니다. 하이드로겔은 임상적 요구 사항을 충족하기 위해 내연골 골화를 위한 조직 공학 이식편을 확장하는 데 매력적인 도구가 될 수 있습니다. 많은 자연 유래 하이드로겔이 in vitro 및 ECO in vivo에서 MSC 연골 형성을 지원하지만, 임상 응용 분야의 요구 사항을 충족하는 최적의 스캐폴드 재료는 아직 결정되지 않았습니다. 히알루론산(HA)은 연골 세포외 기질의 중요한 구성 요소이며 생분해성 및 생체 적합성 다당류입니다. 여기에서 HA 하이드로겔은 MSC 기반 연골 조직의 in vitro 분화를 지원하고 in vivo 내연골 형성을 촉진하는 우수한 특성을 가지고 있음을 보여줍니다.

Introduction

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자가 뼈는 여전히 외상, 선천적 결함 및 외과적 절제로 인한 뼈 결함을 복구하기 위한 황금 표준입니다. 그러나 자가 골 이식술은 기증자의 통증, 감염 위험, 환자로부터 분리할 수 있는 제한된 골량 등 상당한 한계가 있다 1,2,3,4. 천연 또는 합성 고분자를 인산칼슘 또는 하이드록시아파타이트 5,6과 같은 광물화 물질과 결합한 수많은 생체 재료가 뼈 대체품으로 개발되었습니다. 이러한 공학적 물질의 골 형성은 일반적으로 줄기세포가 막내 골화(intramembrane ossification, IMO) 과정을 통해 조골세포(osteoblast)로 직접 분화할 수 있도록 하기 위해 광물화된 물질을 프라이밍 물질로 사용하여 이루어진다7. 이 과정은 혈관신생 단계가 결여되어 이식편 후 이식편의 생체내 혈관화가 불충분하므로8,9,10 이러한 과정을 이용한 접근법은 큰 뼈 ....

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Protocol

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이 프로토콜은 생후 4주 된 수컷 누드 마우스를 사용합니다. 22-24°C 및 50%-70% 상대 습도에서 12시간 명암주기 하에 케이지에 4마리의 쥐를 수용합니다. 모든 동물 실험은 도쿄 의과 치과 대학 기관 동물 관리 및 이용 위원회가 승인한 지침(승인 ID: A2019-204C, A2020-116A, A2021-121A)에 따라 수행되었습니다.

1. 완충액 및 시약의 준비

  1. MSC 기초 배지에 MSC 성장 배지의 보충 키트를 첨가하여 중간엽 줄기세포 성장 배지(MSC growth medium)를 제조하고 4°C에서 보관합니다.
  2. 배지에 10% 소 태아 혈청(FBS), 50μg/mL 겐타마이신, 200μM L-알라닐-L-글루타민 및 1ng/mL 염기성 섬유아세포 성장 인자를 첨가하여 Dulbecco's Modified Eagle 배지 및 Ham's F12(DMEM/F-12) 배지를 준비하고 4°C에서 보관합니다.
  3. 사용 직전에 DMEM에 1% ITS-G 보충제, 0.12% 소 혈청 알부민, 50μg/mL 겐타마이신, 0.35mM L-프롤린, 100nM 덱사메타손, 10ng/mL TGF-β3를 첨가하여 연골 배지를 준비합니다.
  4. 사용 직전에 DME....

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Results

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MSC-캡슐화된 HA 하이드로겔은 연골 형성41 의 유도인자인 TGFβ3가 보충된 연골 형성 배지에서 배양하였다(단계 4.1). HA의 특성을 콜라겐의 특성과 비교했는데, 콜라겐은 앞서 설명한 바와 같이 내연골 골화를 위한 MSC 기반 인공 연골 이식편을 만드는 데 효과적인 것으로 나타났습니다38. 미분화 MSC는 골형성 분화(즉, 막내 골화)에 의해 뼈를 생성하기 위해 프라이밍 기질로 광물화된 표면이 필요하다는 것이 입증되었기 때문에 이 연구에서 음성 대조군으로 포함되지 않았습니다7.

히알루론안 하이드로겔의 크기는 도립 현미경으로 측정한 직경을 기준으로 판단했을 때 체외 배양 기간 내내 변하지 않은 반면, 비교에 사용된 콜라겐 하이드로겔은 배양이 시작된 직후 줄어들기 시작했습니다. 시험관 내 배양 후 HA와 콜라겐 구조.......

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

비후성 연골에서 뼈로의 전환을 촉진하는 적절한 스캐폴드 재료를 사용하는 것은 MSC 기반 엔지니어링 비대성 연골 이식편을 확장하고 임상적으로 중요한 크기의 뼈 결함을 치료하는 유망한 접근 방식입니다. 여기에서, 우리는 HA가 시험관내에서 MSC 기반 비대성 연골 조직의 분화를 지원하고 생체내에서 내연골골 형성을 촉진하는 우수한 스캐폴드 물질임을 보여준다 38. 더욱이, 생체내에서, HA 구조체는 하나의 통합된 뼈를 형성하기 위해 동일한 포켓에 이식된 다수의 구조체의 융합을 촉진하는 것으로 나타났다. MSC와 스캐폴드 재료의 상호 작용은 연골 및 비후성 연골 형성에 큰 영향을 미치기 때문에 ECO에 적합한 스캐폴드 재료를 선택하는 것은 임상적으로 효과적인 조직 공학 연골 이식편을 생성하는 데 중요합니다. HA 하이드로겔에 매립된 세포는 중앙에서 주변부로 연골세포의 둥근 형태 특성을 균일하게 나타내며, 이는 히알루론산이 하이드로겔 전체에 걸쳐.......

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Disclosures

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저자들은 상충되는 이해관계가 존재하지 않는다고 선언했다.

Acknowledgements

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이 연구는 일본과학진흥회(JSPS)의 과학연구지원금(KAKENHI)의 지원을 받았습니다. JP19K10259 및 22K10032에서 MAI로).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.25w/v% 트립신-1mmol/L EDTA.4Na 용액FUJIFILM Wako Pure Chemical 209-16941
AntisedanNippon Zenyaku Kogyo
아스코르브산염-2-인산Nacalai Tesque13571-14
BambankerGC LymphotecCS-02-001
기본 섬유아세포 성장 인자ReprocellRCHEOT002 
소 세럼 알부민FUJIFILM Wako Pure Chemical 012-238817.5 w/v%
Countess 자동 세포 카운터, 세포 계수 챔버 슬라이드 및 Trypan Blue 염색 0.4%InvitrogenC10283
덱사메타손, MerckD8893
DomitorNippon Zenyaku Kogyo
DormicumAstellas Pharma
Dulbecco's Modified Eagle MediumMerckD6429고포도
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 HamMerckD6421
Fetal bovine serumHycloneSH30396.03
Gentamicin sulfateFUJIFILM Wako Pure Chemical 1676045  10 mg/mL
Haccpper 발전기TechnoMaxCH-400-5QB50 ppm 하이포아염소산 물
인간 중간엽 줄기 세포LonzaPT-2501
HyStem 세포 배양 스캐폴드 키트MerckHYS020
IL-1ßPeproTechAF-200-01B
ITS-G 보충제FUJIFILM Wako Pure Chemical 090-06741&타임스; 100
L-Alanyl-L-GlutamineFUJIFILM Wako 순수 화학제품 016-21841200mmol/L (× 100)
L-프롤린Nacalai Tesque29001-42
L-ThyroxineMerckT1775
MSCGM 중간엽 줄기 세포 성장 매체
BulletKit		LonzaPT-3001
파라핀FUJIFILM Wako Pure Chemical 165-13375
PBS / pH7.4 100ml메디카고09-2051-100
TGF-&베타; 3 ProteintechHZ-1090
VetorphaleMeiji Seika Kaisha
Visiocare 연고SAVAVET/SAVA Healthcare
β-글리세로인산염 FUJIFILM Wako Pure Chemical TEL.048-34332
염 당

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Goldberg, V. M., Stevenson, S. Natural history of autografts and allografts. Clinical Orthopaedics and Related Research. (225), 7-16 (1987).
  2. Amini, A. R., Laurencin, C. T., Nukavarapu, S. P. Bone tissue engineering: recent advances and challenges. Critical Reviews....

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Endochondral OssificationMesenchymal Stem CellsBone RegenerationArtificial CartilageHyaluronic Acid HydrogelsCartilage DifferentiationIn Vivo Bone FormationChondrogenic DifferentiationScaffold MaterialsAngiogenesis Induction

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