여기에는 머무름 시간, 이동성 및 단편화를 사용하여 안정 동위원소 라벨링을 통해 지질 구조를 스크리닝하는 방법이 제시되어 있습니다.
이 논문에서
요약
초록
지질은 매우 다양하며, 지질 구조와 구성의 작은 변화도 중요한 생물학적 기능에 큰 영향을 미칠 수 있습니다. 안정 동위원소 표지(SIL)는 지질 분포, 동원 및 대사 연구뿐만 아니라 새로운 지질 합성 연구에 여러 가지 이점을 제공합니다. SIL 기법을 성공적으로 구현하려면 내인성 분자에서 간섭을 제거해야 합니다. 본 연구에서는 생물학적 샘플에서 SIL 지질을 스크리닝하기 위한 고처리량 분석 프로토콜에 대해 설명합니다. 모기 난소 발달 중 lipid de novo 식별의 예가 표시됩니다. 상보적 액체 크로마토그래피, 트랩 이온 이동성 분광법 및 질량 분석법을 사용하면 단일 스캔(<1시간)에서 단일 샘플에서 분리 및 지질을 할당할 수 있습니다. 설명된 접근 방식은 데이터 종속 수집 및 데이터 독립적 수집의 최근 개발을 활용하며, 이동성 트랩에서의 병렬 축적을 사용한 후 순차적 단편화 및 충돌 유도 해리를 사용합니다. 지방산 사슬 수준에서 SIL을 측정하면 모기의 난소 발달 중 지질 역학의 변화를 알 수 있습니다. lipids de novo 구조는 머무름 시간, 이동성 및 단편화 패턴에 따라 확실하게 할당됩니다.
서론
지질 데이터를 분석할 때 안정 동위원소 표지(SIL)는 살아있는 유기체의 대사 경로를 평가하는 효과적인 방법입니다. 이 방법에서는 분석물 내의 원자가 13C또는 2H를 포함하는 안정 동위원소로 대체됩니다. 이 동위원소는 전구체에 추가로 통합되며, 이는 나중에 지방산 내에 내장되어 그들이 존재하는 영역을 표시합니다. 이러한 동위원소를 사용하면 지질의 분포와 대사를 식별할 수 있으며, 이는 표지되지 않은 배경1과 대조를 이룬다. 일반적인 질량 분석 플랫폼은 내인성 분자에서 오는 신호를 구별할 수 없습니다2. SIL의 성공을 위해서는 초고해상도 분석 도구를 사용해야 합니다. 고분해능 Trapped Ion Mobility Spectrometry-Parallel Accumulation-Sequential Fragmentation-Time-of-Flight Tandem Mass Spectrometry(LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS)와 결합된 액체 크로마토그래피를 통해 표지된 종과 표지되지 않은 종을 분리할 수 있습니다2. LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS 분석의 장점은 머무름 시간(RT) 및 이동성에 따라 MS 신호를 필터링할 수 있으므로 내인성 분자의 잠재적 간섭을 줄이고 원하는 모든 종의 정량화 및 분리를 줄일 수 있다는 것입니다2. TIMS에서 이온은 먼저 가스 이동상에 대해 고정되어 유지된 후 이동성에 따라 방출됩니다. 이는 이전 IMS 계측3보다 낮은 전압에서 작동하면서 고해상도 모빌로그램을 제공합니다. Mobilograms는 드리프트 시간에 대한 전하까지의 질량을 나타내는 플롯으로, 드리프트 시간과 중첩량을 기반으로 화합물을 구별하는 데 사용할 수 있습니다4.
추가적인 PASEF 기법을 사용하면 감도를 희생하지 않고 염기서열분석 속도가 크게 향상됩니다5. PASEF 이론은 이온의 축적 후 이온의 이동성 순서에 따라 순차적으로 방출되는 것을 포함합니다. 이것은 이온이 이동성에 평행하게 정렬되어 축적됨으로써 수행됩니다. 이러한 방식으로 축적되면 이온 손실이 방지됩니다. 또한, 전구체 이온 선택은 이온의 축적 및 방출과 동시에 발생합니다. 이 방법을 통해 PASEF는 PASEF를 사용하지 않는 TIMS 기기의 일반적인 스캔당 개별 전구체가 아닌 각 TIMS 스캔 중에 여러 전구체를 직렬로 선택합니다. 전구체 이온이 프레임당 약 100ms의 TIMS 스캔 내에서 2ms 피크로 동시에 축적 및 방출되면 신호는 한 자릿수 이상 증폭되어 신호 대 잡음비3이 증가합니다. TIMS에 PASEF를 추가하면 MS/MS의 효율성이 향상됩니다. TIMS-PASEF는 MS/MS와 결합되어 보다 효율적인 단편화가 가능합니다. 기존의 MS/MS 검출과 달리 TIMS-PASEF에서 전구체 신호가 압축되고 단편 이온이 전구체3의 TIMS 용리 시간 및 이온 이동도 위치로 동시에 검출됩니다.
질량 분석기에서 데이터를 수집할 때 원하는 스캔 모드 옵션이 있습니다. DDA(Data Dependent Acquisition)는 MS1 스캔에서 전구체 이온을 단편화하고 MS2 스캔을 수행하기 전에 이온의 함량을 기준으로 선택합니다. 이 스캔 모드는 가능한 한 많은 전구체를 단편화합니다. DDA 접근법은 표적화되며 결과는 이온 선택3에 따라 달라집니다. 그러나 DDA-PASEF는 종종 반복 횟수 간의 재현성에 문제가 있습니다. DDA는 집중 분석에 탁월한 도구이지만, 복잡한 혼합물은 데이터 수집에 더 큰 어려움이 있다6. 이는 소량의 이온만 동시에 모니터링할 수 있기 때문입니다3. DIA(Data Independent Acquisition)는 m/z의 사전 선택된 창을 강도와 독립적으로 단편화하고 모두범위 7 내에서 스캔하는 방법입니다. 이 스캔 모드를 사용하면 전체 이온 클라우드가 IMS에서 질량 분석기3으로 전송됩니다. 단백질체학 연구에서는 DDA에 비해 더 짧은 시간 내에 더 많은 양의 단백질을 정량화할 수 있습니다. 또한 DIA는 DDA에 비해 더 적은 m/z 값을 누락합니다. 따라서 이 대안은 DDA보다 신호 대 잡음비에서 데이터 재현성이 크게 향상되고 정량화가 더 우수함을 보여주었습니다. 본 연구에서 우리의 목표는 Tose et al.2가 보고한 방법에 따라 DIA를 구현하는 것입니다. 신호의 재현성과 강도를 개선하여 DDA 및 DIA 획득을 활용하여 생물학적 샘플의 SIL 지질 동원, 분포 및 대사에 대한 더 확실하고 명확한 정보를 얻었습니다.
프로토콜
1. 시료 전처리
- 곤충 해부
- Aedes aegypti 모기의 난소는 생후 7일이 되었을 때 마이크로니들을 사용하여 인산염 완충 식염수에서 해부합니다.
- 마이크로니들을 사용하여 인산염 완충 식염수에서 8개의 난소를 채취하고 -80°C의 1.5mL 미세원심분리기 튜브에 보관합니다.
- 생물학적 복제에서 난소를 수집합니다.
- 지질 추출
- 10ppm의 농도로 수집된 8개의 난소에 10μL의 내부 표준물질(ISTD)을 추가합니다. ISTD는 1-펜타데카노일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린-D7(15:15)의 7중수소가 함유된 표지된 지질 혼합물입니다. 0-18:1 (D7) PC), 리소포스파티딜콜린-D7(18:1 (D7) 라이소 PC), 1-펜타데카노일-2-옥타데세노일-글리세로-3-포스포에탄올아민-D7(15:0-18:1(D7) PE), 1-올레오일-2-하이드록시-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-D7(18:1(D7) 라이소 PE), 1-펜타데카노일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포이노시톨-D7(15:0-18:1(D7) PI), 1-펜타데카노일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포-L-세린-D7( 15:0-18:1 (D7) PS), 1,2-디펜타데카노일-3-옥타데세노일-sn-글리세롤(15:0-18:1-15:0(D7) 태그), 1-펜타데카노일-2-옥타데세노일)-sn-글리세롤-D7(15:0-18:1(D7) DAG), 2-옥타데세노일-sn-글리세롤-D7(18:1 MAG(D7)), 콜레스테롤올레에이트-D7(18:1(D7) 콜 에스테르).
- 실온에서 마를 때까지 기다리십시오. 100μL의 부탄올/메탄올과 3μL의 부틸화 하이드록시톨루엔을 추가합니다. 1.5mL 폴리프로필렌 유봉으로 10초 동안 수동으로 균질화합니다.
- 유봉을 200μL의 부탄올/메탄올로 헹구고 균질화된 용액과 결합합니다.
- 마이크로 원심 분리기 튜브를 실온과 중간 전력에서 30 분 동안 초음파 처리합니다.
- 20 °C에서 10분 동안 1600 x g 의 원심분리기 튜브. 상층액을 300 μL의 실란화 유리 인서트가 있는 자동시료주입기 바이알로 옮깁니다.
2. 기기 설정
- 이동상 준비
- 아세토니트릴, 물, 이소프로판올을 각각의 비율로 사용하여 30:40:30(이동상 A) 및 10:5:85(이동상 B)의 조성으로 이동상을 준비합니다. 두 이동상 모두에서 물에 10mmol/L 포름산암모늄을 첨가하고 0.1% 포름산을 첨가하여 완충 조건을 만듭니다.
- 물 3.15mL에 포름암모늄 10g을 계량합니다. 이 용액 500mL를 물 12.5mL에 넣습니다. 순서대로 250mL 용량의 플라스크에 넣고 플라스크의 약 2/3까지 이소프로판올을 채웁니다. 휘젓는다가 섞는다.
- 250μL의 포름산(85%)을 넣고 25mL의 충전 라인에 25mL의 아세토니트릴과 이소프로판올을 채운 다음 혼합합니다.
- MS 시스템의 MS 설정에서 화면 왼쪽의 최소 스캔 설정으로 50을 선택하고 최대 스캔 설정으로 1850을 선택하여 질량 범위를 결정합니다.
- 양이온 모드로 극성을 선택합니다. 스캔 모드를 DIA-PASEF로 선택합니다. 이렇게 하려면 다음 LC 매개변수를 사용하여 이전 DDA Method에서 Tune and open analysis method를 선택합니다.
- 그래디언트 분리의 경우:
샘플 주입: 0% B, 유지 시간 1분
55% B로 늘리고 6.4분까지 유지합니다.
65% B로 늘리고 24분까지 유지합니다.
88% B로 높이고 40.8분까지 유지합니다.
95% B로 늘리고 48.1분까지 유지합니다.
35% B로 낮추고 56분까지 유지합니다.
0% B로 낮추고 60분까지 유지합니다. - HPLC 조건의 경우:
주입량: 5 μL
용매 속도: 0.25mL/min
총 실행 시간: 60분, 5분은 컬럼을 사전 컨디셔닝하는 데 사용됩니다. - 컬럼을 액체 크로마토그래프에 삽입하여 액체 크로마토그래프를 준비합니다. 블랭크를 실행하여 컬럼을 청소하고 누출을 테스트합니다. 이것은 압력이나 흐름을 유지하지 않는 기기에서 볼 수 있습니다.
- 그래디언트 분리의 경우:
- 양이온 모드로 극성을 선택합니다. 스캔 모드를 DIA-PASEF로 선택합니다. 이렇게 하려면 다음 LC 매개변수를 사용하여 이전 DDA Method에서 Tune and open analysis method를 선택합니다.
- 새 Method를 만들려면 아래에 설명된 단계(그림 1 그리고 그림 2).
- 소프트웨어를 열고 모든 기기 연결을 클릭합니다. 연결에 성공하면 LC 시스템에서 신호음이 한 번 울리고 제어 화면의 오류 메시지 없이 상태 상자에 HyStar가 나열됩니다.
- Acquisition 탭을 클릭합니다. Sample Table Navigator에서 태그 드롭다운 메뉴를 찾아 이전 방법을 선택합니다.
- 최신 샘플 표의 두 배입니다. Save As...(다른 이름으로 저장) 을 클릭하고 YYYYMMDD_LIP_C30_(XXXX) 형식으로 새 샘플 목록을 저장합니다. 여기서 (XXXX)는 분석의 짧은 설명자입니다.
- 분리 방법을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 Edit Method를 클릭합니다. Edit Module Method(모듈 방법 편집)를 클릭합니다.
- Download( 다운로드)를 클릭합니다. 성공하면 다운로드 성공이 나타납니다. 저장하지 않고 화면을 닫는 방법.
- MS 설정에서 TIMS 설정으로 이동하여 0.70에서 1/k0 시작을 선택하고 1.85에서 1/k0 끝을 선택합니다. 램프 시간을 150ms로 설정합니다. 이를 통해 듀티 사이클과 램프 속도가 자동으로 조정됩니다.
- 아래쪽 창에서 소스 탭을 선택합니다. 소스 유형을 ESI 로 선택하고 엔드 플레이트 오프셋을 800V로, 캐필러리를 4500V로 설정합니다. 분무기 상자를 확인하고 압력을 4.0bar로 설정합니다. 건조 가스를 4.0L/min으로 설정하고 건조 온도를 250°C로 설정합니다.
- 소스 탭의 오른쪽에서 Tune 탭을 선택합니다. General Sub 탭을 클릭하고 transfer 제목 아래에서 다음 매개변수를 확인합니다.
편향 1 델타: 70 V
퍼널 1 RF: 250vpp
isCID 에너지: 0 eV
깔때기 2 RF: 250vpp
다극 RF: 500 vpp.- collision cell(충돌 셀) 제목 아래에서 다음 매개변수를 확인합니다.
충돌 에너지: 6.0 eV
충돌 RF: 1200 vpp. - Quadrupole 제목 아래에서 다음 매개변수를 확인하십시오.
이온 에너지: 6 eV
낮은 질량: 250m/z. - focus pre-TOF 탭에서 다음 매개변수를 확인합니다.
전송 시간: 45 μs
사전 펄스 저장: 5.0μs.
- collision cell(충돌 셀) 제목 아래에서 다음 매개변수를 확인합니다.
- Processing Sub 탭을 클릭합니다. 질량 스펙트럼 피크 검출에서 다음 매개변수를 확인하십시오.
절대 임계값: 667
절대 임계값(100ms AccuTime당): 445.- Mobility peak detection(이동성 피크 감지)에서 다음 매개변수를 확인합니다.
절대 임계값: 30.00.
- Mobility peak detection(이동성 피크 감지)에서 다음 매개변수를 확인합니다.
- TIMS 서브탭을 누릅니다. offsets(오프셋) 탭에서 다음 매개변수를 확인합니다.
Δt1: -20 V
Δt2: -150의 볼트
Δt3: 70의 볼트
Δt4: 150의 볼트
Δt5: 0 V
Δt6: 150의 볼트
충돌 셀: 300V. - tune 탭 오른쪽에서 MS/MS 탭을 클릭합니다. precursor ions 탭에서 다음 매개변수를 확인합니다.
PASEF 경사로 수: 8
최소 요금 : 1
최대 충전:1.- scheduling(스케줄링) 탭에서 Advanced(고급 )를 클릭하고 다음 매개변수를 확인합니다.
강도: 0,1500, 5000, 10000
반복: 1, 10, 5, 1
강도 임계값: 1500. - active exclusion 탭에서 다음 매개 변수를 확인합니다.
활성 제외 확인 표시
릴리스 후: 0.4분 - Collision Energy settings(충돌 에너지 설정)에서 다음 매개변수를 확인합니다.
K0 (V-s/cm3): 0.70, 1.60
충돌 에너지 (eV) : 20.00, 35.00. - isolation width settings(격리 폭 설정)에서 다음 매개변수를 확인합니다.
질량 (m / z) : 622, 1222
너비 (m / z) : 1.00 2.50.
- scheduling(스케줄링) 탭에서 Advanced(고급 )를 클릭하고 다음 매개변수를 확인합니다.
- DIA -PASEF 설정: 왼쪽의 MS 설정 스캔 모드에서 DIA-PASEF 를 선택합니다. MS/MS 탭에서 창 편집기를 선택합니다. 여기에서 다음 매개변수를 확인합니다(그림 3).
창 설정 : 질량 폭 : 50 Da; 질량 겹침 : 0.0 Da; 다각형에서 계산: 질량 단계; 이동성 창 수: 1.
3. 캘리브레이션
- 기기 교정(그림 4)
- 캘리브레이션(Calibration) 하위 탭에서 m/z를 클릭하고 드롭 박스에서 튜닝 믹스(Tuning Mix)를 선택한 다음 오른쪽 하단 모서리에 있는 캘리브레이션(Calibrate)을 클릭합니다.
- 점수가 100%가 될 때까지 보정 을 계속 클릭합니다.
- 이제 이동성 탭을 선택하고 100% 보정 점수에 도달할 때까지 위와 동일한 단계를 수행합니다.
- 캘리브레이션 곡선
- 10 μL의 중수소화 내부 표준물질 혼합물을 함유한 스파이크 지질 내부 표준물질 혼합물.
0.1-500ng/mL의 표준 혼합물과 10μL의 중수소화된 내부 표준 혼합물로 구성된 7개의 보정 지점을 사용합니다. - 2에서 이미 설명한 PASEF MS/MS 패턴을 기반으로 지방산 사슬에 수동으로 주석을 추가합니다.
- 10 μL의 중수소화 내부 표준물질 혼합물을 함유한 스파이크 지질 내부 표준물질 혼합물.
- SIL 라벨링 효율성
- 동위원소를 포함하는 SIL의 면적과 SIL이 포함되지 않은 동위원소를 포함하는 동위원소의 면적의 비율을 계산합니다.
- 모든 위치에서 라벨이 지정된 원자를 찾을 확률을 결정하여 이론적 패턴을 계산합니다.
- 데이터 분석 소프트웨어에서 시뮬레이션된 이론적 패턴에 실험 동위원소 프로파일을 맞추어 SIL 농축을 계산합니다.
- 달리기 시작
- Thermometer 버튼을 클릭하여 컬럼 오븐을 활성화합니다. 밸브 버튼을 클릭하여 펌프를 활성화합니다.
- MS 방법을 이전에 저장한 방법으로 설정합니다. 주입 부피가 5μL이고 라인 1이 바이알 20:1을 대상으로 하는지 확인합니다.
- 바이알 20:1의 IPA/ACN이 50%인지 확인합니다. 샘플 목록을 저장합니다.
- 시퀀스를 시작하고 성공적으로 주입이 이루어졌는지 확인합니다(주입되었다는 메시지가 시스템에 표시되어 확인됨).
- 1 행을 복사하여 아래에 붙여 넣어 새 행을 생성하십시오. 현재 실험에 따라 라인 2를 샘플로 채웁니다. 오토샘플러의 올바른 위치가 사용되었는지 확인하십시오.
- 이동상이 신선인 경우 먼저 제조업체의 지질 혼합물 표준물질을 주입하여 피크 모양 테스트를 수행합니다. 이전 결과와 비교합니다. 2 표준물질은 1-펜타데카노일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(15:0-18:1 PC), 리소포파티딜콜린(18:1 Lyso PC), 1-펜타데카노일-2-옥타데세노일-글리세로-3-포스포에탄올아민(15:0-18:1 PE), 1-올레오일-2-하이드록시-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(18:1 라이소 PE), 1-펜타데카노일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포이노시톨(15:0-18:1 PI), 1-펜타데카노일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포-L-세린(15:0-18:1 PS), 1,2- 디펜타데카노일-3-옥타데세노일-sn-글리세롤(15:0-18:1-15:0 태그), 1-펜타데카노일-2-옥타데세노일)-sn-글리세롤(15:0-18:1 DAG), 2-옥타데세노일-sn-글리세롤(18:1 MAG), 콜레스테릴 올레에이트(18:1 콜 에스테르).
- 새 라인에 라인 1에서 사용된 사전 컨디셔닝 방법이 아닌 올바른 분리 방법이 있는지 확인하십시오. MS 방법(현재 날짜의 방법)이 올바른지 확인하십시오.
- 올바른 처리 방법이 로드되고 자동화된 프로세스 실행 이 활성화되어 있는지 확인합니다.
- 현재 실행이 완료된 후 샘플이 분석되도록 샘플 목록을 저장합니다.
4. 데이터 분석
- 개방형 데이터 분석 소프트웨어(그림 5). 왼쪽 상단에서 파일 버튼을 클릭하고 열기를 선택합니다.
- 원하는 파일을 선택합니다. 파일 이름을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 속성을 선택합니다.
- Calibration Status(보정 상태)를 선택합니다(그림 6). 드롭다운 상자에서 질량분석기에 대한 Initial Calibration을 선택합니다. 모든 오류가 1ppm 미만인지 확인하십시오.
- 그런 다음 Initial Mobility Calibration 을 선택하고 오류가 1ppm 미만인지 확인합니다.
- 크로마토그램을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 크로마토그램 편집을 선택합니다(그림 6C). Type(유형)에서 드롭다운 상자를 클릭하고 Extracted Ion Chromatogram(추출된 이온 크로마토그램)을 선택합니다(그림 6D). 필터에서 모든 MS를 선택하고 스캔 모드에서 모두를 선택합니다. 이것은 관심 분자의 단편만이 아닌 관심 분자의 피크를 보기 위한 것입니다.
- 그 아래에는 분자 선택을 위한 두 가지 필터 옵션이 있습니다: 질량 또는 공식. 질량 을 선택하면 관심 분자의 이론적 m/z를 선택할 수 있습니다. 이 경우 829.7985m/z를 선택합니다. Formula(공식 )를 선택하면 분자에 대한 공식과 크로마토그램에 대한 관심 이온 형태를 선택할 수 있습니다. 이 경우 암모늄 [M + NH4]를 선택하십시오. 이는 이동상의 암모늄 완충액이 이 이온 형태의 이온화에 유리하기 때문입니다(그림 7).
- 너비의 경우 ±1을 선택합니다. 극성의 경우 양극 모드를 유지하는지 확인하십시오. 이동성 에서 1.455-1.465 를 선택합니다. 이것은 이러한 값에 속하지 않는 분자를 필터링하고 관심 분자를 분리하기 위해 수행됩니다.
- 매개 변수를 선택했으면 오른쪽 상단에서 추가 > 확인을 클릭합니다. 잠시 후 소프트웨어가 선택 항목을 처리하고 크로마토그램을 출력합니다.
- 관심 피크의 시작 부분에서 기준선을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 피크의 끝을 누른 상태에서 드래그합니다. 이 수동 통합은 해당 머무름 시간 내에 단편의 실시간 질량 스펙트럼을 제공합니다.
- 모빌로그램
- 화면 왼쪽의 Mobilogram 을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 Edit Mobilogram 을 선택합니다(그림 8). Edit Mobilogram Traces(모빌로그램 추적 편집)라는 창이 나타납니다. C.e.i.1에서 C.e.i.5까지 동일한 단계를 수행합니다(그림 9).
- Retention Time(머무름 시간)에 관심 피크의 머무름 시간을 입력합니다. 이 경우 37분 45초-37분 55초입니다.
- 매개변수를 선택했으면 오른쪽 상단에서 추가 > 확인을 클릭합니다. 잠시 후 소프트웨어가 선택 항목을 처리하고 크로마토그램을 출력합니다.
- 추출된 이온의 경우 이온 목록이 형성될 때까지 4.2.3.1-4.3.2.2단계를 반복합니다.
- MS 창 하단에서 Profile MS and Fragment MS를 선택합니다. 이렇게 하면 전체 스캔 및 PASEF에서 이온의 스펙트럼을 볼 수 있습니다.
- 스펙트럼 보기에서 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 Copy Compound Spectra를 선택합니다. 오른쪽에 나타나는 스펙트럼 데이터를 통해 분해능, 분해능, 강도 및 신호 대 잡음비(S/N; 그림 10).
- 가공
- 데이터를 처리하려면 크로마토그램과 이동도 피크를 수동으로 통합하여 관심 분자에 대한 중요한 정보를 얻을 수 있습니다(그림 10).
- 찾기를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 Integrate Only chromatogram 또는 mobilogram을 선택합니다(그림 11). 마우스 왼쪽 버튼을 클릭하고 원하는 피크를 강조 표시합니다. 이 정보에는 보존 시간, 면적, S/N 및 이동성이 포함됩니다.
결과
안정 동위원소 표지는 암컷 모기 난소의 지질 역학 연구에서 트리글리세라이드의 시각화를 용이하게 합니다. 2D 이동성 도메인에서 트리글리세라이드 48:1은 이동성 1/K0과 관련하여 특정 머무름 시간을 가진 영역에 표시됩니다. 트리글리세라이드의 강도는 더 어두운 파란색 선으로 시각화할 수 있습니다. 다른 반점은 난소 내에서 발견되는 추가적인 트리글리세리드를 나타냅니다. 머무름 시간과 이동성은 질량과 구조의 차이로 인해 달라지므로 그래프의 다른 영역에 나타납니다. 이러한 차이는 샘플의 트리글리세라이드를 구별할 때 중요합니다(그림 12A,B). 이 영역의 증폭된 질량 스펙트럼 투영은 822m/z에서 암모늄 이온과 결합된 48:1 트리글리세라이드 이온을 표시합니다. 50:2 및 52:3과 같은 다른 트리글리세리드도 시각화되지만 구조, 크기 및 단편화의 차이로 인해 더 높은 m/z 영역에서 시각화됩니다(그림 12C, D). 이 예에서는 중수소로 표시된 동위원소를 분석하는 데 관심이 있었습니다. TG 48:1 영역을 추가로 증폭하여 동위원소로 표지된 이온을 시각화했습니다. 이온의 중수소의 양이 증가함에 따라 피크의 강도가 감소합니다. 이것은 고중수소 표지 이온의 발생이 적기 때문에 발생합니다. m/z 비율은 질량 증가로 인해 중수소가 첨가될 때마다 약간 증가합니다. 이러한 강도는 시료 내에 존재하는 각 동위원소의 양을 추가로 결정합니다.
질량 스펙트럼에서 단편의 강도를 평가할 때는 표지되지 않은 동위원소를 2H로 표지된 동위원소와 비교해야 합니다(그림 12E). 파란색은 레이블이 지정되지 않은 강도이며 검은색 점선은 이론적 강도로 표시됩니다. 빨간색으로 표시된 동위원소 결과가 관찰됩니다. 그들은 레이블이 지정되지 않은 강도와 이론적인 강도보다 더 큰 강도를 표시합니다. 동위원소 표지를 통한 종의 농축은 표지되지 않은 이론적 종보다 더 큰 강도를 산출합니다. 강도가 클수록 지역 불일치로 인한 트리글리세라이드를 시각화할 수 있습니다. 단편화는 또한 PASEF가 전체 스캔 MS/MS에 비해 증가된 단편화를 제공하기 때문에 지질 식별에 중요한 역할을 합니다. 이는 지질 사슬의 지방산이 서로 다른 패턴으로 단편화될 수 있기 때문에 스펙트럼의 선은 트리글리세라이드의 단편화 과정을 기반으로 단편의 강도를 보여줍니다(그림 12F). 이것은 지방산에 대한 구조적 정보를 제공하고 종의 어떤 이성질체가 존재하는지 확인하는 데 도움이 됩니다. DIA 분석법의 데이터를 분석할 때 단편 수가 증가하므로 일반적인 DDA 분석법보다 MS/MS 스캔이 향상되고 식별이 우수합니다.
그림 1: 소프트웨어의 일반적인 홈 화면. 홈 화면에서는 Method를 생성하고 기기를 시작할 수 있습니다. (A) TIMS 및 MS/MS 제어 설정이 포함된 소프트웨어 화면. 화면 하단에는 악기에서 해당 컨트롤을 편집할 수 있는 소스 탭이 있습니다. (B) 튠 탭이 열린 소프트웨어 화면. (C) 여기에서 일반 조율을 위해 악기를 준비할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 튠(Tune) 탭이 열린 소프트웨어 화면. 여기에서 처리 튜닝 매개변수를 편집할 수 있습니다. (A) 튠 탭이 열린 소프트웨어 화면. 여기서 악기의 TIMS 부분에 대한 튜닝 매개변수를 편집할 수 있습니다. (B) 화면 하단에서 MS/MS 탭이 선택된 소프트웨어 화면. (C) 여기에서 탠덤 질량 분석기의 매개변수를 편집할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: DIA-PASEF 창 너비를 선택하기 위한 화면. 여기에서 풍부함을 위해 색상을 편집할 수 있을 뿐만 아니라 데이터 수집을 위해 창의 크기를 편집할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 질량 대 전하 비율(m/z)에 의한 질량 분석기의 보정. 교정을 위해 참조 목록이 선택됩니다. (A) 오른쪽 하단에서 허용 가능한 값이 나타날 때까지 보정 버튼을 클릭합니다. 이동성에 의한 이온 이동도 분광기의 보정. 교정을 위해 참조 목록이 선택됩니다. (B) 오른쪽 하단에서 허용 가능한 값이 나타날 때까지 보정 버튼을 클릭합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 데이터 분석 소프트웨어의 일반적인 홈 화면. 파일을 열려면 왼쪽 상단의 파일 버튼을 클릭하여 옵션이 있는 드롭 상자를 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 데이터 분석 소프트웨어. (A) 교정 결과를 선택하는 방법 및 (B) 교정 범주를 선택하여 성공적인 교정을 확인하는 소프트웨어 화면. (C) 분석할 크로마토그램 선택 및 (D) 추출된 이온 크로마토그램 선택. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 팝업 화면. (A) 질량 필터와 (B) 수식 필터로 이온 크로마토그램을 선택하고 추출하기 위한 팝업입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: 데이터 분석 소프트웨어. 소프트웨어 화면에는 왼쪽에서 분석을 위해 모빌로그램이 선택됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 9: 모빌로그램을 위한 팝업 화면. (A) 질량 필터 및 (B) 수식 필터로 추출된 이온 모빌로그램을 선택하기 위한 팝업. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 10: 데이터 분석 화면. (A) 소프트웨어 화면; 왼쪽에 강조 표시된 것은 추출된 이온 목록을 형성할 수 있습니다. (B) 추출된 이온의 화합물 스펙트럼이 바닥에 준비되는 데이터 분석 화면. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 11: 데이터 분석 화면. 화합물 스펙트럼의 수동 통합 결과를 보여주는 소프트웨어 화면. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 12: LC-TIMS MS 결과. (A) 2개의 H 라벨 자당 식단과 곤충 난소를 수유한 후 4일 후의 LC-TIMS MS를 2D 이동성 영역에서 볼 수 있습니다. (B) 라벨링된 샘플의 TG 48:1, TG 50:2 및 TG 52:3에 해당하는 신호에 대한 일반적인 MS 투영. (C) 증폭된 MS 영역 822 - 827 m/z 는 라벨링된 TG 프로파일을 나타냅니다. (D) 빨간색으로 표시된 MS 피크는 동위원소 프로필이 증폭되므로 특히 주의하십시오. (E-F) 2H 라벨이 부착 된 동위 원소 프로필은 빨간색으로 강조 표시됩니다. 라벨링되지 않은 동위원소 프로필 아래는 파란색으로 강조 표시됩니다. 이론적 동위원소 프로파일은 점선(검정색으로 13°C; 2 개H(녹색). 트리글리세라이드 48:3의 잠재적 구조도 오른쪽 상단에 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
토론
이 프로토콜의 사용을 평가할 때 DIA-PASEF 및 MS/MS 매개변수가 해당 트리글리세라이드에 적용되는지 확인하는 것이 중요합니다. 특히, 이동성 창과 창 너비는 트리글리세리드의 패턴을 따라야 합니다. 이는 DDA 방법을 사용하여 이전 실행으로 확인할 수 있습니다. 내부 표준물질에서 트리글리세라이드를 추적할 때 DIA 설정을 위한 창은 사전 식별된 모든 관심 분자를 포괄해야 합니다. 창은 모두 동일한 크기여야 하며 범위는 원하는 화합물의 m/z 및 1/k0 내에 속합니다(그림 7). 창의 크기가 잘못되면 단편화될 이온을 건너뛰고 수율 스펙트럼의 재현성이 낮아집니다. 기본적으로, 지질체학에서 창 범위를 적절하게 최적화하지 않으면 DIA 결과는 DDA 데이터를 향상시키지 않습니다. 창은 데이터 수집 프로세스를 위한 단계적 모양을 나타내야 합니다. 그렇지 않은 경우 설정된 DIA-PASEF 창 간의 매개변수를 전체 지질 프로필을 대표하도록 변경해야 합니다. 이 단계가 없으면 중요한 지방산이 획득된 데이터에서 생략됩니다.
기기적 한계에는 대부분 LC-MS 분석법과 함께 제공되는 제한이 포함됩니다. 여기에는 피크 폭의 멀티플렉싱 제한이 포함됩니다. 따라서 적절한 정량 분석을 위해 피크 용리를 최적화하여 데이터 수집 중 선택성을 촉진해야 합니다. 전형적으로, 이것은 DDA와 같은 선택된 전구체와 함께 있습니다. 그러나 DIA의 경우 전구체가 선택되지 않으므로 기기 선택성에 제한이 있을 수 있다8. DIA 방법은 단편화를 증가시키지만 여전히 한계가 있습니다. 가장 두드러진 한계는 전구체 선택성의 감소입니다. DIA 방법의 창은 일반적인 DDA 방법보다 5배에서 10배 넓습니다. 결과적으로, 더 큰 단편화를 허용하면서 듀티 사이클과 직렬 획득을 줄일 수 있습니다. 이것은 계단식 사중극자를 사용하는 질량 분광계에서 관찰할 수 있습니다. 전구체를 선택할 수 없고 어떤 이온을 단편화해야 하는지 알 수 없기 때문에 static isolation window는 m/z window를 커버하기 위해 순차적으로 순환됩니다. 이 창은 일반적인 DDA 방법보다 훨씬 크기 때문에 감도9를 얻기 위해서는 더 넓은 범위를 사용해야 한다. 따라서 직렬 획득의 문제로 인해 감도가 감소합니다. 두 번째 제한 사항은 라이브러리 생성과 관련이 있습니다. 시간이 많이 걸리고 배합하는 데 많은 양의 샘플이 필요합니다. 외부 라이브러리를 사용할 수 있지만, 단편화 패턴은 실험 조건과 기기 간에 다를 수 있다10.
안정 동위원소 라벨링을 사용하여 지질 데이터를 분석할 때는 유기체에서 발견되는 다른 분자의 간섭을 최소화해야 합니다. 이는 LC-TIMS-TOF-MS/MS2와 같은 고분해능 분석 도구를 사용하여 수행됩니다. 현재, 배경 잡음으로부터 표지된 동위원소를 분리하기 위해 이러한 고분해능 도구를 사용하는 것은 기존 방법에 비해 여전히 매우 새로운 방법입니다. 전통적인 기기 고려 사항은 가스 크로마토그래피에 의한 분리와 화학적 또는 전자 이온화를 구현합니다. 이를 통해 펜타플루오로벤질 브로마이드를 사용한 화학적 유도 또는 전자 이온화로 인한 단편화가 가능합니다. 최근에는 LC-MS가 동위원소 연구에 사용되고 있습니다. 고분해능 질량 분석기를 사용하면 질량 정확도가 높고 단일 동위원소가 아닌 여러 동위원소 라벨을 사용하여 다중 추적자를 수행할 수 있습니다. 기기의 고해상도가 없으면 13C,2 및 13C와 같은 다양한 라벨링 정도를 구별할 수 없습니다. 이를 통해 더 낮은 해상도10을 가진 기존 계측기에 비해 한 번의 실행으로 더 많은 정보를 얻을 수 있습니다.
DIA는 DDA보다 재현성이 우수하지만 다른 새로운 데이터 수집 방법도 비교할 수 있습니다. p-SMART와 같은 하이브리드 DIA-DDA 전략은 각 분석법의 장점을 결합하여 우수한 검출 및 정량화를 유지하면서 높은 수준의 표적 정성 분석을 유지할 수 있습니다. 이 방법에서, 하나의 일치하는 제품 이온을 사용하면 넓은 비표적 접근법에 비해 DIA 창을 좁힐 수 있으므로 DIA 감도와 선택성을 높일 수 있다8. 지질체학에서 트리글리세라이드의 구조는 이성질체 구조에 따라 달라질 수 있습니다. PASEF는 다양한 단편화 패턴을 시각화하여 종 식별을 개선할 수 있습니다2. DIA-PASEF를 사용하면 증가된 단편화는 DDA 방법의 한계로 인해 일반적으로 분해할 수 없는 다른 단편과 유사하게 많은 이성질체에 대한 정보를 제공합니다. 이 정보는 모기 난소에 어떤 지방산이 존재하는지에 대한 증거를 제공합니다. 이 방법은 다양한 유기체에 대한 다른 de novo 지질 연구에 적용될 수 있습니다.
공개 사항
Matthew Willetts와 Melvin A. Park는 timsTOF 상업용 기기 제조업체인 Bruker Daltonics Inc.의 직원입니다. 저자는 경쟁하는 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
감사의 글
저자들은 초기 분석법 개발 과정에서 Cesar Ramirez 박사의 기여를 인정하고 싶습니다. 이 연구는 체코 과학 재단(Czech Science Foundation)이 미네소타주에 R21AI167849한 NIAID 보조금 FGN의 프로젝트 22-21244S의 지원을 받았습니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Accucore C30 컬럼 | Thermo Fisher Scientific | 27826-252130 | |
| Bruker Compass 데이터 분석 | Bruker Daltonics Inc | 2363525870 | 버전 5.2 |
| D-Glucose-13C6 | Sigma-Aldrich | ||
| eppendorf 튜브 | Fisher Scientific | 14-282-300 | |
| EquiSplash Lipidomix | Avanti Polar Lipids | 330731-1EA | |
| 유리 바이알 | Thermo Fisher Scientific | 11-417-236 | |
| 중수 (2H2O) | Sigma-Aldrich | 1.13366 | |
| 폴리프로필렌 유봉 | Fisher Scientific | BAF199230001 | |
| Prominence LC-20 CE 초고속 액체 크로마토그래프 | Shimadzu | L20234651907 | |
| 실란화 유리 인서트 | Thermo Fisher Scientific | 03-251-826 | |
| Sucrose-13C12 | Sigma-Aldrich | ||
| timsTOF | Bruker Daltonics Inc | 1.84443E+11 | |
| 튜닝 믹스 캘리브레이션 표준 | 애질런트 테크놀로지 | 36 |
참고문헌
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- Tose, L. V., et al. Coupling stable isotope labeling and liquid chromatography-trapped ion mobility spectrometry-time-of-flight-tandem mass spectrometry for de novo mosquito ovarian lipid studies. Anal Chem. 94 (16), 6139-6145 (2022).
- Meier, F., Park, M. A., Mann, M. Trapped ion mobility spectrometry and parallel accumulation-serial fragmentation in proteomics. Mol Cell Proteomics. 20, 100138(2021).
- Basit, A., Pontis, S., Piomelli, D., Armirotti, A. Ion mobility mass spectrometry enhances low-abundance species detection in untargeted lipidomics. Metabolomics. 12 (3), 50(2016).
- Meier, F., et al. Online parallel accumulation-serial fragmentation (PASEF) with a novel trapped ion mobility mass spectrometer. Mol Cell Proteomics. 17 (12), 2534-2545 (2018).
- Koopmans, F., Ho, J. T. C., Smit, A. B., Li, K. W. Comparative analyses of data independent acquisition mass spectrometric approaches: DIA, WiSIM-DIA, and untargeted DIA. Proteomics. 18 (1), 1700304(2018).
- Fernández-Costa, C., et al. Impact of the identification strategy on the reproducibility of the DDA and DIA results. J Proteome Res. 19 (8), 3153-3161 (2020).
- Prakash, A., et al. Hybrid data acquisition and processing strategies with increased throughput and selectivity: PSMART analysis for global qualitative and quantitative analysis. J Proteome Res. 13 (12), 5415-5430 (2014).
- Tsou, C. C., et al. DIA-umpire: Comprehensive computational framework for data-independent acquisition proteomics. Nat Methods. 12 (3), 258-264 (2015).
- Triebl, A., Wenk, M. R. Analytical considerations of stable isotope labelling in lipidomics. Biomolecules. 8 (4), 151(2018).
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