방법 논문

의식이 있는 쥐의 고혈당 클램프 및 저혈당 클램프

2.5K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/65581

⸱

2024년 1월 26일

 , 
1Department of Neuroscience for Metabolic Control, Graduate School of Medical Science, Kumamoto University

이 논문에서

요약

고혈당 클램프는 더 높은 혈당 농도를 유지하면서 인슐린 방출을 측정하는 데 사용됩니다. 저혈당 클램프는 역조절 반응에 의해 유도된 포도당 생성을 측정하기 위한 것입니다. 두 방법 모두 동일한 수술 절차를 사용합니다. 여기에서는 전신 포도당 대사를 평가하기 위한 클램프 기술을 제시합니다.

초록

진성 당뇨병(DM)은 췌장 β세포의 인슐린 분비 부족(1형 DM)과 근육, 간, 지방 조직의 인슐린 민감성(2형 DM)으로 인해 발생합니다. 인슐린 주사는 DM 환자를 치료하지만 부작용으로 저혈당증을 유발합니다. 코르티솔과 카테콜아민은 간에서 포도당 생산을 활성화하여 저혈당을 회복하기 위해 분비되는데, 이를 역조절 반응(CRR)이라고 합니다. 설치류 모델을 이용한 DM 연구에서는 인슐린 방출과 CRR을 측정하기 위해 각각 포도당 내성 검사와 2-데옥시-포도당 주사를 사용합니다. 그러나 실험 중에 혈당 농도가 지속적으로 변하여 순 인슐린 분비와 CRR을 평가하는 데 어려움이 있습니다. 이 글에서는 의식이 있는 쥐의 혈당을 250mg/dL 또는 50mg/dL로 유지하여 각각 인슐린과 CRR 호르몬의 분비를 비교하는 방법을 설명합니다.

폴리에틸렌 튜브를 생쥐의 경동맥과 경정맥에 이식하고 생쥐가 수술에서 회복할 수 있도록 합니다. 경정맥 튜브는 주사기 펌프가 있는 해밀턴 주사기에 연결되어 일정하고 다양한 속도로 인슐린 또는 포도당을 주입할 수 있습니다. 경동맥 튜브는 혈액 수집을 위한 것입니다. 고혈당 클램프의 경우 30%의 포도당을 정맥에 주입하고 5분 또는 10분마다 동맥혈에서 혈당 수치를 측정합니다. 혈당 수치가 250mg/dL이 될 때까지 30% 포도당의 주입 속도가 증가합니다. 인슐린 농도를 측정하기 위해 혈액을 채취합니다. 저혈당 클램프의 경우 10mU/kg/min 인슐린을 30% 포도당과 함께 주입하며, 주입 속도는 50mg/dL의 혈당 수준을 유지하기 위해 가변적입니다. 포도당 주입과 혈당이 모두 정상 상태에 도달했을 때 역조절 호르몬을 측정하기 위해 혈액을 수집합니다. 고혈당 클램프와 저혈당 클램프는 모두 동일한 수술 절차와 실험 설정을 가지고 있습니다. 따라서 이 방법은 전신 포도당 대사 연구자에게 유용합니다.

서론

포도당은 세포의 중요한 에너지원이며, 포도당이 부족하면 다양한 증상과 합병증이 발생할 수 있습니다. 저혈당(저혈당, 일반적으로 공복 혈당 수치가 70mg/dL 미만이지만단일 값으로 결정되어서는 안 됨1)의 경우 가장 흔한 증상으로는 쇠약, 혼란, 발한, 두통 등이 있습니다. 또한 대뇌 기능을 방해하고 심혈관 질환 및 사망 위험을 증가시킬 수 있다2. 반대로, 고혈당증은 혈장 포도당 농도가 정상 수준(일반적으로 공복 혈당 수치3에서 > 126mg/dL)을 초과하는 의학적 상태입니다. 이는 인슐린 생산 또는 활용에 결핍이 있는 당뇨병 환자에서 발생할 수 있습니다. 고혈당증은 당뇨병성 케톤산증으로 이어질 수 있는데, 이는 신체가 포도당을 에너지로 사용하지 못하고 대신 지방산을 분해하여 연료로 사용할 때 발생합니다. 고혈당 고삼투압 상태도 사망률을 증가시킨다4. 장기적인 고혈당증은 혈관, 신경 및 장기에 손상을 일으켜 심혈관 질환, 망막병증 및 신장 질환과 같은 여러 만성 합병증의 발병으로 이어질 수 있습니다. 따라서 혈당 농도는 100mg/dL에서 120mg/dL 사이의 좁은 범위로 유지되어야 합니다.

혈당은 1구획 모델에서 포도당 입력과 출력 사이의 균형에 의해 조절됩니다(그림 1A). 포도당 입력에는 음식에서 흡수되는 포도당과 간, 신장 및 소장에서 포도당 생성이 포함됩니다. 포도당 출력은 조직의 포도당 흡수와 신장의 포도당 처리로 구성됩니다. 포도당의 투입량과 출력량은 모두 내분비 호르몬에 의해 조절됩니다. 예를 들어, 글루카곤, 코르티코스테론, 카테콜아민은 혈당 수치가 감소할 때 분비된다5. 그들은 주로 간에서 글리코겐의 분해와 포도당의 합성을 자극합니다. 이러한 과정은 각각 glycogenlysis 및 gluconeogenesis로 알려져 있습니다. 고혈당증은 췌장 β세포에서 인슐린 분비를 증가시키고 근육, 지방 조직 및 심장의 포도당 흡수를 자극한다 6,7,8,9. 운동은 인슐린과 무관한 포도당 흡수를 증가시킨다10. 교감 신경계는 근육과 갈색 지방 조직의 포도당 흡수를 증가시킵니다 6,11. 말초 조직의 포도당 대사를 조절하는 능력을 측정하기 위해 연구자들은 일반적으로 포도당 내성 검사(GTT)와 인슐린 내성 검사(ITT)를 사용합니다(그림 1B,C). GTT에서는 인슐린 분비와 인슐린 감수성이라는 두 가지 요소를 고려해야 합니다(그림 1B). 그러나 120분 테스트 중 포도당 농도 곡선은 마우스마다 다르며, 이는 호르몬 방출량에 따라 다를 수 있습니다. ITT에서 혈당은 인슐린 감수성과 역조절 호르몬의 방출에 의해 조절됩니다. 따라서 혈당 수치가 일정하지 않은 상황에서 GTT 및 ITT에서 포도당 대사, 인슐린 방출 및 인슐린 감수성의 정확한 의미를 결정하기 어렵습니다.

이러한 문제를 극복하려면 혈당을 일정한 수준(또는 "클램프")으로 유지하는 것이 바람직합니다. 고혈당 클램프에서는 포도당을 혈류에 주입하여 혈당 수치를 특정 수준으로 올린 다음 일정 기간 동안 해당 수준을 유지합니다. 주입된 포도당의 양은 안정된 상태를 유지하기 위해 5-10분마다 혈당 수치를 측정하여 조정됩니다. 이 기술은 클램핑된 포도당 수준에서 인슐린 분비의 매개변수를 이해하는 데 특히 유용합니다. 저혈당 클램프는 인슐린을 주입하여 낮은 혈당 수치를 유지하는 방법입니다. 포도당은 특정 혈당 수치를 유지하기 위해 다양한 비율로 주입됩니다. 쥐가 저혈당에서 회복할 수 없으면 더 많은 포도당을 주입해야 합니다.

고혈당 및 저혈당 클램프를 수행하는 데에는 많은 이점이 있지만 수술 및 실험 절차는 기술적으로 어려운 것으로 간주됩니다. 따라서 이를 수행할 수 있는 연구 그룹은 거의 없습니다. 우리는 재정 및 인력 제약이 있는 연구자들이 더 적은 예산으로 이러한 실험을 시작할 수 있도록 이러한 방법을 설명하는 것을 목표로 했습니다.

프로토콜

모든 절차는 구마모토 대학의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다.

참고: 통증 완화를 위해 이부프로펜을 식수(0.11mg/mL)에 타서 48시간 동안 투여하고, 부프레노르핀(0.05-0.1mg/kg i.p.)을 수술 30분 전에 투여했습니다. 멸균 조건에는 장갑, 마스크 및 동물 사이에서 에틸렌 옥사이드로 멸균된 고압멸균 기구가 포함됩니다. 수술은 37°C로 설정된 가열 패드에서 수행되었으며 각 동물에 대한 새로운 실험실 매트로 덮여 있었습니다. 수술 전에 수술 부위를 베타딘 용액과 알코올로 청소했습니다. 모든 수술 기구는 오토클레이브로 멸균되었습니다(2회 이하의 수술). 절개를 하기 전에 쥐가 완전히 마취되었는지 확인했습니다. 각 마우스에 대한 마취 깊이는 수술 전과 수술 중에 발가락 꼬집음으로 평가되었습니다. 적응 시간은 매번 5분을 넘지 않았습니다. 해당 기관의 IACUC 지침을 따르십시오.

1. 경정맥 및 경동맥용 튜브 준비

  1. 모든 튜브, 폴리프로필렌 공급품(예: 피펫 팁) 및 봉합사를 오토클레이브 또는 에틸렌 옥사이드로 멸균합니다. 경정맥의 경우 접착제를 사용하여 8cm의 튜브1( 재료 참조)과 3cm의 튜브2를 연결합니다(그림 2A). 튜빙 2(폴리에틸렌)는 너무 단단하여 혈관을 손상시킬 수 있으므로 튜빙1 2mm를 상단에 올립니다(튜빙1.1).
  2. 포도당과 인슐린을 주입하기 위한 경정맥(Tubing1.2)용 연장 튜브
    1. 튜빙2가 있는 30cm 튜브 2개와 10cm 튜브 1개를 준비합니다(그림 2A). 20μL 피펫 팁(또는 튜빙 1.1과 연결하기 위해 OD가 0.5mm인 팁 끝이 좁은 < 있는 모든 것)의 날카로운 끝을 잘라내고 3개의 튜빙2(30cm, 30cm, 10cm)를 함께 넣습니다. 접착 접착제로 밀봉하십시오.
    2. 튜빙 5의 다른 쪽 끝에 튜빙1의 2cm를 놓습니다.
  3. 경동맥(Tubing1.3): 튜브2를 늘려 더 얇게 만듭니다. 접착제를 사용하여 8cm의 튜빙1과 늘어난 튜빙3의 2cm를 연결합니다(그림 2A). 끝에서 9mm에 표시하십시오.
  4. 튜브와 주사기를 연결하는 끝이 날카롭지 않은 바늘: 바늘의 날카로운 끝(23G) 부근을 금속 줄로 긁고 펜치로 앞뒤로 부드럽게 몇 번 구부려 부러뜨립니다. 바늘 가운데를 똑같이 잘라 금속 커넥터 조각을 만듭니다(그림 2A).
  5. 혈액을 채취하는 동맥용 연장 튜브(튜브 세트 1.4): 10cm의 튜브1을 금속 커넥터와 1.4단계에서 만든 날카롭지 않은 바늘에 연결합니다.
    알림: 모든 튜브와 봉합사는 오토클레이브 또는 에틸렌 옥사이드로 멸균됩니다

2. 수술

  1. 이소플루란(1.5-2.0%) 또는 케타민/자일라진(케타민 10mg/mL, 자일라진 1mg/mL, 0.9% 멸균 식염수에 자일라진 1mg/mL, 복강내 [ip] 주입을 통해 0.1mL/10g의 체중(BW))으로 마우스를 마취합니다. 물리적 스트레스를 줄이기 위해 따뜻한 패드(37°C)에 마우스를 올려 놓으십시오. 5-10분 동안 깊은 마취를 기다립니다. 페달 반사, 호흡, 심박수로 마취의 깊이를 확인하고 발가락 꼬집음으로 자극에 대한 반응을 확인합니다. 수술 중에는 수술용 테이프를 사용하여 마취제를 지속적으로 흡입하기 위해 코캡을 수술대에 고정해야 합니다. 마취 상태에서 건조함을 방지하기 위해 눈에 안과 연고를 바르십시오.
  2. 튜브 1.1 및 1.3에 헤파린화 식염수(100U/mL)를 채우고 날카롭지 않은 바늘이 있는 1mL 주사기로 연결합니다(그림 2B). 튜빙3( 재료 표 참조)의 끝을 튜빙1.1 및 튜빙1.3의 캡으로 사용할 납땜 인두로 녹여 닫습니다.
  3. 첫 번째 절개 부위(뒷면의 견갑골 사이)와 두 번째 절개 부위(앞쪽의 목)를 면도하고 10% 베타딘을 3회 주기로 닦은 다음 멸균 70% 알코올로 수술 전 제제를 합니다. 흉골에 5mm 두부의 작은 수직 정중선 절개를 하고 조직을 뭉툭하게 절개하고 동맥을 노출시킵니다. 미주 신경을 동맥에서 분리하십시오. 이것은 포도당 대사에 대한 미주 신경 제거의 부정적인 영향을 줄입니다.
    참고: 복부 절개에서 카테터를 정맥에 삽입하고 실크 봉합사로 고정하는 단계까지의 단계는 현미경으로 수행됩니다.
  4. 동맥 아래에 두 개의 실크 봉합사를 놓습니다. 한쪽 봉합사는 두개골 쪽(그림 2C-1)에 단단히 묶고 다른 봉합사는 꼬리 쪽(그림 2C-2)에 느슨하게 묶어 혈류를 멈추게 하면 혈류를 멈추게 할 수 있지만 나중에 다시 열 수 있습니다. 동맥 아래에 봉합사를 하나 더 놓습니다(그림 2C-3).
  5. 스프링 가위로 그림 2C-1 근처의 동맥을 자르고 tubing1.3을 동맥에 넣습니다. 동맥과 튜브를 느슨하게 묶습니다(그림 2C-3, 단단히 묶지 마십시오. 튜브는 동맥 깊숙이 삽입됩니다. 꼬리 쪽의 매듭(그림 2C-2)을 열어 9mm 표시가 중간의 매듭에 도달할 때까지 튜브를 삽입합니다(그림 2C-3). 모든 합자를 단단히 묶고 헤파린화된 멸균 식염수로 씻어냅니다.
  6. 경정맥 카테터의 오른쪽 경동맥과 동일한 절개부에서 오른쪽 경정맥을 노출합니다. 두개골 끝을 분리하고 실크 봉합사로 결찰합니다(그림 2D-1, 재료 표). 노출된 정맥의 꼬리 끝에 다른 봉합사를 놓습니다(그림 2D-2). 스프링 가위로 그림 2D-1 표시 근처의 정맥을 자릅니다.
  7. 카테터를 삽입하고(혈관이 침투하는 것을 방지하기 위해 너무 깊지 않음) 묶고 혈액 샘플링을 육안으로 확인합니다. 헤파린화된 멸균 식염수(0.2mL)로 씻어내고 카테터에 혈액이 남아 있지 않은지 육안으로 확인합니다.
  8. 첫 번째 상처의 감염을 방지하기 위해 새로운 멸균 수술용 드레이프에 마우스를 놓습니다. 마우스를 뒤집어 베타딘을 3회 투여한 후 멸균 알코올로 수술 전 제제를 사용하여 닦고 견갑골 사이를 작게 절개합니다.
  9. 바늘 홀더를 등 절개 부위에서 복부 쪽까지 피부 아래에 통과시킵니다. 바늘 홀더로 카테터를 고정하고 피부 아래로 통과시킨 다음 다시 가져옵니다. 절개 부위를 청소하고 인공 봉합사(직경 0.15-0.2mm)로 복부 절개 부위를 봉합합니다. 견갑골 사이의 절개 부위에 마이크로 세레파인으로 정맥 카테터를 고정합니다.
  10. 클램프 위 1cm 높이의 카테터를 자르고 헤파린화 식염수로 씻어낸 다음 캡으로 닫습니다(2.4단계). 동맥 카테터에 대해서도 동일한 절차를 따르십시오. 인공 봉합사(직경 0.15-0.2mm)로 등쪽 절개 부위를 봉합합니다.
  11. 마우스를 따뜻하고 깨끗한 케이지에 넣습니다(그림 2E). 매일 수술 후 관리를 수행하십시오.

3. 회복

  1. 다른 쥐가 그룹 하우징의 카테터를 물 수 있으므로 쥐를 한 번에 수용합니다.
    1. 사회적 고립으로 인한 스트레스를 줄이려면 환경적 풍부함(예: 대피소)으로 쥐를 기르십시오. 매일 수술 후 관리를 수행하십시오. 통증, 고통 및 불편함을 완화하기 위해 진통제(식수에 이부프로펜(0.11mg/mL))를 포함한 수술 후 관리를 제공합니다.
    2. 절개 부위의 곪음, 무기력 또는 통증과 같은 감염 징후가 있는지 쥐를 관찰하십시오. 대부분의 건강한 쥐는 수술 후 약 2시간 후에 걷고 먹이를 먹기 시작합니다. 구부정한 자세, 주름진 털, 음식 섭취 감소는 통증을 나타낼 수 있습니다. 이러한 징후가 관찰되면 즉시 깊은 마취 또는 이산화탄소 질식 상태에서 쥐의 목을 베어 안락사시킵니다.
  2. 혈액이 동맥의 카테터로 들어가 혈전을 형성합니다. 카테터 라인을 유지하려면 3-6단계에 따라 매일 혈전을 제거하십시오.
  3. 1mL 주사기와 23G 바늘(끝이 날카롭지 않음)에 헤파린 식염수(100U/mL)를 채웁니다. 유도 챔버를 사용하여 마우스를 이소플루란(1.0%-1.5%)으로 가볍게 마취합니다. 그런 다음 챔버에서 마우스를 제거하고 노즈 캡으로 이소플루란 마취 하에 혈전 제거를 수행합니다.
  4. 마우스 뒷면의 동맥 튜브를 마이크로 세레파인으로 고정하고 캡을 제거하고 혈액과 혈전을 추출합니다. 23G 바늘(끝이 날카롭지 않음)이 있는 다른 1mL 주사기를 사용하여 헤파린화 식염수로 카테터를 세척하고 다시 캡을 씌웁니다. 심한 응고의 경우 동맥선과 같은 정맥선을 청소하십시오.
  5. 3-5일 동안 하루에 한 번 카테터를 청소하기 위해 동일한 절차를 수행합니다.
  6. 마우스의 본체 무게를 확인하십시오. 수술 당일보다 체중이 10% 이상 감소하면 지지적인 치료를 적용하여 정상 신체 상태 점수를 개선한 후 마우스를 사용하여 다른 실험을 합니다.
    참고: 이 연구의 실험에서 동물의 체중 감소는 10% 미만이었습니다. 체중 감소는 전신 포도당 대사에 큰 영향을 미칩니다. 따라서 체중 회복을 기다리거나 클램프 실험에서 제거하는 것이 좋습니다.

4. 펌프 시스템 설정(저혈당 클램프용)

  1. 0.1% BSA 식염수, 30% 포도당 식염수, 헤파린 식염수로 1U/mL 인슐린을 준비합니다.
  2. 마우스의 체중을 측정합니다. 인슐린을 주입하기 위해 1U/mL 인슐린의 부피를 계산합니다(10mU/kg/min). 클램프 실험에서 1.7μL/min의 인슐린 용액을 마우스에 주입합니다. 300μL의 인슐린을 주입하기 위해 1U/mL 인슐린(μL)에 필요한 부피는 2.647(μL/g) x 체중(g)입니다. 300μL의 인슐린 주입물은 마우스 1마리에 대한 클램프 실험을 완료하기에 충분합니다. 표 1 은 인슐린을 주입시키는 예를 나타낸다.
  3. 각 Hamilton 주사기에 인슐린 주입액과 포도당 30%를 채우고 튜브 1.2에 연결한 다음 주사기를 주사기 펌프에 놓습니다(그림 3A). 튜빙 1.2에 각 용액을 채웁니다. 1mL 주사기 및 튜브 세트 1.4에 식염수를 채웁니다(그림 2A).
  4. 마우스를 이소플루란(1.0%-1.5%)으로 마취하고 tubing1.2를 정맥 카테터에 연결하고 tubing set1.4를 동맥 카테터에 연결합니다(그림 3A). 셀로판 테이프를 사용하여 튜브를 함께 고정합니다.
  5. 빈 500mL 비커에 마우스를 넣습니다.
    알림: 고혈당 클램프의 경우 1U/mL 인슐린 대신 식염수를 사용하십시오.

5. 저혈당 클램프

  1. 그림 5B와 같이 10-3분마다 혈당 수치를 측정하고 -15분, 10분, 20분, 40분, 60분, 80분, 100분 및 120분에 호르몬 측정을 위해 혈액 샘플을 수집합니다. 5.2단계에 따라 혈당을 측정합니다.
    알림: 모든 시점에서 혈당을 측정할 필요는 없지만 최소 10분마다 혈당을 측정하는 것이 좋습니다. 혈당 수준과 포도당 주입 속도가 일정하지 않을 때 5분마다 혈당을 측정합니다.
  2. 튜브 세트 1.4의 상단 끝을 고정하고 새 주사기를 연결하고 50μL의 혈액을 추출한 다음 세척을 위해 1.5mL 튜브에 넣습니다. 혈당 수치를 측정합니다.
    참고: 이것은 이전 샘플링 후 카테터 세척으로 인해 튜브의 식염수로 희석된 혈액입니다. 50μL의 부피는 희석된 혈액을 순수한 혈액으로 대체하기에 충분합니다.
  3. 희석된 혈액(적혈구)을 저장합니다. 고인 혈액(~500μL)을 식염수로 씻고(5.11-5.12단계 참조) 저산소증을 방지하기 위해 몸으로 돌아갑니다.
  4. 카테터는 고혈압이 있는 동맥에 연결되어 있기 때문에 클램프를 풀면 혈액이 흘러나와 편리한 혈당 측정기로 혈당을 측정하는 데 사용됩니다. 충분한 양의 혈액을 유지하기 위해 50μL의 식염수를 주입합니다.
  5. 혈액 샘플링의 경우 추가로 50μL의 혈액을 추출하여 얼음 위의 1.5mL 튜브에 넣습니다. 식염수 100μL(치환 50μL + 샘플링 50μL)를 주입합니다.
  6. 혈당 측정 0분 후 인슐린 주사기 펌프를 시작합니다. 먼저 30mU/kg/min을 볼루스에 2분(5.1μL/분) 동안 주입한 다음 나머지 기간 동안 10mU/kg/min(1.7μL/분)을 주입합니다.
  7. 혈당 수치를 측정하고 5분 동안 10-120분마다 포도당 주입 속도를 변경합니다.
  8. 포도당 주입 속도가 변하지 않고 혈당 수치가 50mg/dL인 안정된 상태를 만듭니다.
  9. t=120분에 혈액 샘플을 채취한 후 안락사를 경정맥에 주입하고 RNA 또는 단백질 분석을 위해 조직을 채취합니다.
  10. 혈액을 1000 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 제조업체의 프로토콜에 따라 ELISA 키트를 사용하여 인슐린 또는 c-펩타이드와 같은 호르몬 농도를 측정합니다.
  11. 혈액을 씻을 때는 혈액을 1000 x g 에서 3분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 500μL의 헤파린화 식염수를 첨가한 후 피펫팅을 수행합니다.
  12. 세척을 다시 반복하고 세척한 적혈구를 동맥용 주사기 1mL에 넣습니다. 50 및 5.2 및 5.3 단계에서 50 또는 100 μL의 식염수를 주입하면 혈액 세포가 자동으로 재주입됩니다. 저산소증을 예방하기 위해 헤마토크릿을 주의 깊게 모니터링하십시오.
    알림: 혈당 측정을 위해 상업용 편리한 혈당 측정기가 사용되었습니다.

6. 고혈당 클램프

  1. 저혈당 클램프 기술로 단계를 따르되 인슐린 주입 없이 혈당을 250-300mg/dL로 조정하십시오. 그림 5B와 같이 10-3분마다 혈당 수치를 측정하고 -15분, 10분, 20분, 40분, 60분, 80분, 100분 및 120분에 호르몬 측정을 위해 혈액 샘플을 수집합니다.
  2. 새 주사기를 튜브 세트 1.4에 연결하고 50μL의 혈액을 추출한 후 세척을 위해 1.5mL 튜브에 넣습니다.
  3. 혈액 샘플링의 경우 추가로 50μL의 혈액을 추출하여 얼음 위의 1.5mL 튜브에 넣습니다. 식염수 100μL(치환 50μL + 샘플링 50μL)를 주입합니다.
  4. 혈당 측정 0분 후 혈당 주사기 펌프를 시작합니다. 먼저 2분(5.1μL/분) 동안 볼루스에 30g/kg/min을 주입한 다음 나머지 기간 동안 10g/kg/min(1.7μL/분)을 주입합니다.
  5. 혈당 수치를 측정하고 5분 동안 10-120분마다 포도당 주입 속도를 변경합니다. 포도당 주입 속도가 변하지 않고 혈당 수치가 250-300mg/dL인 고정된 고혈당 상태인 안정된 상태를 만듭니다.

결과

저혈당 클램프 연구는 실험 시작 시 3시간 동안 금식한 수컷 C57BL/6N 마우스(생후 8주, BW 25g 이상)에서 수행되었습니다(그림 4A,B). 초기 혈당 수치는 136mg/dL(t = -15분)이었습니다. 90mg/dL 미만인 경우 수술이 잘 되지 않았거나 동맥 카테터를 너무 깊게 삽입했거나 혈류에 혈전이 들어갔기 때문일 수 있습니다. 수술 후 쥐의 상태는 쥐의 에너지 대사에 영향을 미칩니다. 생리적 포도당 대사는 건강 상태가 좋지 않은 상태에서는 측정할 수 없습니다. C57BL은 수술 후 응고되기 쉽습니다. FVB 또는 ICR 마우스와 같이 체중이 더 많이 나가는 마우스는 수술 후 혈전 세척으로 인해 체중이 감소할 가능성이 적습니다. 따라서 초보자는 클램프 절차를 연습하기 위해 FVB 마우스를 사용하는 것이 좋습니다. C57BL 마우스는 더 집중적인 치료가 필요합니다. 동맥에 9mm 카테터를 삽입하면 FVB 및 ICR 마우스에서도 혈액을 채취하는 데 문제가 발생하지 않았습니다. 인슐린은 t = 0분에서 시작되었고, 혈당 수치는 감소하였다(그림 4A). GIR은 t = 0분과 t = 70분 사이에서 안정적이지 않았습니다. 그 후 80분 후에 정상 상태가 되었습니다.

고혈당 클램프 연구는 실험 시작 시 3시간 동안 금식한 수컷 C57BL/6N 마우스(생후 8주, BW 25g 이상)에서도 수행되었습니다(그림 4C,D). t=-15 및 t=-5분에서 혈당을 측정하고 혈액 샘플을 채취한 후, t=0분부터 포도당을 주입하였다. 혈당 수치는 t=40분에 250mg/dL이 되었습니다. 정상 상태는 t = 30 분에서 끝까지 계속되었습니다.

figure-results-1
그림 1: 혈당 수치 조절. (A) 신체의 혈당 조절을 보여주는 개념도. (나,씨) (B) 포도당 내성 검사(GTT) 및 (C) 인슐린 내성 검사(ITT)에서 포도당 대사 조절. 몇 가지 요인이 혈당 수치를 조절합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-2
그림 2: 튜브 준비 및 수술 단계. (A) 경동맥 및 경정맥용 튜브 이미지. 튜빙 번호는 프로토콜 단계 번호와 일치합니다. (B) 수술을 위한 튜브를 준비하는 방법. (씨, 디) 카테터를 (C) 동맥과 (D) 정맥에 삽입하기 위해 실크 실을 결찰하는 번호가 매겨진 위치. 두개골 (C-(1))과 동맥의 꼬리 쪽 (C-(2))에서 명주의 실의 위치, 그리고 그 중간에 하나 더 위치 (C-(3)) (절차 2-4). 두개골(D-(1))과 정맥의 꼬리 쪽(D-(2))에 있는 명주의 실의 위치, 그리고 그 중간(D-(3))에 하나 더 위치(절차 2-6). (E) 뒤쪽으로 나가는 동맥 및 정맥 캐뉼라의 다이어그램 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-3
그림 3: 클램프 설정. (A) 튜브, 펌프, 주사기 및 마우스의 설정을 보여주는 다이어그램. (B) 혈당 수치와 포도당 주입 속도를 기록하는 시트. t = -15분, 10분, 20분, 40분, 60분, 80분, 100분, 120분에 50μL의 혈액을 채취합니다. 인슐린 주입 속도는 t=0∼2분에서 5.1μL/min이었고, t=2분에서 1.7μL로 변경되었다. 혈당 수치는 10분마다 측정되었습니다. 혈당 수치가 안정적이지 않을 때 5분마다 혈당을 측정했습니다. 포도당 주입 속도는 혈당을 측정할 때마다 변경되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-4
그림 4: 저혈당 클램프와 고혈당 클램프의 대표적인 결과. (A) 혈당 수치 및 (B) 저혈당 클램프의 포도당 주입 속도. (C) 혈당 수치 및 (D) 고혈당 클램프의 포도당 주입 속도. 데이터는 평균± SEM을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

용액계산20g 마우스용
1U/mL 인슐린(2.647 x 본체 중량) μL52.9 마이크로리터
0.1% BSA 식염수300 μL - 인슐린 부피(μL)247.1 마이크로리터

표 1: 인슐린 주입액을 준비하기 위한 계산 예.

토론

여기에 설명된 방법은 피펫 팁, 주사기 및 일반 실험실에서 볼 수 있는 기타 품목으로 수행할 수 있는 간단한 방법입니다. 연구원이 추가 튜브와 펌프를 구입해야 할 수도 있지만 값비싼 장비는 필요하지 않습니다. 따라서, 이러한 카테터 삽입 및 클램프 프로토콜은 이전 보고에 비해 시작하기가 더 쉽다(12,13,14).

클램프 기술은 1970년경에 개발되어 생쥐와 인간에게 사용되어 왔다15. 포도당 대사를 정확하게 측정하는 데 유용한 방법이며 황금 표준이라고합니다. 그러나 많은 연구자들이 사용하는 일반적인 기술은 아닙니다. 고인슐린혈증-유혈당 클램프 기술은 생쥐13 및 랫트14에서 보고되었지만, 여기서 카테터 삽입 방법은 다르며, 독자는 실험을 위해 더 쉬운 방법을 선택할 수 있다. 이 문서의 목적 중 하나는 실험을 시작하기 위한 장애물을 줄이는 것입니다. 따라서 수제 카테터의 재료, 수술 절차 및 실험 시간 경과의 예에 대한 자세한 정보를 제공했습니다. 이는 클램프를 처음 수행하려는 연구자에게 유용한 정보입니다.

비만과 당뇨병의 인슐린 분비는 병기에 따라 다릅니다. 많은 보고에 의하면 비만에서는 인슐린 분비가 증가하여 인슐린 저항성 상태에서는 혈당을 감소시키지만16 제2형 DM에서는 β세포 기능이 손상된다17,18. 실제로, 췌장 섬과 인슐린 분비의 수와 면적은 고지방 식단을 먹인 마우스(19) 또는 렙틴 결핍 마우스(20)와 같은 비만 마우스 모델에서 증가한 것으로 보고되었다. 명백한 표현형을 갖는 이러한 마우스 모델에서는 GTT에서 포도당 투여 후 15-30분 후에 혈중 인슐린 수치를 검사하여 차이를 확인할 수 있습니다. 그러나 경우에 따라 인슐린 분비의 차이를 확인하는 것이 쉽지 않습니다. 예를 들어, 형질전환(Tg) 마우스의 혈당 수치가 500mg/dL인 반면 WT 마우스의 혈당 수치는 300mg/dL이고 두 마우스의 혈중 인슐린 수치가 동일하다면 Tg에서 인슐린 분비가 감소한다고 말할 수 있습니까? 이 경우 여기서 소개한 방법을 사용하여 혈당 수치가 동일하지 않으면 인슐린 분비 능력을 비교할 수 없습니다. 이것이 비만에서 당뇨병으로 이행하는 과정에서 β세포 기능이 언제 저하되기 시작하는지에 대한 확립된 이론이 없는 이유 중 하나입니다. 또한 췌장의 1차 배양에 의해 인슐린 분비를 측정할 수 있다21 또는 생체 외배양(ex vivo 22)을 통해 측정할 수 있다. 그러나 중추 신경계의 인슐린 분비에 미치는 영향은 미주 신경의 신경 분포가 제거되기 때문에 망칠 것입니다. 흡수 후 인슐린 분비는 잘 알려져 있지만, 뇌와 자율신경계도 인슐린 분비를 조절한다23. 후자를 분석하기 위한 실험은 마취되지 않고 억제되지 않고 통증이 없는 혈액 채취로 수행되어야 합니다. 이것이 2.3단계에서 미주신경을 경동맥에서 분리해야 하는 이유이기도 합니다.

진성 당뇨병은 인슐린 저항성과 글루카곤24 및 기타 역조절 호르몬의 분비 증가로 인해 고혈당증을 유발하는 것으로 보고되었다25. 또한, 인슐린 투여 실패 또는 다른 원인으로 인해 당뇨병이 있는 사람에서 저혈당증이 반복적으로 발생하면 환자가 저혈당증에 걸리기 쉬운 재발성 저혈당증이라는 상태가 발생할 수 있다26. 저혈당 클램프에서 혈당의 하강률은 저혈당증의 말초 또는 중추 검출에 영향을 미친다는 것이 제안되었다27. 서서히 발병하는 저혈당증은 문맥-장간막 정맥에서 포도당 센서의 역할을 연구하는 데 적합할 수 있는 반면, 혈당의 매우 급격한 감소는 뇌 포도당 센서의 연구에 적합할 수있다 27. 1 U/mL 인슐린은 마른 C57BL 마우스에 사용됩니다. 그러나 비만 쥐는 인슐린 저항성이 있기 때문에 더 높은 인슐린 농도가 필요하며 1U/mL는 혈당 수치를 낮추기에 충분하지 않습니다.

혈당 풀의 1-구획 모델(도 1A)에서, 흡수된 글루코스의 양은 글루코스 투입 속도(14)에 영향을 미칠 수 있다. 따라서 고인슐린혈증-유혈당 클램프 측정의 주요 목표 중 하나인 포도당 생성 속도는 단식 기간에 의해 영향을 받을 수 있습니다. 그러나 단식 시간이 길면 항조절 호르몬의 분비가 증가할 수 있습니다. 따라서 연구자들은 분석 목적에 따라 단식 시간을 설정합니다. 또 다른 클램프 방법은 꼬리에서 혈액을 채취하는 것을 포함하는데, 이는 정맥 캐뉼라만 삽입하면 되기 때문에 간단하다14. 그러나 구속 상태에서 혈액이 모이기 때문에 적당한 양의 구속 스트레스가 발생하고 혈장 카테콜아민 및 기타 스트레스 호르몬이 증가한다14. 또한 사지의 혈액보다 몸의 중심에 있는 혈류의 호르몬 농도를 측정하는 것이 바람직합니다. 따라서 자유롭게 움직이는 쥐의 동맥에서 혈액을 채취하는 것이 생리학적으로 포도당 대사를 측정하는 데 가장 적합합니다. 마우스는 움직이지 않으며 실험 환경에 적응할 때 회전이 필요하지 않습니다. 그러나 주입 및 샘플링 라인이 얽히는 것을 방지하기 위해 스위블을 사용하는 것이 좋습니다. 튜빙 1.2 및 튜빙 세트 1.4(그림 3A)는 스위블을 사용하기에 적합하지 않습니다. 연구원이 스위블을 사용해야 하는 경우 시스템을 개선해야 합니다. 혈액 세포의 재주입은 혈당과 인슐린의 확립된 정상 상태에 영향을 미치지 않습니다. 본 방법은 동위원소를 이용한 대사체학 연구에도 적용될 수 있다. 예를 들어, 13C-글루코스가 정맥에 지속적으로 주입되면 전신 대사 회전율과 세포 내 중간 대사 산물을 측정할 수 있습니다28. 따라서 이것은 포도당 대사를 분석하는 데 유용한 방법입니다.

공개 사항

저자는 상충되는 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 연구는 우수한 젊은 연구자를 위한 선도 이니셔티브(Leading Initiative for Excellent Young Researchers, 문부과학성)의 지원을 받았습니다. 과학 연구 보조금 (B) (보조금 번호 JP21H02352); 일본 의료연구개발기구(AMED-RPIME, 허가 번호 JP21gm6510009h0001, JP22gm6510009h9901); 우에하라 기념 재단; 대사 장애 연구를 위한 아스텔라스 재단; 스즈켄 기념 재단, 아키야마 생명 과학 재단, 나리시게 신경 과학 연구 재단. 또한 이 원고의 초안을 편집해 주신 Nur Farehan Asgar 박사님께도 감사드립니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
접착제접착제 Henkel AG & Co. KGaALOCTITE 454
ELISA 키트(C-펩타이드)Morinaga Institute of Bilogical Science IncM1304마우스 C-펩타이드 ELISA 키트
ELISA 키트(인슐린)FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation633-03411LBIS 마우스 인슐린 ELISA 키트(U형)
핸디 혈당 측정기Nipro Co.11-777프리 스타일 프리덤 라이트
인슐린(100U/ml)Eli Lilly & Co.428021014휴물린 R(100 U/ml)
마우스재팬 SLC 주식회사C57BL/6NCrSlcC57BL
봉합사츠메 제작소C-23S-560 No.2멸균
주사기펌프 펌프 시스템 주식회사NE-1000
합성 봉합사VÖ MELHR-17
튜빙1AS ONE Corporation9-869-01LABORAN(R) 실리콘 튜브
튜빙2Fisher Scientific427400BD Intramedic PE 튜빙
튜빙IGARASHI IKA KOGYO CO., LTD.size5폴리에틸렌 튜브 size5
나3

참고문헌

  1. Seaquist, E. R., et al. Hypoglycemia and diabetes: A report of a workgroup of the american diabetes association and the endocrine society. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 98 (5), 1845-1859 (2013).
  2. Amiel, S. A., et al. Hypoglycaemia, cardiovascular disease, and mortality in diabetes: epidemiology, pathogenesis, and management. The Lancet Diabetes and Endocrinology. 7 (5), 385-396 (2019).
  3. Leanne Riley Mean fasting blood glucose. , World Health Organisation. https://www.who.int/data/gho/indicator-metadata-registry/imr-details/2380 (2022).
  4. Umpierrez, G., Korytkowski, M. Diabetic emergencies-ketoacidosis, hyperglycaemic hyperosmolar state and hypoglycaemia. Nature Reviews Endocrinology. 12 (4), 222-232 (2016).
  5. Sprague, J. E., Arbeláez, A. M. Glucose counterregulatory responses to hypoglycemia. Pediatric Endocrinology Reviews. 9 (1), 463-473 (2011).
  6. Toda, C., et al. Distinct effects of leptin and a melanocortin receptor agonist injected into medial hypothalamic nuclei on glucose uptake in peripheral tissues. Diabetes. 58 (12), 2757-2765 (2009).
  7. Toda, C., et al. Extracellular signal-regulated kinase in the ventromedial hypothalamus mediates leptin-Induced glucose uptake in red-type skeletal muscle. Diabetes. 62 (7), 2295-2307 (2013).
  8. Toda, C., Kim, J. D., Impellizzeri, D., Cuzzocrea, S., Liu, Z. -W., Diano, S. UCP2 regulates mitochondrial fission and ventromedial nucleus control of glucose responsiveness. Cell. 164 (5), 872-883 (2016).
  9. Lee, M. L., et al. Prostaglandin in the ventromedial hypothalamus regulates peripheral glucose metabolism. Nature Communications. 12 (1), 2330(2021).
  10. Jessen, N., Goodyear, L. J. Contraction signaling to glucose transport in skeletal muscle. Journal of Applied Physiology. 99 (1), 330-337 (2005).
  11. Shiuchi, T., et al. Induction of glucose uptake in skeletal muscle by central leptin is mediated by muscle β2-adrenergic receptor but not by AMPK. Scientific Reports. 7 (1), 15141(2017).
  12. Ayala, J. E., et al. Hyperinsulinemic-euglycemic clamps in conscious, unrestrained mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 57, e3188(2011).
  13. Hughey, C. C., Hittel, D. S., Johnsen, V. L., Shearer, J. Hyperinsulinemic-euglycemic clamp in the conscious rat. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 48, e2432(2010).
  14. Ayala, J. E., Bracy, D. P., McGuinness, O. P., Wasserman, D. H. Considerations in the design of hyperinsulinemic-euglycemic clamps in the conscious mouse. Diabetes. 55 (2), 390-397 (2006).
  15. DeFronzo, R. A., Soman, V., Sherwin, R. S., Hendler, R., Felig, P. Insulin binding to monocytes and insulin action in human obesity, starvation, and refeeding. Journal of Clinical Investigation. 62 (1), 204-213 (1978).
  16. Czech, M. P. Insulin action and resistance in obesity and type 2 diabetes. Nature Medicine. 23 (7), 804-814 (2017).
  17. Saisho, Y. β-cell dysfunction: Its critical role in prevention and management of type 2 diabetes. World Journal of Diabetes. 6 (1), 109(2015).
  18. Mittendorfer, B., Patterson, B. W., Smith, G. I., Yoshino, M., Klein, S. β Cell function and plasma insulin clearance in people with obesity and different glycemic status. Journal of Clinical Investigation. 132 (3), 154068(2022).
  19. Nchienzia, H., et al. Hedgehog interacting protein (Hhip) regulates insulin secretion in mice fed high fat diets. Scientific reports. 9 (1), 11183(2019).
  20. Tomita, T., Doull, V., Pollock, H. G., Krizsan, D. Pancreatic islets of obese hyperglycemic mice (ob/ob). Pancreas. 7 (3), 367-375 (1992).
  21. Uchida, K., et al. Lack of TRPM2 impaired insulin secretion and glucose metabolisms in mice. Diabetes. 60 (1), 119-126 (2011).
  22. Zhu, Y. X., Zhou, Y. C., Zhang, Y., Sun, P., Chang, X. A., Han, X. Protocol for in vivo and ex vivo assessments of glucose-stimulated insulin secretion in mouse islet β cells. STAR Protocols. 2 (3), 100728(2021).
  23. Moullé, V. S. Autonomic control of pancreatic beta cells: What is known on the regulation of insulin secretion and beta-cell proliferation in rodents and humans. Peptides. 148, 170709(2022).
  24. Honzawa, N., Fujimoto, K., Kitamura, T. Cell autonomous dysfunction and insulin resistance in pancreatic α cells. International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 3699(2019).
  25. Siddiqui, A., Madhu, S. V., Sharma, S. B., Desai, N. G. Endocrine stress responses and risk of type 2 diabetes mellitus. Stress. 18 (5), 498-506 (2015).
  26. Chan, O., Sherwin, R. Influence of VMH fuel sensing on hypoglycemic responses. Trends in Endocrinology & Metabolism. 24 (12), 616-624 (2013).
  27. Donovan, C. M., Watts, A. G. Peripheral and central glucose sensing in hypoglycemic detection. Physiology. 29 (5), 314-324 (2014).
  28. TeSlaa, T., et al. The source of glycolytic intermediates in mammalian tissues. Cell Metabolism. 33 (2), 367-378.e5 (2021).

재인쇄 및 허가

태그

의식이 있는 쥐의 고혈당 클램프 및 저혈당 클램프
문의하기
사서에게 추천하기

개인정보

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.