여기에서는 조직 상호 작용, 4D 이미징 타임랩스 동영상(3D 플러스 타임), 분자 기능의 전역 또는 국소 섭동 및 시스템 생물학 특성화를 검사하는 데 사용할 수 있는 세 가지 유형의 조류 배아 피부 이식 배양에 대한 프로토콜을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
배아 발생 중 발달하는 조류 피부는 조직 패터닝에 대한 귀중한 통찰력을 제공할 수 있는 독특한 모델입니다. 여기에서는 피부 발달의 다양한 측면을 조사하기 위해 피부 이식 배양에 대한 세 가지 변형에 대해 설명합니다. 첫째, 체외 장기 배양 및 조작은 연구자들에게 깃털 싹의 발달을 직접 관찰하고 연구할 수 있는 기회를 제공합니다. 피부 이식 배양은 7일 동안 성장할 수 있으므로 이 성장 기간 동안 세포 거동을 직접 분석하고 4D 이미징을 할 수 있습니다. 또한 배양 조건의 물리적 및 분자적 조작을 통해 조직 반응을 시각화할 수 있습니다. 예를 들어, 성장 인자 코팅 비드를 국소적으로 적용하여 제한된 영역에서 깃털 패턴의 변화를 유도할 수 있습니다. 대안적으로, 바이러스 transduction은 유전자 발현을 상향 또는 하향 조절하기 위해 배양 배지에서 전 세계적으로 전달될 수 있습니다. 둘째, 피부 재조합 프로토콜을 통해 연구자들은 서로 다른 피부 영역, 다른 생애 단계 또는 다른 종에서 파생된 표피와 중간엽 사이의 조직 상호 작용을 조사할 수 있습니다. 이는 상피가 신호에 반응할 수 있는 시간 창과 다양한 중간엽 소스의 신호에 반응하여 다른 피부 부속기를 형성하는 능력을 테스트할 수 있는 기회를 제공합니다. 셋째, 온전한 상피와 겹쳐진 해리된 진피 세포를 사용한 피부 재구성은 피부 발달을 재설정하고 주기적인 패턴의 초기 과정을 연구할 수 있도록 합니다. 이 접근법은 또한 재구성된 피부 이식을 생성하기 전에 해리된 세포 간의 유전자 발현을 조작하는 능력을 향상시킵니다. 이 논문은 세 가지 배양 프로토콜과 그 유용성을 입증하기 위한 모범적인 실험을 제공합니다.
서론
조류 배아 피부 발달은 뚜렷한 패턴과 미세수술 및 조작에 대한 접근성 때문에 형태형성의 메커니즘을 연구하기 위한 훌륭한 모델이다 1,2. 그러나 손상되지 않은 조직에서 세포 및 분자 이벤트를 평가하는 것은 외부 조직의 존재가 현미경 관찰을 복잡하게 만들 수 있기 때문에 어려울 수 있습니다. 또한, 피부 형태 형성에서 자신의 역할을 테스트하기 위해 유전자 발현을 조작하는 능력은 항상 간단한 작업이 아닙니다. 우리는 피부 이식 모델을 사용하여 더 높은 성공률로 레트로바이러스 형질도입을 사용하여 유전자 기능을 테스트할 수 있음을 발견했습니다. 여기에서는 개발된 세 가지 피부 이식 모델의 장점에 대해 논의합니다.
조류 배아 피부 배양은 피부 깃털 새싹 발달 중 세포 행동, 유전자 조절 및 기능을 평가하는 강력한 시스템입니다 3,4,5,6. 이를 통해 배양 배지에 배치된 성장 인자의 전반적인....
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프로토콜
1. 닭 피부 이식 배양 (그림 1)
- 38°C의 가습 인큐베이터에서 수정된 닭고기 난자를 배양하고 Hamburger and Hamilton14에 따라 단계를 결정합니다.
- 28단계(~E5.5)에서 사지의 두 번째 손가락과 세 번째 발가락은 다른 발가락보다 길다. 세 개의 숫자와 네 개의 발가락이 뚜렷합니다.
- 스테이지 29 (~ E6)에서 날개는 팔꿈치에서 구부러집니다. 두 번째 숫자는 다른 숫자보다 뚜렷하게 깁니다.
- 30기(~E6.5)에서, 척수 양쪽으로 두 줄의 등쪽 깃털 싹 줄이 상완 수준에서 보이고 세 줄의 깃털 봉오리가 다리 수준에서 보입니다.
- 31 단계 (~ E7)에는 점보 천골 수준에 ~ 7 줄의 깃털이 있습니다.
- 32 단계에서는 11 줄 이상의 깃털 싹이 다리 높이에 존재합니다.
- 28-32단계 닭 배아를 Hanks의 완충 식염수(HBSS) 또는 인산염 완충 식염수(PBS)가 포함된 60mm 페트리 접시에 넣습니다.
- 목 아래쪽에서 꼬리 부분....
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결과
피부 이식 배양
체외 피부 장기 배양에서 얻은 깃털 새싹 발달은 현미경으로 직접 관찰할 수 있습니다. 닭 30기 등쪽 피부의 피부 이식 배양 모델을 사용하여 정중선을 따라 플라코드를 볼 수 있습니다. 그런 다음 형태 유전 학적 전선은 새로운 깃털 원시적 (feather primordia)의 형성과 함께 피부 주변부를 향해 점차적으로 측면으로 전파됩니다. 이 깃털 원시골은 배양 후 2일 후에 짧은 깃털 새싹으로, 배양 4일 후에 긴 깃털 새싹으로 발달합니다(그림 1).
피부 재조합 배양
피부 재조합의 경우 상피와 중간엽이 재결합되면 원래의 플라코드가 사라집니다. 새로운 플라코드는 재조합 직후 나타나고 배양 후 각각 2일과 4일 후에 짧은 깃털 새싹과 긴 깃털 새싹을 형성하기 위해 발달합니다. 상피가 중간엽에 대해 90° 회전하면 길어지는 새싹.......
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토론
조직 재조합은 상피와 중간엽의 고유한 기여를 탐구하기 위한 분석을 제공합니다. 닭의 경우 깃털은 배아 7일(E7)에 발달하기 시작하고 비늘은 E9에서 시작됩니다. E9 비늘 중간엽이 E7 깃털 상피와 재결합되면 재결합된 조직이 비늘을 형성하고, E7 깃털 중간엽이 E9 비늘 상피와 재결합하면 깃털이 형성된다11. 이러한 연구는 중간엽(mesenchyme)이 패턴 형성, 간격 및 장기 정체성을 제어한다는 것을 입증했습니다. 물론 상피는 중간엽 신호를 적절하게 수신하고 해석할 수 있는 능력이 있어야 합니다. 역량은 짧은 시간 간격 동안만 상피에 존재합니다. 위의 결과와 대조적으로, 놀랍게도 닭의 구강 점막과 복부 E5 상피가 E8 몸통 중간엽과 재결합되면 복강 상피가 깃털을 형성합니다. 그러나 구강 점막은 여러 개의 치아 모양의 부속기를 형성한다15. 이는 피부 줄기 중간엽이 복부 상피에 깃털을 만들도록 지시하는 반면, 구강 상피는 깃털을 만들 수.......
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공개 사항
저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
이 작업은 NIH NIAMS 보조금 R37 AR 060306, R01 AR 047364 및 RO1 AR078050의 지원을 받습니다. 이 연구는 또한 USC와 대만 중국 의과대학 간의 공동 연구 계약에 의해 지원됩니다. 여러 실험실 모듈에서 이 조류 피부 배양 프로토콜을 성공적으로 테스트한 USC BISC 480 Developmental Biology 2023 수업에 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 6-웰 배양 요리 | Falcon | REF 353502 | 공기-액체 인터페이스(ALI) 배양 |
| 세포 배양 삽입 | 팔콘 | REF 353090. | 0.4 & 마이크로; m 투명 PET 멤브레인 |
| 콜라겐 분해 효소 유형 1 | Worthington 생화학 | LS004196 | |
| Dulbecco' s 변형 된 독수리' S 미디엄 | Corning | 10-013-CV | 4.5 g/L 포도 |
| 에틸렌디아민테트라아세트산 이나트륨 염 이수화물(EDTA) | 시그마-알드리치 | E5134 | |
| 소 태아 혈청 | ThermoFisher | 16140-071 | |
| 포도 | 시그마-알드리치 | G8270 | |
| 행크스 s 완충 식염수 | Gibco | 14170-112 | 칼슘 없음, 마그네슘 |
| 없음 페니실린/스트렙토마이신 | Gibco | 15-140-122 | |
| 포가시움 포스페이트 모노베이직 (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| 염화칼륨 (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| 소듐 바이카보네이트 (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| 염화나트륨 (Nacl) | EMD | CAS 7647-14-5 | |
| 인산나트륨 일염기성(NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| 트립신 | Gibco | 27250-042 |
참고문헌
- Lucas, A. M., Stettenheim, P. R. Avian anatomy: Integument part I and part II. Agriculture Handbook. 362, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, Washington D.C.. (1972).
- Sengel, P. In Morphogenesis of Skin, l-277. , Cambridge Univ. Press. New York. (1976).
- Dhouailly, D., Wilehm Roux,
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재인쇄 및 허가
