Oronasal Fistula 마우스 모델 구축

구강과 비강 사이의 비정상적인 개구부인 구강 누공(ONF)은 임상적으로 치조돌기에서 목젖까지의 구조적 부위의 결함으로 나타나며, 일반적으로 구개열 복구 후 합병증으로 발생한다¹. ONF 환자는 음식 역류, 조음 장애 및 속도 인두 기능 장애를 경험하여 삶의 질에 상당한 영향을 미칩니다 ^2,3,4. 수술 후 ONF의 비율은 2.4%에서 55%까지 갈라진 틈, Veau 유형 및 수술 방법 5,6,7,8과 같은 요인으로 인해 다양합니다. 또한 ONF 수리 후 재발률은 0%에서 43^%9 사이로 높습니다.

최근 ONF 분야에서 다양한 재료, 약물 및 새로운 기술 10,11,12,13,14,15,16,17을 포함한 몇 가지 새로운 치료법이 가능성을 보여주었습니다. 치료 효과에 대한 정확한 평가는 ONF 치료제를 선택하고 추가로 개발하기 위한 기초를 제공하기 때문에 필수적입니다. 그러나 수술 이외의 치료 효과에 대해 단기적으로 유효한 평가를 얻는 것은 환자마다 ONF의 특성이 다르기 때문에 어렵습니다. 따라서 이러한 치료 방법의 효과를 검증하기 위해서는 ONF 질환 모델을 확립하는 것이 필요합니다.

수십 년 동안 연구자들은 쥐^18,19, 새끼 돼지 20,21, 미니피그²² 및 개 ²³을 포함한 다양한 동물 종에서 구강 누공(ONF) 모델을 생성했는데^, 이는 이러한 종들이 외과적 조작에 적합한 상당한 경구개를 가지고 있기 때문입니다. 그러나 마우스는 인간과 유사한 유전자 서열과 전체 게놈을 가지고 있어 신약 연구 및 개발에 중요한 모델이 된다^24,25,26. 더욱이, 마우스는 배치 간에 거의 변동이 없기 때문에 ONF 모델^12,13,27을 확립하는 데 유리한 선택이 된다.

다만, ONF를 생성하기 위한 자세한 단계는 설명되지 않았으며, ONF 크기의 안정성은 고려되지 않았다. 또한, ONF 형성의 검증은 구강과 비강 사이의 직접적인 통신을 보장하지 않고 관찰²⁸에만 의존하였다. ONF로 인한 섭식 장애로 인한 쥐의 체중 감소와 같은 다른 수단을 통해 입증되지 않았습니다. 또한, 상처 크기의 정상적인 변화는 고려되지 않았으며, 이는 상처 치유를 촉진하거나 억제하는 약물 또는 물질에 대한 연구에 매우 중요합니다. 따라서 안정적이고 검증된 ONF 모델을 구축할 필요성이 강합니다.

이 연구의 목적은 이 프로토콜이 구개 상처 치유 메커니즘 및 ONF에 대한 새로운 치료에 대한 향후 연구의 기초가 되기를 희망하면서 앞서 언급한 문제를 해결하는 실용적인 ONF 모델을 개발하는 것이었습니다.

이 연구의 모든 동물 시술은 쓰촨 대학교 중국 서부 구강 의학 학교 윤리 위원회의 검토 및 승인을 받았습니다. 본 연구에는 성체 C57BL/6 마우스(암컷)가 사용되었습니다.

1. 수술 준비

1. 발아기, 안과 소작, 미세 수술 가위, 미세 수술 핀셋, 주사기 및 바늘(26g x 0.63인치)(그림 1A, B)과 같은 절차에 필요한 수술 기구를 수집합니다( 재료 표 참조).
   알림: 수술 전에 안과 소작, 미세 수술 핀셋 및 미세 수술 가위를 포함한 수술 기구를 102.9kPa(1.05kg/^cm2) 및 121°C에서 20분 동안 고압멸균합니다.
2. 수술용 커튼, 라텍스 장갑, 멸균 면, 멸균 시트, 멸균 금속 호일, 수술 플랫폼용 폼 보드, 고무 밴드(의료용 라텍스 장갑을 찢어 얻을 수 있음) 및 테이프(그림 1C)와 같은 필요한 수술 용품을 수집합니다( 재료 표 참조).
   알림: 수술 현장용 주사기 및 멸균 시트를 포함하여 각 마우스에 대해 별도의 소모품 세트를 사용하십시오.
3. 알코올 물티슈를 사용하여 수술 부위와 장치(광원, 폼 보드 및 온도 유지 장치, 재료 표 참조)를 청소하십시오. 절차 중에 필요할 수 있는 기구의 손잡이와 손잡이를 멸균 금속 호일로 덮습니다.
4. 개별 기구를 무균 상태로 열고 수술 부위에 조심스럽게 배치합니다. 발아기( 재료 표 참조)와 절차 중에 사용할 조명을 활성화하십시오. 안과 소작기를 발아기에 넣고 250°C에서 20분 동안 가열합니다.

2. 수술 절차

1. 마우스를 고정하고 아래 단계에 따라 구강을 엽니다.
   1. 체중이 20-25g이고 생후 8-12주인 암컷 C57BL/6J 마우스를 선택합니다. 절차를 수행하기 전에 마우스를 7일 동안 보관하십시오.
   2. Zoletil50(80mg/kg) 및 자일라진(5mg/kg)의 복강내 주사로 마우스를 마취합니다( 재료 표 참조). 쥐의 눈에 안과 연고를 바릅니다. 발가락 꼬집기 반응이 없을 때까지 기다리십시오.
      알림: 마우스가 독립적으로 뒤집을 수 없는 경우 절차를 수행할 준비가 된 것입니다.
   3. 멸균 시트가 깔린 폼 보드에 마우스를 고정합니다. 테이프를 사용하여 마우스를 누운 자세로 수술 플랫폼에 묶습니다(그림 2A).
   4. 쥐의 구강을 엽니다. 두 개의 바늘(26g x 0.63인치)을 안와 외이면 앞에 놓고 두 개를 더 놓습니다. 바늘 주위에 고무 밴드를 놓고 앞니를 교차시켜 입을 벌립니다. 미세 수술용 핀셋을 사용하여 입 모서리를 받쳐 엽니다(그림 2B).
      알림: 경구개가 명확하게 노출되어 있는지 확인하십시오. 텅을 고무 밴드 아래에 고정하여 시야를 방해하고 후속 실험 중에 화상을 입는 것을 방지합니다.
2. 경구개에 구강 누공(ONF)을 만듭니다(그림 3A-F).
   1. 250분 동안 20°C로 가열된 안과 소작을 회수합니다. 입천장 정중선과 첫 번째 소구치 선의 교차점에서 1mm 떨어진 곳에 소작 팁을 놓아 정중선의 경구개에 전체 두께 점막 손상을 만듭니다.
      알림: 쥐의 혀에 화상을 입히지 마십시오.
   2. 몇 초 후 소작 끝 주위의 점막이 하얗게 변하면 안과 소작기를 제거합니다.
   3. 안과 소작기를 발아기에 넣고 250 °C로 10 분 동안 계속 가열합니다. 이전 단계를 반복하여 길이 2.0mm, 너비 1.5mm가 될 때까지 가장자리 주위의 와인드를 확대합니다.
      알림: 각 익스텐션은 마지막 부상의 가장자리를 따라야 합니다. 버니어 캘리퍼스를 사용하여 부상의 길이와 너비를 측정하십시오. 부상은 입천장의 10%를 덮어야 합니다.
   4. 미세 수술 가위를 사용하여 상처 주변의 과도하게 변성된 연조직을 제거합니다. 멸균 솜을 사용하여 출혈을 멈추고 쥐의 흡입 질식을 방지하십시오. 상처를 측정하여 정중선에 2.0 x 1.5mm 크기의 전체 두께 경구개 점막 손상을 형성하는지 확인합니다.

3. 수술 후 관리

1. 수술 후 각성 시 생쥐에게 3일 동안 5mg/kg/d의 용량으로 멜록시캄을 피하^{투여 29}.
2. 마우스가 완전히 의식을 회복할 때까지 온도 유지 장치에 마우스를 올려 놓습니다.
   알림: 마우스가 호흡을 용이하게 하는 위치에 있는지 확인하십시오. 10-15분마다 쥐를 회전시켜 혈액이 고이거나 폐엽이 무너지는 것을 방지합니다. 쥐가 예열되면 케이지로 되돌립니다. 생쥐가 섭취할 수 있도록 케이지 바닥에 멸균 젤리와 방사선 조사 사료를 제공합니다.

4. 구강 누공 생성 확인

알림: 구강 누공(ONF) 생성의 성공 여부는 수술 후 7일째에 평가됩니다.

1. 고무줄, 테이프, 주사기, 수술용 커튼, 라텍스 장갑, 멸균 시트, 멸균 금속 호일 및 폼 보드와 같은 필요한 수술 용품을 준비합니다.
2. 무균 상태를 유지하기 위해 수술용 커튼과 멸균 장갑을 착용하십시오. 폼 보드, 광원 및 온도 유지 장치를 알코올로 소독하십시오.
3. Zoletil50(80mg/kg)의 복강내 주사로 전신 마취를 유도합니다. 발가락 꼬집기 반응이 없을 때까지 기다리십시오. 2.1.3 및 2.1.4 단계에서 설명한 것과 동일한 방법을 사용하여 마우스를 고정하고 경구개를 노출시킵니다.
4. 상처 부위에 중격이 여전히 보이는지 확인하여 해부학적 구조 검증을 수행하여 성공적인 ONF 생성을 나타냅니다(그림 4A,B).
5. 기능 검증 수행: 마우스의 구강을 닫고 멸균 주사기를 사용하여 멸균수를 구강에 주입합니다. ONF의 성공적인 생성은 쥐의 콧구멍에서 액체가 흐를 때 확인됩니다.
6. 마우스가 완전히 의식을 회복할 때까지 온도 유지 장치(37°C)에 마우스를 올려 놓습니다. 10-15분마다 쥐를 회전시켜 혈액이 고이거나 폐엽이 무너지는 것을 방지합니다.

이 실험 방법의 타당성과 안정성을 평가하기 위해 10마리의 마우스에 대해 동일한 절차를 수행하고 사망률, 상처 크기의 변화, 체중 및 조직학적 분석에 대해 관찰했습니다. 생쥐들은 7일째에 안락사되었다.

이 시술은 사망률이 낮았다. 그림 1A-C에 묘사된 안과 소작 및 발아기는 이 실험에 사용된 핵심 기기였습니다. ONF 모델은 제공된 프로토콜에 따라 생성되었습니다. 수술을 받은 쥐 10마리 중 수술 후 7일째 되는 날 사망한 쥐는 단 한 마리뿐이었다. 실험 전체의 전체 사망률은 약 10%였습니다.

그 결과 설명된 방법을 사용하여 생성된 ONF의 크기에서 현저한 변동성이 나타났습니다. 수술 당일, 모든 쥐는 길이 2.0mm, 너비 1.5mm의 타원형 상처를 보였다. 수술 후 7일째에 ONF 형성을 평가했을 때 ONF 크기의 유의한 변화가 관찰되었습니다(P=0.0085)(그림 5A,B).

ONF의 존재는 음식 역류 및 섭식 장애와 같은 합병증을 유발할 수 있으며 잠재적으로 체중 변화로 이어질 수 있습니다. 따라서 생쥐의 체중도 고려되었습니다. 마우스는 수술 당일(1일)과 ONF 형성을 검사한 7일째(7일)에 체중을 측정했습니다. 1일차에 비해 7일째에 체중이 유의하게 감소하는 것이 관찰되었습니다(P < 0.001)(그림 6A,B). 체중 감량은 25.16%였다.

조직학적 분석을 위해, 상처와 정상 조직 모두를 7일째에 마우스에서 채취하였다. 고립된 구개는 조직학 절편을 위한 샘플로 사용되었다. 이들을 조직 매립 상자에 넣고 4% 파라포름알데히드와 10% 포름산 석회질 제거 시약을 사용하여 고정했습니다. 그런 다음 조직을 파라핀에 묻히고, 관상면을 따라 7μm 절편으로 분할하고, 헤마톡실린과 에오신(H&E)으로 염색했습니다. ONF의 조직학적 분석은 경구개 점막의 손실, 뼈 손상 및 ONF 형성을 보여주었습니다(그림 7). 폐의 조직학을 실시한 결과, 정상 마우스와 ONF 마우스 사이에 이상이 발견되지 않았습니다.

그림 1: 수술 기구 및 소모품 . (A) 안과 소작을 가열하는 데 사용되는 발아기. (B) 수술 기구: 안과 소작, 미세 수술 가위, 미세 수술 핀셋, 주사기 및 바늘(26g x 0.63인치). (C) 수술 용품: 수술용 커튼, 멸균 장갑, 멸균 면, 멸균 시트, 멸균 금속 호일, 폼 보드, 고무 밴드 및 테이프. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 마우스의 고정과 구강 개방 . (ᄀ) 쥐의 앞다리를 테이프로 붙여서 고정시켰다. (B) 주사기 바늘을 폼 보드에 삽입하고 바늘 위에 고무 밴드를 놓았습니다. 쥐의 구강은 고무 밴드와 미세 수술용 핀셋을 사용하여 열렸습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 구강 누공의 생성. (A) 구강 노출. (B) 안과 소작의 끝을 경구개의 정중선 부분에 놓습니다. (C) 안과 소작 제거. (D) 미세 수술 가위를 사용하여 상처 주변의 과도한 연조직을 제거합니다. (E) 멸균면을 사용하여 출혈을 멈춥니다. (F) 최종 형성된 구개 상처. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 수술 후 7일째 되는 날의 구개 상처 검사 . (A) 1일째 구개 상처. (B) 7일째 되는 날의 구개 상처. 흰색 화살표는 구강 누공(ONF)을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 1일차와 7일차의 구개 상처 크기 . (A) 1일과 7일의 마우스에 대한 평균값. (B) 쌍체 표본 t-검정을 사용하여 확인된 유의한 차이. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6: 1일차와 7일차에 생쥐의 체중 . (A) 1일과 7일의 마우스에 대한 평균값. (B) 쌍체 표본 t-검정을 사용하여 확인된 유의한 차이. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7: 조직학적 관찰. ONF의 조직학적 분석은 경구개 점막의 손실, 뼈 손상 및 ONF 형성을 보여줍니다. (A) 7일째 구강 누공, 배율: 4배. (B) 7일째 구강 누공, 배율: 10배. (C) 부상 없는 조절, 배율: 4배. (D) 부상 없는 조절, 배율: 10배. 검은색 화살표는 ONF의 위치를 나타냅니다. 눈금 막대: A,C = 200 μm; B,D = 100μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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