이 연구는 밀도 구배 원심분리(DGC)를 통해 인간의 대변에서 농축된 박테리아 세포외 소포체(BEV)를 분리 및 정제하는 방법을 설명하고, 형태, 입자 크기 및 농도에서 BEV의 물리적 특성을 식별하고, 임상 및 과학 연구에서 DGC 접근 방식의 잠재적 응용 분야에 대해 논의합니다.
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방법 논문
Density Gradient Centrifugation을 사용한 인간 대변에서 박테리아 세포외 소포의 분리 및 정제
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
박테리아 세포외 소포체(BEV)는 박테리아-박테리아 및 박테리아-숙주 통신에 적극적인 역할을 하는 박테리아에서 파생된 나노소포체로, 모체 박테리아에서 물려받은 단백질, 지질 및 핵산과 같은 생체 활성 분자를 전달합니다. 장내 미생물군에서 유래한 BEV는 위장관 내에서 영향을 미치고 멀리 떨어진 장기에 도달할 수 있어 생리학 및 병리학에 상당한 영향을 미칩니다. 인간의 대변에서 유래한 BEV의 유형, 수량 및 역할을 탐구하는 이론적 연구는 장내 미생물군에서 BEV의 분비와 기능을 이해하는 데 매우 중요합니다. 이러한 조사는 또한 BEV를 분리하고 정제하기 위한 현재 전략의 개선을 필요로 합니다.
이 연구는 하향식(Top-down)과 상향식(Bottom-up)의 두 가지 밀도 구배 원심분리(DGC) 모드를 설정하여 BEV의 분리 및 정제 프로세스를 최적화했습니다. BEV의 농축 분포는 분획 6 내지 8(F6-F8)로 결정하였다. 접근법의 효과는 입자 형태, 크기, 농도 및 단백질 함량을 기반으로 평가되었습니다. 입자 및 단백질 회수율을 계산하고 특정 마커의 존재를 분석하여 두 DGC 모드의 회수율과 순도를 비교했습니다. 그 결과 하향식 원심분리 모드는 오염 수준이 낮고 상향식 모드와 유사한 회수율과 순도를 달성한 것으로 나타났습니다. 7시간의 원심분리 시간은 108/mg의 분변 BEV 농도를 달성하기에 충분했습니다.
대변 외에도 이 방법은 성분과 점도의 차이에 따라 적절하게 수정하여 다른 체액 유형에 적용할 수 있습니다. 결론적으로, 이 상세하고 신뢰할 수 있는 프로토콜은 BEV의 표준화된 분리 및 정제를 용이하게 하여 후속 다중 오믹스 분석 및 기능 실험을 위한 토대를 마련할 것입니다.
서론
소화관은 인체에서 가장 풍부한 미생물 군집을 보유한 기관으로 널리 알려져 있으며, 박테리아의 90% 이상이 집락 형성 및 증식에 관여합니다 1,2. 장내 미생물총(microbiota)이 장내 미세환경을 조절하고 동시에 주로 손상된 장 장벽(intestal barrier)을 통해 멀리 떨어진 장기의 기능 장애와 상호 작용한다는 광범위한 증거가 입증되었습니다 3,4. 장내 미생물군의 불균형과 염증성 장 질환(IBD)5,6 및 장-뇌 축 을 통한 인지 장애(5,6,7,8)의 진행 사이에 상관관계가 있다는 증거가 늘어나고 있습니다. 박테리아에 의해 생성되는 박테리아 세포외 소포체(BEV)는 이러한 병리학적 과정에서 중요한 역할을 합니다.
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프로토콜
남방의과대학 난팡병원 윤리위원회는 참가자들의 사전 동의 하에 진행된 이 연구를 승인했다. 여기에 사용된 모든 방법은 국제 인간 마이크로바이옴 표준(IHMS: http://www.microbiome-standards.org/)에서 제공하는 표준 운영 지침을 준수했습니다. 이후의 모든 액체 취급 절차는 생물 안전 캐비닛 또는 매우 깨끗한 벤치 내에서 수행되어야 했습니다.
1. 분변 샘플의 채취 및 분취
- 대변 샘플러, 밀봉된 백, 아이스 박스를 배포하고 참가자들에게 샘플을 조달하고 보존하는 방법에 대한 포괄적인 지침을 제공합니다.
- 각 참가자에게 제공된 샘플러를 사용하여 대변 샘플을 수집하고 24시간 이내에 4°C의 온도로 실험실로 운송하도록 지시합니다.
- 실험실에서 수령하면 멸균 스푼을 사용하여 3.5g 미만의 대변을 미리 칭량된 50mL 원심분리 튜브에 분주합니다. 후속 전처리 절차를 위해 튜브에 대변 샘플의 무게를 기록합니다.
일시 중지 지점: 샘플을 즉시 처리할 수 없는 경우 적절한 표기 후 -80°C에서 장기 보관을 위해 샘플을 할당합니다.
2. 대변 시료 전처리
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결과
BEV 농축 분획의 분포 결정
박테리아 세포외 소포체(BEV)-농축 분획물의 분포를 결정하기 위해, OD 340nm에서 흡광도 값을 측정하기 위해 블랭크 대조군을 설정하고, 측정 및 요오드화놀 가이드라인을 기반으로 각 분획의 밀도를 계산하였다(단계 8.1). 표 2 는 밀도 결과를 제시하며, 분획 F4 내지 F9가 전형적으로 세포외 소포체와 관련된 범위 내에서 밀도를 나타낸다는 것을 보여줍니다. 이 발견은 대부분의 BEV가 이러한 분획에서 분리되어 F4-F9를 BEV의 대략적인 범위로 정의했음을 시사합니다. 투과 전자 현미경(TEM)을 사용하여 그림 1 에서 분획 F4-F9로 표시된 것처럼 분리된 분변 BEV의 형태학적 특징을 특성화했습니다. TEM 이미지(그림 2)는 BEV의 특징인 고전적인 컵 모양의 구조의 존재를 보여주었습니다. 나노 입자 추적 분석(N.......
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토론
박테리아 세포외 소포체(BEV)는 박테리아가 분비하는 지질-이중층 나노입자로, 풍부한 단백질, 지질, 핵산 및 기타 생체 활성 분자를 운반하여 박테리아20의 기능적 효과를 매개하는 데 기여합니다. 장에서 유래한 BEV는 염증성 장 질환, 크론병, 대장암과 같은 질병의 발병에 관여하고 일반적인 대사에 영향을 미치고 인지 기능 장애를 중재하는 것으로 확인되었습니다 4,16,17,20,21,22,23,24,25,26 <.......
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공개 사항
저자는 상충되는 이해관계가 없음을 선언한다.
감사의 글
이 연구는 저명한 젊은 학자를 위한 국립 과학 기금(National Science Fund for Distinguished Young Scholars, 82025024)의 지원을 받았습니다. 중국 국립 자연 과학 재단 (82230080)의 핵심 프로젝트; 중국 국가 핵심 R&D 프로그램(2021YFA1300604); 중국 국립 자연 과학 재단 (81871735, 82272438 및 82002245); 저명한 젊은 학자를 위한 광둥성 자연과학 기금(2023B1515020058); 광둥성 자연과학재단(2021A1515011639); 중국 산둥성 자연과학재단의 주요 국가 기초 연구 개발 프로그램(ZR2020ZD11); 박사후 과학 재단(2022M720059); 남부 의과 대학 Nanfang 병원의 뛰어난 청소년 개발 계획(2022J001).
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
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| 1 % (w/v) 글루타르알데히드(탈이온수 내 2.5% 원액으로 제조) | ACMEC | AP1126 | 8.3.3단계에서 TEM을 사용한 BEV에 대한 형태학적 관찰 |
| 1%(w/v) 메틸셀룰로오스(탈이온수 내 원래 분말로 준비) | Sigma-Aldrich | M7027 | 8.3.6단계에서 TEM을 사용한 BEV에 대한 형태학적 관찰 |
| 1.5%(w/v) 우라닐 아세테이트(탈이온수 내 원래 분말로 준비) | Polysciences | 21447-25 | 8.3.5 단계에서 TEM을 사용한 BEV에 대한 형태학적 관찰 |
| 1000 μ L, 200 &뮤; L, 10 &뮤; L 피펫 | KIRGEN | KG1313, KG1212, KG1011 | 용액 |
| 5 % (w / v) 소 혈청 알부민 용액 (TBST 완충액의 원래 분말에서 준비) | Fdbio science | FD0030 | 8.5.6 단계 5 ×에서 차단을 위해 웨스턴 블로팅에 사용 |
| ; 로딩 버퍼 | Fdbio science | FD006 | 8.5.1 단계에서 웨스턴 블로팅 및 Coomassie 브릴리언트 블루 염색에 사용 |
| 75 % (v / v) 알코올 | LIRCON | LIRCON-500 mL | 표면 소독 |
| 96-웰 플레이트 | Rar | A8096 | 흡광도 값을 측정합니다 |
| Anti-Calnexin 항체 | Abcam | ab92573 | Western blotting (Primary 항체) |
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| Anti-CD9 항체 | Abcam | ab236630 | Western blotting (1차 항체) |
| Anti-Flagellin 항체 | Sino Biological | 40067-MM06 | Western blotting (1차 항체) |
| Anti-Integrin beta 1 항체 | Abcam | ab30394 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-LPS antibody | Thermo Fisher | MA1-83152 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-LTA antibody | Thermo Fisher | MA1-7402 | 웨스턴 블로팅 (1차 항체) |
| 안티-옴피 항체 | CUSABIO | CSB-PA359226ZA01EOD, https://www.cusabio.com/ | 웨스턴 블로팅 (1차 항체) |
| 안티 신테닌 항체 | Abcam | ab133267 | 웨스턴 블로팅 (1차 항체) |
| Anti-TSG101 항체 | Abcam | ab125011 | 웨스턴 블로팅 (1차 항체) |
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| 킴와이프스&트레이드; 섬세한 작업 닦음 | Kimtech Science | 34155 | 단계에서 초원심분리기 튜브의 내벽을 닦습니다. 4.15 |
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| 저온 냉동고 (-80 ° C) | Haier | DW-86L338J | 샘플 저장 |
| 메탄올 | Alalddin | M116118 | 단계에서 PVDF 멤브레인을 활성화하기 위해 웨스턴 블로팅에 사용 |
| 마이크로 튜브 1.5mL | KIRGEN | KG2211 | 밀도 구배 원심분리 후 분획 회수 |
| 마이크로 튜브 2mL | KIRGEN | KG2911 | 밀도 구배 원심분리 후 분획 회수 |
| Micro 튜브 5 mL | BBI | F610888-0001 | 밀도 구배 원심분리 후 분획 회수 |
| 마이크로플레이트 리더 | 써모 피셔 | Multiskan MK3 | 8.2 단계에서 BEV의 단백질 함량 측정 |
| Millipore 필터 0.22 μ m | Merck 밀리포어 | SLGP033RB | 여과 살균; 재질 : 폴리 에테르 설폰, PES |
| NaCl | GHTECH | 1.01307.040 | 밀도 구배 원심 분리 용액 |
| NaOH | GHTECH | 1.01394.068 | 밀도 구배 원심 분리 용액 (pH 조정) |
| Optima ™ XPN-100 | Beckman Coulter | A94469 | 4, 7단계에서 BEV 분리를 위한 초원심분리 |
| OptiPrep™ | Serumwerk Bernburg AG | 1893 | 밀도 구배 원심 분리 원액 |
| Orbital Shaker | Youning | CS-100 | 2 단계에서 대변 용해 |
| 인산염 완충 식염수 | Procell | PB180327 | 2 단계에서 대변 용해 |
| 피펫터 | Eppendorf | 3120000267, 3120000259 | 용액 이송 |
| 플라스틱 파스퇴르 피펫 | ABCbio | ABC217003-4 | 단계에서 전처리 시 상등액 제거 3.4 |
| 폴리비닐리덴 디플루오라이드 (PVDF) 막 | Millipore | ISEQ00010, IPVH00010 | 8.5.5 단계에서 단백질 전달을 위한 웨스턴 블로팅에 사용 |
| 사전 제작된 폴리아크릴아미드 겔, 4– 20% 15 Wells | ACE | F15420Gel | 8.5.2, 8.5.3단계에서 단백질 분리를 위한 웨스턴 블로팅에 사용 |
| 차 항체 희석제 | Fdbio science | FD0040 | 8.5.8단계에서 웨스턴 블로팅에 사용 |
| 단백질 사다리 | Fdbio science | FD0672 | 8.5단계에서 웨스턴 블로팅 및 Coomassie brilliant blue stain에 사용 |
| 빠른 단백질 블로팅 용액 | UBIO | UW0500 | 8.5.5단계에서 단백질 전달을 위한 웨스턴 블로팅에 사용됨 |
| Rotor SW 32 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 369650 | 초원심분리는 Step 4, 7 |
| Syringe 20 mL, 50 mL에서 | Jetway | ZSQ-20ML, YCXWJZSQ-50 mL | 전송 버퍼는 TBS 분말을 사전 처리하면서 상층액을 제거합니다 |
| Fdbio science | FD1021 | Hitachi에서 웨스턴 블로팅에 사용됩니다 | |
| . | H-7650 | 8.3단계에서 BEV에 대한 형태학적 관찰 | |
| Tween-20 | Fdbio 과학 | FD0020 | 8.5단계에서 웨스턴 블로팅에 사용 |
| 초원심분리기 튜브 | Beckman | 326823, 355642 | 4, 7단계에서 BEV 격리를 위한 초원심분리 |
| 울트라클린 벤치 | AIRTECH | SW-CJ-2FD | 에 대한 절차 수행 |
| CU600 | 8.2.5단계에서 BEV의 단백질 함량 측정에 사용됨 | ||
| ZetaView | Particle Metrix | S/N 21-734, 소프트웨어 ZetaView(버전 8.05.14 SP7) | 8.4단계에서 BEV의 입자 크기 및 농도를 측정하기 위한 나노 입자 추적 분석(NTA) |
참고문헌
- Costello, E. K., et al. Bacterial community variation in human body habitats across space and time. Science. 326 (5960), 1694-1697 (2009).
- Greenhalgh, K., Meyer, K. M., Aagaard, K. M., Wilmes, P. The human gut microbiome in healt....
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