이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

방법 논문

"Avatar", In vivo 변형 및 활성화를 사용한 변형된 Ex vivo Work Loop 실험

1.6K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/65610

⸱

2023년 8월 18일

 , 
1Northern Arizona University

이 논문에서

요약

이 기사는 실험실 설치류의 "아바타" 근육을 사용하여 근력 반응에 대한 긴장 과도 및 활성화의 기여도를 평가하기 위해 생체 외 작업 루프 실험 중 생체 내 근육 힘 생성을 에뮬레이트하는 방법론에 대해 자세히 설명합니다.

초록

움직임 행동은 근력 생성과 작업 출력에서 비롯되는 동적 시스템의 창발적 기능입니다. 신경 시스템과 기계 시스템 간의 상호 작용은 달리는 동안 다리 근육 특성을 조정하는 것부터 지면과 상호 작용하는 팔다리의 역학에 이르기까지 생물학적 조직의 모든 수준에서 동시에 발생합니다. 동물이 신경 제어 전략을 제어 계층에서 내재적 근육 역학('전굴곡')으로 전환하는 조건을 이해하면 근육 모델이 생체 내 근육 힘을 예측하고 보다 정확하게 작동할 수 있습니다. 생체 내 근육 역학을 이해하려면 생체 내 운동과 유사한 동적으로 변화하는 변형 및 하중 조건 하에서 근육 힘과 작업에 대한 생체 외 조사가 필요합니다. 생체 내 변형 궤적은 일반적으로 신경 활성화, 근골격계 운동학 및 환경에 의해 가해지는 하중 간의 상호 작용으로 인해 발생하는 급격한 변화(즉, 변형 및 속도 과도 현상)를 나타냅니다. 우리의 "아바타" 기술의 주요 목표는 근육 힘 생성에 대한 고유한 기계적 특성의 기여도가 가장 높을 수 있는 변형률 및 하중의 급격한 변화 동안 근육이 어떻게 기능하는지 조사하는 것입니다. "아바타" 기법에서 전통적인 워크 루프 접근 방식은 동적 움직임 중에 측정된 생체 내 변형 궤적과 동물의 근전도(EMG) 신호를 사용하여 수정되어 여러 번의 스트레칭 단축 주기를 통해 생체 외 근육을 구동합니다. 이 접근 방식은 생체 내 변형 궤적이 적절하게 조정되고 서보 모터에 연결된 생체 외 마우스 근육에 적용된다는 점을 제외하고는 작업 루프 기술과 유사합니다. 이 기술을 통해 (1) 생체 내 변형, 활성화, 보폭 빈도 및 작업 루프 패턴을 에뮬레이트합니다. (2) 생체 내 힘 반응과 가장 정확하게 일치하도록 이러한 패턴을 변경합니다. (3) 기계론적 가설을 테스트하기 위해 통제된 조합에서 변형 및/또는 활성화의 특정 기능을 변경합니다.

서론

움직이는 동물은 복잡한 환경에서 지구력, 속도, 민첩성이라는 인상적인 운동 능력을 발휘합니다. 동물의 운동은 인간이 공학적으로 만든 기계와 대조적으로 특히 인상적인데, 현재 다리를 가진 로봇, 의족 및 외골격의 안정성과 민첩성은 동물에 비해 열악합니다. 자연 지형에서 다리 모양의 이동은 예상치 못한 섭동으로 작용하는 속도와 기동 환경 기능을 변경하기 위해 정확한 제어와 신속한 조정이 필요합니다1,2,3,4. 그러나 비정상 이동을 이해하는 것은 역학이 물리적 환경, 근골격계 역학 및 감각 운동 제어 간의 복잡한 상호 작용에 의존하기 때문에 본질적으로 어렵습니다1,2. 다리 운동은 감각 정보의 신속한 다중 모드 처리와 팔다리 및 관절의 조정된 작동으로 예기치 않은 섭동에 대응해야 합니다1,5. 궁극적으로, 움직임은 근골격계의 고유한 기계적 특성과 신경 제어1,5,6,7. 신경 역학의 두드러진 질문은 이러한 요인들이 어떻게 상호 작용하여 예상치 못한 섭동에 반응하여 조정된 움직임을 생성하는가 하는 것입니다. 다음 기술은 "아바타" 근육을 사용하여 제어 가능한 생체 외 실험 중에 생체 내 변형 궤적을 사용하여 변형에 대한 근육의 고유한 기계적 반응을 활용합니다.

근육 운동 루프 기법은 주기적인 움직임 중 고유한 근육 역학을 이해하는 데 중요한 틀을 제공했습니다8,9,10. 전통적인 워크 루프 기법은 생체 내 실험 중에 측정된 주파수와 활성화 패턴을 사용하여 사전 정의된 일반적으로 사인파 변형 궤적을 통해 근육을 구동합니다2,8,9,11. 정현파 길이 궤적을 사용하면 동물이 환경 및 근골격계 운동학과의 상호 작용으로 인해 변형 궤적의 급격한 변화를 겪지 않는 조건에서 flight12 및 swimming2 동안 작업 및 전력 출력을 현실적으로 추정할 수 있습니다. 그러나 다리 운동 중 생체 내 근육 변형 궤적은 신경 활성화, 근골격계 운동학 및 환경에 의해 가해지는 하중 간의 상호 작용에서 동적으로 발생합니다5,7,13,14. 생체 내 근육-힘줄 역학에 해당하는 하중, 변형 궤적 및 힘 생성을 에뮬레이트하고 고유한 근육 역학과 신경 제어가 어떻게 상호 작용하여 섭동에 직면하여 조정된 움직임을 생성하는지에 대한 통찰력을 제공하는 보다 현실적인 작업 루프 기술이 필요합니다.

여기에서는 시간에 따라 변하는 생체 내 하중을 나타내는 생체 내 변형 궤적을 사용하여 통제된 생체 외 실험 중에 실험실 설치류의 "아바타" 근육을 사용하여 트레드밀 운동 중에 생체 내 근육 힘을 에뮬레이트하는 새로운 방법을 제시합니다. 통제된 생체 외 실험 중에 실험실 동물의 근육에 대한 표적 근육에서 측정된 생체 내 변형 궤적을 사용하면 운동 중에 경험하는 하중을 에뮬레이트할 수 있습니다. 여기에 설명된 실험에서, 생체 외 마우스 신근 digitorum longus(EDL) 근육은 러닝머신에서 걷고, 걷고, 걷고, 질주하는 동안 생체 외 쥐 내측 비복근(MG) 근육의 "아바타"로 사용됩니다13. 이 접근 방식은 생체 내 변형 궤적이 적절하게 조정되고 서보 모터에 연결된 생체 외 마우스 근육에 적용된다는 점을 제외하고는 작업 루프 기술과 유사합니다. 생쥐 EDL 근육은 쥐 MG에 비해 크기, 섬유 유형 및 구조가 다르지만 이러한 차이를 제어할 수 있습니다. "아바타" 기술을 통해 (1) 생체 내 변형, 활성화, 보폭 빈도 및 작업 루프 패턴을 에뮬레이트합니다. (2) 생체 내 힘 반응과 가장 정확하게 일치하도록 이러한 패턴을 변경합니다. (3) 기계론적 가설을 테스트하기 위해 통제된 조합에서 변형 및/또는 활성화의 특정 기능을 변경합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

모든 동물 실험은 Northern Arizona University의 기관동물관리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다. 야생형 수컷 및 암컷 생쥐(B6C3Fe a/a-Ttn 계통)의 장지신근(Extensor digitorum longus, EDL)을 이용하였습니다.mdm본 연구에서는 60~280일령의 /J)를 사용하였습니다. 동물은 상업적 공급처로부터 구입하였습니다(참조 재료 목록), 그리고 노던 애리조나 대학교(Northern Arizona University)에서 콜로니를 형성하였다.

1. in vivo 균주 궤적 선택 및 ex vivo 작업 루프 실험 중 사용을 위한 준비

참고: 본 프로토콜에서는 저자(UMass Lowell의 Nicolai Konow, 개인적 교신)에게 직접 제공된 in vivo 동적 이동의 사전 측정값을 ex vivo 실험에 사용하였습니다. 원본 데이터는 Wakeling 등15의 연구를 위해 수집되었습니다. 본 프로토콜을 재현하려면 시간, 길이 또는 변형률, EMG/활성화 및 힘 데이터가 필요합니다.

  1. 전체를 분할하십시오. 생체 내(in vivo) 임의의 프로그래밍 플랫폼을 사용하여 개별 보폭으로 시행을 분할(MATLab 코드 제공) 보충 코딩 파일 1).
    1. 길이 변화를 그래프로 나타내십시오. 대(vs)전체 소요 시간 in vivo 시행. 이는 개별 보행(입각기에서 입각기까지)을 시각화하고 보행 간 변동성을 평가하는 데 사용됩니다.그림 1).
    2. 전체 실험에 대한 변형률을 계산한다 (길이 (L) / 최적 길이 L에서의 최대 등척성 힘)0).
    3. 전체 실험 과정에서 모든 보폭을 대표하며, 시작과 끝의 길이가 유사한 보폭을 하나 선택하십시오. 각 보폭을 비교하기 위해 길이를 서로 겹쳐서 그래프로 그려 시각적으로 확인할 수 있습니다.
    4. 대표 보폭(stride)을 선택한 후, 모든 프로그래밍 플랫폼을 사용하여 전체 시험에서 변형률(strain), EMG/활성도 및 힘 데이터를 분할하십시오(참조 보충 코딩 파일 1 MATLAB에서 사용되는 코드를 위해16).
    5. 변형률, EMG/활성화 또는 힘의 샘플링 주파수가 서로 다른 경우, 모든 데이터가 동일한 주파수로 샘플링되도록 데이터 지점을 보간하십시오.
      참고: 연구자는 전체 실험에서 샘플링된 각 지점 사이의 시간 간격을 바탕으로 캡처 빈도를 결정할 수 있습니다. 변수들이 동일한 빈도로 캡처되는 경우, 샘플링 시간은 동일합니다.
  2. 분절 보폭의 빈도를 계산하십시오.
    1. 분절된 보폭의 지속 시간(초)을 측정하고, 1(초)을 해당 지속 시간으로 나누어 빈도를 계산합니다(1/지속 시간 = 초당 보폭 수).
    2. 수동으로 얼마만큼의 데이터 포인트가 수집되어야 하는지 결정하십시오. 체외(ex vivo) 주파수를 맞추기 위한 실험.
    3. 두 보폭에 소요되는 시간을 계산하십시오. 이후 통계 분석에 필요하므로, 근육 측정 오차 범위 내에서 추정할 수 있도록 보폭 측정을 최소 한 번 더 반복하십시오.
  3. 측정된 EMG 활성도를 사용하여 변형 입력에 대한 자극 위상을 결정함으로써, 다음의 자극 시작 시점과 지속 시간을 결정합니다. ex vivo 작업 루프. 모든 프로그래밍 플랫폼을 사용할 수 있습니다(참조 보충 코딩 파일 1 (본 연구에 사용된 코드의 경우).
    1. 변형률 변화와 동일한 x축 범위(시간)에서 EMG 신호를 확인하십시오.그림 1). EMG 신호가 보일 수 있도록 확대하십시오. 이는 EMG 신호에 임의의 수를 곱하거나, 변형률(strain)과 EMG 신호를 동일한 척도로 재조정하거나, 변형률에 EMG 신호를 더함으로써 수행할 수 있습니다.
      참고: 저자들은 MATLab의 "rescale" 함수를 사용하여 변형률(strain)과 근전도(EMG)가 동일한 척도에 있도록 크기를 조정하였습니다(참조 부록 그림 1).
    2. 두 표준편차의 강도 변화로 나타나는 EMG 활성의 시작 및 종료 지점을 찾으십시오.17,18.
      참고: 동물과 근육에 따라 EMG 개시 시점이 발 접촉 시점과 일치할 수도 있고 일치하지 않을 수도 있습니다(Monica Daley, UC Irvine, 개인 서신)(고찰 섹션 참조).
    3. EMG 활성화 개시가 발생하는 변형 주기(strain cycle)의 백분율(예: 40%)과 자극이 지속될 시간(예: 222 ms)을 계산하십시오.
      참고: 연구자는 다음 사이에서 서로 다르게 나타나는 흥분-수축 결합(ECC) 지연 시간을 고려해야 합니다. 생체 내(in vivo) 움직임 및 ex vivo 작업 루프는 동물 및 근육마다 다를 수 있으며 (예: 생체 내(in vivo) 쥐의 신경근 접합부(MG)에 대한 ECC는 24.5 ms입니다. ex vivo ECC는 생쥐의 외측비복근(EDL)의 경우 약 5ms입니다.
  4. 워크 루프 컨트롤러 프로그램을 위한 대표 변형률 입력값을 준비하십시오. 변형률 및 자극 입력을 통해 힘 출력을 캡처할 수 있는 프로그램이라면 무엇이든 워크 루프 컨트롤러 프로그램으로 사용할 수 있습니다(고찰 섹션 참조).
    1. 선택한 보폭(stride)을 가져와 단계가 포착되는 데 필요한 적절한 지점 수로 보간하십시오. 생체 내(in vivo) 두 사이클 동안의 빈도(단계 1.2 참조).
    2. 보폭을 "제로 변형(zero strain)"(예: L)에서 시작하고 끝나도록 다시 조정하십시오.0 또는 95% L0) 미리 결정된 길이 변위만큼 신장시킨 후(단계 3.3 참조).
    3. 필요한 경우, 생쥐 EDL의 변형 변화 입력값으로 사용하기 위해 선택한 보폭(stride)을 "스케일링(scale)"하십시오(고찰 섹션 참조). 스케일링하려면 생쥐 EDL이 손상 없이 신장될 수 있는 길이 편차(length excursion)를 선택하십시오(예: 일반적으로 생쥐 EDL을 $L_0$의 10%만큼 신장시킵니다).0 ~에 관계없이 생체 내(in vivo) 종). 이는 예비 결과에 따라 변경해야 할 수도 있습니다(단계 3.3 참조).

심근 수축 데이터; 주기적 운동 패턴을 보여주는 길이 대 시간 그래프.
그림 1: in vivo 전체 실험의 시간에 따른 길이 변화. 쥐 MG의 시간 대비 길이(mm)를 도식화함. 최단 길이에서 최단 길이까지 원으로 표시된 부분이 한 번의 보폭(stride)으로 간주됨. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2. 마우스 근육의 최대 등척성 힘 ex vivo 평가

  1. 장비 설정 및 수술 준비.
    참고: ex vivo 워크 루프(work loop)에 필요한 장비에 대한 설명은 고찰(Discussion) 섹션을 참조하십시오.
    1. 옥시튜브(oxytube) 니들 밸브를 워터 재킷 조직 욕조(water-jacket tissue bath)에 삽입하여 조직 욕조를 준비하십시오(재료 표 참조). 옥시튜브를 95% O2-5% CO2 가스 실린더에 연결하십시오. 20 psi의 압력을 가해 워터 재킷 조직 욕조를 채우십시오.
    2. 수술 구역 근처에 Krebs-Henseleit 용액(단계 2.1.3)이 담긴 결정화 접시(crystallizing dish)로 가스 라인에서 추가 옥시튜브를 연결하여 수술 구역을 준비하십시오. 이는 수술 중 및 수술 후에 근육의 공기 공급과 수분을 유지하는 데 사용됩니다.
      참고: 한 번에 여러 개의 근육을 적출하는 경우, 근육을 이 포기 용액에 최대 4시간까지 보관할 수 있습니다.
    3. 실온에서 다음 성분을 포함하는 1 L의 Krebs-Henseleit 용액을 준비하고, HCl과 NaOH를 사용하여 pH를 7.4로 맞추십시오(mmol l-1 기준): NaCl (118); KCl (4.75); MgSO4 (1.18); KH2PO4 (1.18); CaCl2 (2.54); 그리고 glucose (10.0)(재료 표 참조). HCl과 NaOH를 다룰 때는 고글과 장갑 등 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 착용하십시오.
    4. 실온 및 pH 7.4의 Krebs-Henseleit 용액으로 욕조를 채우십시오. 근육과 훅(hook)을 용액에 완전히 잠기게 하십시오.
    5. 듀얼 모드 근육 레버 시스템, 자극기 및 신호 인터페이스(DAQ 보드) 등 모든 장비의 전원을 켜십시오(재료 표 참조).
  2. EDL 근육 적출.
    1. 마우스를 깊게 마취한 후 경추 탈골로 안락사시킵니다. 마우스의 윗쪽 뒷다리를 뻗게 하고 발가락이 적출 보드에 닿도록 오른쪽 또는 왼쪽으로 측와위를 취하게 합니다. 발목부터 무릎 관절 윗부분까지 털을 제거합니다.
    2. 포셉으로 피부를 들어 올리고 발목 관절에서 엉덩이 부위까지 절개합니다. 근육이 노출되면 바지 "단"을 처리하듯 발목 주변을 절개합니다. 피부를 들어 올려 다리 근육이 더 명확하게 보이도록 합니다.
    3. 전경골근(TA)과 비복근을 구분하는 근막선을 찾아 적출 가위로 분리하여 무릎 힘줄을 노출시킵니다. 노출된 두 무릎 힘줄 사이에 적출 가위를 놓습니다. 가위가 노출된 무릎 힘줄 바로 아래의 포켓(pocket)에 걸리게 됩니다. 가위를 다리에서 멀리 당기면서 발목에 도달할 때까지 "포켓"을 둔탁하게 박리하여 EDL을 노출시킵니다.
    4. 4-0 실크 외과용 봉합사(재료 표 참조)로 미리 묶은 루프 매듭을 사용하여, 무릎에 가장 가까운 힘줄 아래로 봉합사의 한쪽 끝을 엮습니다. 근육에 닿지 않게 하고 힘줄을 포함하지 않은 상태로 근위부 근육-힘줄 접합부 위에 이중 정방형 매듭(double square knot)을 묶습니다. 매듭 윗부분을 자릅니다. 힘줄에 묶인 루프를 조심스럽게 당기면 EDL이 "포켓"에서 나옵니다.
    5. 루프를 적출 구역에 테이프로 고정하여 EDL에 장력을 줍니다. 원위부 근육-힘줄 접합부에 다른 미리 묶은 루프 매듭을 사용하여, 근육에 닿지 않게 하고 힘줄을 포함하지 않은 상태로 이중 정방형 매듭을 묶습니다. 다리 쪽에 가까운 매듭을 잘라 마우스에서 EDL 전체를 제거합니다. 근육의 근위부 및 원위부 이중 정방형 매듭 외의 여분 봉합사를 잘라내고, 수술 구역의 포기 욕조에 근육을 넣으십시오.
      참고: 근육을 포기 욕조에 넣을 때는 어느 쪽이 근위부이고 원위부인지 반드시 표시하십시오.
    6. 서보모터 레버 장치에 배치하려면, 매달린 백금 전극 사이에 EDL을 수직으로 부착하십시오. 원위부 루프 매듭을 고정 훅에 부착하고, 근위부 루프 매듭을 서보모터 암에 부착된 훅에 연결하십시오. 조직 욕조를 올려 근육을 포기 Krebs-Henseleit 용액에 잠기게 하십시오.
      참고: 근육이 잠겨 있을 때 공기 공급으로 인해 근육이 흔들리지 않아야 합니다. 흔들림이 발생하면 가스 압력을 낮추십시오. 자극을 시작하기 전 10분 동안 근육을 평형 상태로 유지하십시오.
  3. EDL 근육의 최대 등척성 힘 측정.
    참고: 단발성 자극(twitch)과 강직(tetanus)을 사용하여 최대 등척성 힘을 측정하는 프로토콜은 표 1을 참조하십시오. 저자들이 사용한 프로그램의 예시는 부록 그림 1을 참조하십시오.
    1. 수술 중 근육이 손상되지 않았는지 확인하기 위해 최대 초과 자극 단발성 자극(supramaximal twitch)을 가합니다(80 V, 1 pps, 1ms; 표 1; 부록 그림 2 참조). 손상이 없다면, 근육 레버 시스템의 길이 조절 노브를 사용하여 단발성 자극 시 능동 장력은 ~1V / 0.1271 N이고 수동 장력은 ~0.1V / 0.01271 N 미만이 되는 근육 길이를 찾습니다.
    2. 봉합 매듭에서 봉합 매듭까지의 근육 시작 길이를 V(볼트)와 mm(밀리미터) 단위로 기록합니다. 측정값을 프로그램의 시작 길이 보정 부분에 입력하십시오(부록 그림 1 참조).
    3. EDL의 최적 길이(L0)에서 최대 초과 자극 단발성 최대 등척성 힘을 찾습니다(표 1). 기술적으로 휴식 시간이 필요하지는 않으나, 자극 사이에 1분 동안 대기하면 수동 장력이 안정됩니다. 최대 초과 자극 단발성 힘이 최대가 되는 길이(V 단위)를 기록합니다. 이것이 단발성 자극에 대한 근육의 최적 길이(L0)입니다.
    4. 이 길이에서 캘리퍼스로 근육을 측정합니다. 봉합 매듭에서 봉합 매듭까지 근육 길이를 측정합니다. L0을 찾은 후, 근육을 다시 시작 길이(능동 장력 ~1V / 0.1271 N)로 줄입니다.
    5. EDL의 최대 초과 강직 최대 등척성 힘을 찾습니다(80 V, 180 pps, 500 ms; 표 1). L0에서 최대 초과 강직력의 길이(V 및 mm 단위)를 기록하고, 다시 캘리퍼스로 봉합 매듭 사이의 섬유 길이를 측정합니다.
      참고: 근육 길이를 0.5 V/0.65 mm 단계로 증가시키면 단발성 자극과 강직 모두에서 더 정확한 L0을 얻을 수 있습니다.
    6. 실험 전후로 L0에서 EDL의 최대 하위 등척성 힘(submaximal isometric force, 45 V, 110 pps, 500ms; 표 1)을 측정하여 자극 프로토콜로 인한 피로가 발생하지 않았는지 확인합니다. 힘이 10% 감소하면 "피로한" 근육으로 간주합니다.
실험시뮬레이션 강도 (V)펄스 주파수 (pps / Hz)자극 지속 시간 (ms)의견
1. "준비 운동"8011길이를 0.50 V만큼 증가 또는 감소시켜 1 V의 수동 장력을 찾습니다.
2. 최적 근육 길이 수축 (L0)8011길이를 0.50 V씩 증가 또는 감소시켜 약 1 V의 수동 장력을 찾으십시오.
3. 최적 근육 길이 강직 (L0)80180500길이를 0.50 V씩 변경할 때마다 3분 동안 휴지시킨다.
4. 실험 전 최대하 L045110500L0의 길이에서
6. 아바타 실험45110마우스 EDL의 대표적인 길이 변화를 주기적으로 적용하십시오.
7. 실험 후 하위최대 L045110500실험 후 L0로 복귀하여 L0를 측정하십시오.

표 1: 자극 프로토콜. 초최대 및 하최대 수축(twitch) 및 강직(tetanus) 최적 길이를 찾기 위한 자극 프로토콜. 프로토콜은 자극 강도, 타이밍 및 초당 펄스 수에 따라 다릅니다.

3. 선택된 in vivo 균주 궤적을 이용한 "아바타" 작업 루프 기법 완성

  1. "아바타" 작업 루프 기법을 완료하는 데 필요한 소프트웨어를 설정하십시오 (참조 재료 목록).
    참고: 각 시간 단계별 근육 길이를 지정하는 입력 파일(.csv 또는 이와 유사한 파일)이 필요합니다(단계 1.4 참조). 자극이 시작되는 주기 백분율과 자극 지속 시간에 대한 입력값이 필요합니다(참조 부록 그림 3 예를 들어).
  2. 완전한 "아바타" 작업 루프 기법.
    참고: 본 실험에서는 맞춤형 LabView 프로그램을 사용하였으나, 연구자는 서보모터 레버를 이용한 마우스 EDL(외측비복근)의 길이 변화 제어, 지정된 시간의 자극 개시 시점(% 주기) 및 지속 시간(ms) 제어, 그리고 근육 힘 측정이 가능한 모든 프로그램을 사용할 수 있습니다. 다음을 참조하십시오. 부수 그림 3 프로그램 저자들이 사용하는 삽화의 예시입니다.
    1. 단계 1.4의 프로그램에 스케일링된 길이 편차(scaled length excursion)와 함께 스케일링된 변형률 변화(scaled strain changes)를 업로드하십시오. "스케일링된 변형률 변화"에 대한 자세한 내용은 단계 1.4, 3.3 및 고찰(Discussion) 섹션을 참조하십시오.
    2. 필요한 경우 근육의 초기 길이를 조정하십시오(섹션 3.3 참조). 결과 보정을 위해 초기 길이를 V 및 mm 단위로 입력하십시오(참조 부록 그림 3).
    3. 단계 1.3에서 계산한 자극 시작 시점과 지속 시간을 사용하십시오.
    4. 결정된 길이 변위로 설정된 길이 변화 범위에 따라 근육을 2주기 동안 구동하십시오.
    5. 데이터를 저장하십시오. 동일한 근육에서 여러 가지 자극 프로토콜을 수집하는 경우, 각 자극 사이에 3분간 대기하십시오.
    6. 최적 길이(L0)에서 자극하십시오.0) 아최대 활성화를 사용하여 피로 발생 여부를 결정합니다. 힘이 10% 이상 감소하면 근육이 피로해진 것으로 간주합니다. 다음을 참조하십시오. 표 1 자극 프로토콜을 위한.
    7. 근육을 수조에서 꺼냅니다. 근육에서 루프 매듭을 잘라내고 근육에 묻은 과잉 용액을 닦아냅니다. 근육의 무게를 잽니다. 표준 공식인 근육 질량/(L_0 * 밀도)를 사용하여 생리학적 단면적을 결정합니다.0*1.06)19.
  3. "아바타" 워크 루프 기법을 위한 파라미터를 조정하십시오(토론 섹션 참조).
    1. 다음과 일치시켜 초기 길이와 길이 변화량을 결정합니다. ex vivo 관찰된 수동 장력 증가량에 대비한 수동 장력 증가량 생체 내(in vivo) (그림 2).
      참고: 본 연구에서는 % L을 사용하였습니다.0 시작 길이(mm) 및 편위(% L) 스케일 조정0; 단계 1.4 및 고찰 섹션을 참조하십시오). 다음과 같은 장력 상승을 맞추기 위해 ex vivo 마우스 외측비복근(EDL)을 ~의 것과 생체 내(in vivo) 쥐의 내측비복근(MG)에서, 저자들은 L0에서의 시작 길이가0 최적의 적합도를 나타냈으며 (그림 2).
    2. 세 가지의 시작 길이(예: -5% L)를 선택하십시오.0, L0, 및 +5% L0). 이러한 각 시작 길이에서 지정된 길이 편차(예: L₀의 10%)를 적용하여 "아바타" 작업 루프를 수행하십시오.0).
      참고: 마우스 EDL을 사용한 현재의 "아바타" 실험에서, 10% L₀의 길이 변화(length excursion)를 적용하였다.0 사용되었습니다.
    3. 새로운 시작 길이 및/또는 편위(excursion)로 다음의 비율이 나타날 때까지 반복하십시오. ex vivo 수동적 장력의 상승은 ~의 속도와 유사합니다. 생체 내(in vivo) 수동적 장력 증가 (참조 그림 2B).
    4. 사용되는 근육의 섬유 유형 및 활성화 역동성에 따라 자극 시간을 늘리거나 줄여서 다음 간의 일치를 최적화하십시오. ex vivo 및 생체 내(in vivo) 힘. 따라서 최적의 일치를 위해 자극의 시작 시점 및/또는 지속 시간을 변경하는 것이 필요할 수 있습니다. 생체 내(in vivo) "아바타" 실험 중의 힘 생성.
    5. 이것이 필요한지 결정하기 위해("Discussion" 섹션 참조), "아바타"의 시간에 따른 힘의 변화를 도표로 나타내고 생체 내(in vivo) 근육 (그림 3) 및 결정계수 $R^2$를 계산합니다.2 표적 근육력과 "아바타" 근육력 사이의 스케일링된 상관관계를 제곱함으로써 (대표 결과 참조).

정적 평형 그래프, ΣFx=0, 작업 루프 분석 표시; 스케일 조정된 응력-변형률 선도.
그림 2수동 장력 상승 일치. 다음을 보여주는 작업 루프 in vivo 그리고 ex vivo 수동적 장력의 증가(화살표). 생체 내(In vivo) 2.9 Hz로 보행하는 쥐의 MG(검은색)에서 얻은 크기가 조정된 작업 루프(Wakeling 등의 데이터)15). ex vivo 2.9 Hz에서 측정한 마우스 EDL(녹색)의 스케일 조정된 워크 루프(work loops). (A) 마우스 EDL 근육의 시작 길이는 +5% L입니다.0. (B) 마우스 EDL 근육의 시작 길이는 L이다0. ex vivo 수동 장력 상승이 ~와 일치함에 유의하십시오. 생체 내(in vivo) A에서는 장력이 상승하였으나 B에서는 그렇지 않았다. 굵은 선은 자극을 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

재료 시험 분석에서 동적 응답 곡선을 보여주는 응력 대 시간 그래프.
그림 3: 쥐의 MG in vivo 힘(검은색 선)에 맞추기 위한 생쥐 EDL의 자극 시간 최적화. EMG 기반 자극(녹색 점선)을 사용하여 생성된 생쥐 EDL의 힘은 쥐 MG에 비해 생쥐 EDL의 불활성화가 더 빠르게 일어나기 때문에 in vivo 힘보다 더 빨리 감소합니다. in vivo 힘과 ex vivo 힘 사이의 적합성을 최적화하기 위해 생쥐 EDL을 더 긴 시간 동안 자극했습니다(녹색 실선). EMG 기반 자극 R2 = 0.55, 최적화된 자극 R2 = 0.91. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

"아바타" 실험의 목적은 ex vivo 워크 루프(work loop) 실험 중에 in vivo에서의 힘 생성과 일 출력을 최대한 가깝게 재현하는 것입니다. 본 연구에서는 생쥐의 EDL과 쥐의 MG가 모두 주로 속근섬유로 구성되어 있기 때문에20,21, 생쥐 EDL을 쥐 MG의 "아바타"로 사용하기로 하였습니다. 두 근육 모두 발목 관절의 주동근이며(EDL은 발목 배굴근, MG는 발목 저굴근), 깃각(pennation angle)이 유사합니다(생쥐 EDL 12.4 + 2.12°22, 본 연구에 사용된 쥐 MG 20°15). 쥐 MG의 스케일 조정된 대표 워크 루프15를 두 가지 서로 다른 자극 프로토콜(하나는 측정된 EMG 활동 기반, 다른 하나는 단계 3.3과 같이 ...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

유기체는 풍경을 가로질러 원활하게 이동하지만 근육이 경험하는 근본적인 부하와 긴장은 크게 다릅니다1,6,23. 생체 내 이동 1,24 및 "아바타" 실험 모두에서 근육은 주기적이고 비정상적인 조건에서 최대값 이하로 자극됩니다. 등척성 힘-길이 및 등장성 힘-속도 관계는 이러한 조건에서 근력을 예측하는 데 적합하지 않습니다2. 비정상 변형률(즉, 과도 현상) 및 하중의 영향을 이해하는 것은 생체 내 이동 중 힘 생성을 예측하는 데 필수적이므로 이러한 "아바타" 실험을 개발하는 주요 근거입니다2. "아바타" 실험을 통해 힘 출력을 측정하면서 근육 ...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

모든 저자는 이해 상충이 없음을 인정합니다.

감사의 글

이 연구에 사용된 데이터를 제공해 주신 Nicolai Konow 박사님께 감사드립니다. NSF IOS-2016049 및 NSF DBI-2021832에서 자금을 지원합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
땋은 비흡수성 실크 봉합사 4-0 머실크 734H
칼슘 클로라이드 이수화물 (CaCl2)Sigma-Aldrich1086436Krebs-Henseleit  솔루션
덱스트로스 시그마-알드리치D9434크렙스-헨셀라이트  솔루션
HEPESSigma-AldrichPHR1428Krebs-Henseleit  용액
: hydorchloric acid (HCl) 시그마-알드리치1.37055크렙스-헨셀라이트 
솔루션 LabView 데이터 수집 Lab-View
마그네슘 황산염 (MgSO4)Sigma-AldrichM7506Krebs-Henseleit  용액
염화칼륨 (KCl) 시그마-알드리치P3911크렙스-헨셀라이트  용액
인산칼륨 일염기성 (KH2PO4)Sigma-Aldrich5.43841Krebs-Henseleit  솔루션
S88 스티뮬레이터잔디M643H05Ebay에서 구매 가능
시리즈 300B 레버 시스템Aurora1200A는워터재킷 티슈 욕조를 포함하고 있습니다
Sodium Bicarbonate (NaHCO3)Sigma-AldrichS5761Krebs-Henseleit  용액
염화나트륨 (NaCl) 시그마-알드리치S9888크렙스-헨셀라이트  용액
수산화나트륨 (NaOH)시그마-알드리치S5881크렙스-헨셀레이트  솔루션
: 야생형 마우스: 잭슨 연구소: B6C3Fe, a / a, Ttn : mdm / J
.

참고문헌

  1. Dickinson, M. H. How Animals move: an integrative view. Science. 288 (5463), 100-106 (2000).
  2. Sponberg, S., Abbott, E., Sawicki, G. S. Perturbing the muscle work loop paradigm to unravel the neuromechanics of unsteady locomotion. Journal of Experimental Biology. 226 (7), 243561(2023).
  3. Daley, M. A., Biewener, A. A. Running over rough terrain reveals limb control for intrinsic stability. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (42), 15681-15686 (2006).
  4. Daley, M. A., Usherwood, J. R., Felix, G., Biewener, A. A. Running over rough terrain: guinea fowl maintain dynamic stability despite a large unexpected change in substrate height. Journal of Experimental Biology. 209 (1), 171-187 (2006).
  5. Daley, M. A. Understanding the agility of running birds: Sensorimotor and mechanical factors in avian bipedal locomotion. Integrative and Comparative Biology. 58 (5), 884-893 (2018).
  6. Biewener, A. A. Animal locomotion. , Oxford University Press. Oxford New York. (2003).
  7. Robertson, B. D., Sawicki, G. S. Unconstrained muscle-tendon workloops indicate resonance tuning as a mechanism for elastic limb behavior during terrestrial locomotion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (43), E5891-E5898 (2015).
  8. Josephson, R. K. Mechanical power output from striated muscle during cyclic contraction. The Journal of Experimental Biology. 114, 493-512 (1985).
  9. Ahn, A. N. How muscles function - the work loop technique. Journal of Experimental Biology. 215 (7), 1051-1052 (2012).
  10. Sawicki, G. S., Robertson, B. D., Azizi, E., Roberts, T. J. Timing matters: tuning the mechanics of a muscle-tendon unit by adjusting stimulation phase during cyclic contractions. Journal of Experimental Biology. 218 (19), 3150-3159 (2015).
  11. Libby, T., Chukwueke, C., Sponberg, S. History-dependent perturbation response in limb muscle. Journal of Experimental Biology. 223 (1), (2020).
  12. Askew, G. N., Marsh, R. L., Ellington, C. P. The mechanical power output of the flight muscles of blue-breasted quail ( Coturnix chinensis ) during take-off. Journal of Experimental Biology. 204 (21), 3601-3619 (2001).
  13. Sponberg, S., Libby, T., Mullens, C. H., Full, R. J. Shifts in a single muscle's control potential of body dynamics are determined by mechanical feedback. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 366 (1570), 1606-1620 (2011).
  14. Loeb, G. E., Brown, I. E., Cheng, E. J. A hierarchical foundation for models of sensorimotor control. Experimental Brain Research. 126 (1), 1-18 (1999).
  15. Wakeling, J. M., Tijs, C., Konow, N., Biewener, A. A. Modeling muscle function using experimentally determined subject-specific muscle properties. Journal of Biomechanics. 117, 110242(2021).
  16. The Mathworks. MATLAB:R2021a. The Mathworks. , (2021).
  17. Tenan, M. S., Tweedell, A. J., Haynes, C. A. Analysis of statistical and standard algorithms for detecting muscle onset with surface electromyography. PLOS ONE. 12 (5), 0177312(2017).
  18. Roberts, T. J., Gabaldón, A. M. Interpreting muscle function from EMG: lessons learned from direct measurements of muscle force. Integrative and Comparative Biology. 48 (2), 312-320 (2008).
  19. Rice, N., Bemis, C. M., Daley, M. A., Nishikawa, K. Understanding muscle function during perturbed in vivo locomotion using a muscle avatar approach. Journal of Experimental Biology. 226 (13), 244721(2023).
  20. Silva Cornachione, A., CaçãoOliveiraBenedini-Elias, P., Cristina Polizello , P., César Carvalho, L., CláudiaMattiello-Sverzut, A. Characterization of Fiber types in different muscles of the hindlimb in female weanling and adult wistar rats. Acta Histochemica Et Cytochemica. 44 (2), 43-50 (2011).
  21. Hämäläinen, N., Pette, D. The histochemical profiles of fast fiber types IIB, IID, and IIA in skeletal muscles of mouse, rat, and rabbit. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 41 (5), 733-743 (1993).
  22. Charles, J. P., Cappellari, O., Spence, A. J., Hutchinson, J. R., Wells, D. J. Musculoskeletal geometry, muscle architecture and functional specialisations of the mouse hindlimb. PLOS ONE. 11 (4), 0147669(2016).
  23. Nishikawa, K. Titin: A Tunable spring in active muscle. Physiology (Bethesda, Md). 35 (3), 209-217 (2020).
  24. Dick, T. J. M., Biewener, A. A., Wakeling, J. M. Comparison of human gastrocnemius forces predicted by Hill-type muscle models and estimated from ultrasound images). The Journal of Experimental Biology. 220, 1643-1653 (2017).
  25. Daley, M. A., Biewener, A. A. Leg muscles that mediate stability: mechanics and control of two distal extensor muscles during obstacle negotiation in the guinea fowl. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 366 (1570), 1580-1591 (2011).
  26. Seth, A., Sherman, M., Reinbolt, J. A., Delp, S. L. OpenSim: a musculoskeletal modeling and simulation framework for in silico investigations and exchange. Procedia IUTAM. 2, 212-232 (2011).
  27. Sandercock, T. G., Heckman, C. J. Doublet potentiation during eccentric and concentric contractions of cat soleus muscle. Journal of Applied Physiology. 82 (4), Bethesda, Md. 1219-1228 (1997).
  28. Marsh, R. L. How muscles deal with real-world loads: the influence of length trajectory on muscle performance. The Journal of Experimental Biology. 202, 3377-3385 (1999).
  29. Hessel, A. L., Monroy, J. A., Nishikawa, K. C. Non-cross bridge viscoelastic elements contribute to muscle force and work during stretch-shortening cycles: evidence from whole muscles and permeabilized fibers. Frontiers in Physiology. 12, 648019(2021).
  30. Lindstedt, S., Nishikawa, K. Huxleys' missing filament: form and function of titin in vertebrate striated muscle. Annual Review of Physiology. 79, 145-166 (2017).
  31. Abbate, F., De Ruiter, C. J., Offringa, C., Sargeant, A. J., De Haan, A. In situ rat fast skeletal muscle is more efficient at submaximal than at maximal activation levels. Journal of Applied Physiology. 92 (5), 2089-2096 (2002).
  32. Eng, C. M., Smallwood, L. H., Rainiero, M. P., Lahey, M., Ward, S. R., Lieber, R. L. Scaling of muscle architecture and fiber types in the rat hindlimb. Journal of Experimental Biology. 211 (14), 2336-2345 (2008).
  33. Manuel, M., Chardon, M., Tysseling, V., Heckman, C. J. Scaling of motor output, from mouse to humans. Physiology (Bethesda, Md). 34 (1), 5-13 (2019).
  34. Zajac, F. E. Muscle and tendon: properties, models, scaling, and application to biomechanics and motor control. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 17 (4), 359-411 (1989).
  35. Rice, N. Understanding muscle function during in vivo locomotion using a novel muscle avatar approach. ProQuest Dissertations and Theses. , https://libproxy.nau.edu/login?url=https://www.proquest.com/dissertationstheses/understanding-muscle-function-during-em-vivo/docview/2444890224/se-2?accountid=12706 (2020).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

태그

"Avatar", In vivo 변형 및 활성화를 사용한 변형된 Ex vivo Work Loop 실험
문의하기
사서에게 추천하기

개인정보

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.