"Avatar", In vivo 변형 및 활성화를 사용한 변형된 Ex vivo Work Loop 실험

Summary

이 기사는 실험실 설치류의 "아바타" 근육을 사용하여 근력 반응에 대한 긴장 과도 및 활성화의 기여도를 평가하기 위해 생체 외 작업 루프 실험 중 생체 내 근육 힘 생성을 에뮬레이트하는 방법론에 대해 자세히 설명합니다.

Abstract

움직임 행동은 근력 생성과 작업 출력에서 비롯되는 동적 시스템의 창발적 기능입니다. 신경 시스템과 기계 시스템 간의 상호 작용은 달리는 동안 다리 근육 특성을 조정하는 것부터 지면과 상호 작용하는 팔다리의 역학에 이르기까지 생물학적 조직의 모든 수준에서 동시에 발생합니다. 동물이 신경 제어 전략을 제어 계층에서 내재적 근육 역학('전굴곡')으로 전환하는 조건을 이해하면 근육 모델이 생체 내 근육 힘을 예측하고 보다 정확하게 작동할 수 있습니다. 생체 내 근육 역학을 이해하려면 생체 내 운동과 유사한 동적으로 변화하는 변형 및 하중 조건 하에서 근육 힘과 작업에 대한 생체 외 조사가 필요합니다. 생체 내 변형 궤적은 일반적으로 신경 활성화, 근골격계 운동학 및 환경에 의해 가해지는 하중 간의 상호 작용으로 인해 발생하는 급격한 변화(즉, 변형 및 속도 과도 현상)를 나타냅니다. 우리의 "아바타" 기술의 주요 목표는 근육 힘 생성에 대한 고유한 기계적 특성의 기여도가 가장 높을 수 있는 변형률 및 하중의 급격한 변화 동안 근육이 어떻게 기능하는지 조사하는 것입니다. "아바타" 기법에서 전통적인 워크 루프 접근 방식은 동적 움직임 중에 측정된 생체 내 변형 궤적과 동물의 근전도(EMG) 신호를 사용하여 수정되어 여러 번의 스트레칭 단축 주기를 통해 생체 외 근육을 구동합니다. 이 접근 방식은 생체 내 변형 궤적이 적절하게 조정되고 서보 모터에 연결된 생체 외 마우스 근육에 적용된다는 점을 제외하고는 작업 루프 기술과 유사합니다. 이 기술을 통해 (1) 생체 내 변형, 활성화, 보폭 빈도 및 작업 루프 패턴을 에뮬레이트합니다. (2) 생체 내 힘 반응과 가장 정확하게 일치하도록 이러한 패턴을 변경합니다. (3) 기계론적 가설을 테스트하기 위해 통제된 조합에서 변형 및/또는 활성화의 특정 기능을 변경합니다.

Introduction

움직이는 동물은 복잡한 환경에서 지구력, 속도, 민첩성이라는 인상적인 운동 능력을 발휘합니다. 동물의 운동은 인간이 공학적으로 만든 기계와 대조적으로 특히 인상적인데, 현재 다리를 가진 로봇, 의족 및 외골격의 안정성과 민첩성은 동물에 비해 열악합니다. 자연 지형에서 다리 모양의 이동은 예상치 못한 섭동으로 작용하는 속도와 기동 환경 기능을 변경하기 위해 정확한 제어와 신속한 조정이 필요합니다^1,2,3,4. 그러나 비정상 이동을 이해하는 것은 역학이 물리적 환경, 근골격계 역학 및 감각 운동 제어 간의 복잡한 상호 작용에 의존하기 때문에 본질적으로 어렵습니다^1,2. 다리 운동은 감각 정보의 신속한 다중 모드 처리와 팔다리 및 관절의 조정된 작동으로 예기치 않은 섭동에 대응해야 합니다^1,5. 궁극적으로, 움직임은 근골격계의 고유한 기계적 특성과 신경 제어^1,5,6,7. 신경 역학의 두드러진 질문은 이러한 요인들이 어떻게 상호 작용하여 예상치 못한 섭동에 반응하여 조정된 움직임을 생성하는가 하는 것입니다. 다음 기술은 "아바타" 근육을 사용하여 제어 가능한 생체 외 실험 중에 생체 내 변형 궤적을 사용하여 변형에 대한 근육의 고유한 기계적 반응을 활용합니다.

근육 운동 루프 기법은 주기적인 움직임 중 고유한 근육 역학을 이해하는 데 중요한 틀을 제공했습니다^8,9,10. 전통적인 워크 루프 기법은 생체 내 실험 중에 측정된 주파수와 활성화 패턴을 사용하여 사전 정의된 일반적으로 사인파 변형 궤적을 통해 근육을 구동합니다^2,8,9,11. 정현파 길이 궤적을 사용하면 동물이 환경 및 근골격계 운동학과의 상호 작용으로 인해 변형 궤적의 급격한 변화를 겪지 않는 조건에서 flight^{12 및 swimming2 동안 작업 및 전력 출력을 현실적으로 추정할 수 있습니다. 그러나 다리 운동 중 생체 내 근육 변형 궤적은 신경 활성화, 근골격계 운동학 및 환경에 의해 가해지는 하중 간의 상호 작용에서 동적으로 발생합니다5,7,13,14. 생체 내 근육-힘줄 역학에 해당하는 하중, 변형 궤적 및 힘 생성을 에뮬레이트하고 고유한 근육 역학과 신경 제어가 어떻게 상호 작용하여 섭동에 직면하여 조정된 움직임을 생성하는지에 대한 통찰력을 제공하는 보다 현실적인 작업 루프 기술이 필요합니다.}

여기에서는 시간에 따라 변하는 생체 내 하중을 나타내는 생체 내 변형 궤적을 사용하여 통제된 생체 외 실험 중에 실험실 설치류의 "아바타" 근육을 사용하여 트레드밀 운동 중에 생체 내 근육 힘을 에뮬레이트하는 새로운 방법을 제시합니다. 통제된 생체 외 실험 중에 실험실 동물의 근육에 대한 표적 근육에서 측정된 생체 내 변형 궤적을 사용하면 운동 중에 경험하는 하중을 에뮬레이트할 수 있습니다. 여기에 설명된 실험에서, 생체 외 마우스 신근 digitorum longus(EDL) 근육은 러닝머신에서 걷고, 걷고, 걷고, 질주하는 동안 생체 외 쥐 내측 비복근(MG) 근육의 "아바타"로 사용됩니다¹³. 이 접근 방식은 생체 내 변형 궤적이 적절하게 조정되고 서보 모터에 연결된 생체 외 마우스 근육에 적용된다는 점을 제외하고는 작업 루프 기술과 유사합니다. 생쥐 EDL 근육은 쥐 MG에 비해 크기, 섬유 유형 및 구조가 다르지만 이러한 차이를 제어할 수 있습니다. "아바타" 기술을 통해 (1) 생체 내 변형, 활성화, 보폭 빈도 및 작업 루프 패턴을 에뮬레이트합니다. (2) 생체 내 힘 반응과 가장 정확하게 일치하도록 이러한 패턴을 변경합니다. (3) 기계론적 가설을 테스트하기 위해 통제된 조합에서 변형 및/또는 활성화의 특정 기능을 변경합니다.

Protocol

모든 동물 연구는 노던 애리조나 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다. 본 연구에서는 60-280일 된 수컷 및 암컷 야생형 마우스(균주 B6C3Fe a/a-Ttn^mdm/J)의 신근 디지토럼 롱구스(EDL) 근육을 사용하였다. 동물들은 상업적인 출처(재료 표 참조)에서 얻었으며 Northern Arizona University의 식민지에 설립되었습니다.

1. in vivo strain trajectory 선택 및 ex vivo work loop 실험 중 사용 준비

참고: 이 프로토콜에서는 저자(Nicolai Konow, UMass Lowell, 개인 커뮤니케이션)에게 직접 제공된 생체 내 동적 운동의 이전 측정이 생체 외 실험에 사용되었습니다. 원본 데이터는 Wakeling et al.^{15에 대해 수집되었습니다}. 프로토콜을 복제하려면 시간, 길이 또는 변형률, EMG/활성화 및 힘 데이터가 필요합니다.

1. 모든 프로그래밍 플랫폼(Suplementary Coding File 1에 제공된 MATLab 코드)을 사용하여 전체 in vivo 시험을 개별 보폭으로 분할합니다.
   1. 전체 in vivo 시험에 대한 시간 대비 길이 변화를 플롯합니다. 이는 개별 보폭(스탠스 대 스탠스)을 시각화하고 보폭 간 변동성을 평가하는 데 사용됩니다(그림 1).
   2. 전체 시행에 대한 변형률을 계산합니다(길이(L) /최적 길이 L₀에서 최대 등척력).
   3. 전체 시험에서 모든 보폭을 대표하고 비슷한 길이로 시작하고 끝나는 보폭을 선택합니다. 이것은 각 보폭을 비교하기 위해 서로 위에 있는 길이를 그래프로 표시하여 시각적으로 수행할 수 있습니다.
   4. 대표적인 보폭을 선택한 후 프로그래밍 플랫폼을 사용하여 전체 시험의 변형률, EMG/활성화 및 힘 데이터를 분할합니다(MATLab^{16에 사용된 코드는 보충 코딩 파일 1 참조}).
   5. 스트레인, EMG/활성화 또는 힘에 따라 샘플링 주파수가 다른 경우 모두 동일한 주파수로 샘플링되도록 데이터 포인트를 보간합니다.
      참고: 연구자는 전체 시험에서 샘플링된 각 지점 사이의 시간 간격을 기반으로 캡처 빈도를 결정할 수 있습니다. 변수가 동일한 빈도로 캡처되는 경우 샘플링 시간은 동일합니다.
2. 분할된 보폭의 빈도를 계산합니다.
   1. 세그먼트화된 보폭의 지속 시간을 초 단위로 결정하고 1(초)을 지속 시간(1/duration = 초당 # 보폭)으로 나누어 빈도를 계산합니다.
   2. 주파수와 일치시키기 위해 ex vivo 실험에서 얼마나 많은 데이터 포인트를 획득해야 하는지 수동으로 결정합니다.
   3. 두 걸음에 필요한 시간을 계산합니다. 근육 측정 오차 내에서 추정하기 위해 보폭을 한 번 이상 반복하며, 이는 후속 통계 분석에 필요합니다.
3. 측정된 EMG 활성을 사용하여 변형률 입력에 상대적인 자극 단계를 결정하여 생체 외 작업 루프에 대한 자극의 시작과 지속 시간을 결정합니다. 모든 프로그래밍 플랫폼을 사용할 수 있습니다(이 연구에서 사용된 코드는 추가 코딩 파일 1 참조).
   1. 스트레인 변화와 동일한 x축 범위(시간)에서 EMG 신호를 봅니다(그림 1). EMG 신호를 볼 수 있도록 확대합니다. 이는 EMG 신호에 임의의 숫자를 곱하고, 스트레인과 EMG를 동일한 스케일로 다시 스케일링하고, EMG 신호를 strain.
      에 추가하여 수행할 수 있습니다. 참고: 저자는 MATLab의 "rescale" 기능을 사용하여 균주와 EMG를 동일한 척도로 재조정했습니다(보충 그림 1 참조).
   2. 두 표준 편차의 강도 변화로 표시된 대로 EMG 활동이 시작되고 중지되는 위치를 찾습니다^17,18.
      참고: 동물과 근육에 따라 EMG 시작이 발 접촉(Monica Daley, UC Irvine, 개인 커뮤니케이션)과 일치하거나 일치하지 않을 수 있습니다(토론 섹션 참조).
   3. EMG 활성화가 시작되는 스트레인 사이클의 백분율(예: 40%)과 자극이 발생하는 시간(예: 222ms)을 계산합니다.
      참고: 연구자들은 생체 내 움직임과 생체 외 작업 루프 간에 다르고 동물과 근육마다 다를 수 있는 여기-수축 결합(ECC) 지연을 고려해야 합니다(예: 생체 내 ECC는 쥐 MG의 경우 24.5ms, 생체 외 ECC는 마우스 EDL의 경우 ~5ms).
4. 작업 루프 컨트롤러 프로그램에 대한 대표 변형률 입력을 준비합니다. 스트레인 및 자극에 대한 입력으로 힘 출력을 캡처할 수 있는 모든 프로그램을 작업 루프 컨트롤러 프로그램에 사용할 수 있습니다(토론 섹션 참조).
   1. 선택한 보폭을 취하고 두 주기 동안 생체 내 주파수에서 단계를 캡처하는 데 필요한 적절한 포인트 수로 보간합니다(1.2단계 참조).
   2. 미리 결정된 길이 편위만큼 스트레칭한 후 "변형률 0"(예: L₀ 또는 95% L₀)에서 시작하고 멈추도록 보폭을 다시 조정합니다(3.3단계 참조).
   3. 필요한 경우 마우스 EDL의 변형률 변경에 대한 입력으로 사용하기 위해 선택한 보폭을 "Scale"합니다(토론 섹션 참조). 크기를 조정하려면 마우스 EDL이 손상 없이 늘어날 수 있는 길이 편위를 선택합니다(예: 일반적으로 in vivo 종에 관계없이 마우스 EDL을 10% L₀ 늘립니다). 이는 예비 결과에 따라 변경해야 할 수 있습니다(3.3단계 참조).

그림 1: in vivo 전체 임상시험의 시간 경과에 따른 길이. 쥐 MG의 시간에 대해 표시된 길이 (mm). 보폭은 가장 짧은 길이에서 가장 짧은 길이까지 원으로 구분되며 단일 보폭으로 간주됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2. 생체 외 마우스 근육의 최대 등척력 평가

1. 장비 및 수술 준비.
   참고: ex vivo 작업 루프에 필요한 장비에 대한 설명은 토론 섹션을 참조하십시오.
   1. 옥시튜브 니들 밸브를 워터 재킷 티슈 수조에 삽입하여 조직 장기 수조를 준비합니다(재료표 참조). 산소 튜브를 95% 0_2-5% CO₂로 가스 실린더에 연결합니다. 20psi가 워터 재킷 티슈 수조를 채우도록 합니다.
   2. 가스 라인에서 수술 부위 근처의 Krebs-Henseleit 용액으로 채워진 결정화 접시(2.1.3단계)까지 추가 산소 튜브를 실행하여 수술 부위를 준비합니다. 이것은 수술 중과 수술 후에 근육에 공기가 통하고 수분을 공급하는 데 사용됩니다.
      알림: 한 번에 두 개 이상의 근육을 마우스에서 제거하는 경우 최대 4시간까지 이 폭기 용액에 근육을 저장할 수도 있습니다.
   (
   3. mmol ^l-1)을 포함하는 Krebs-Henseleit 용액 1L를 준비합니다 : NaCl (118); KCl (4.75); 마그네슘₄ (1.18); KH₂PO₄ (1.18); CaCl₂ (2.54); 및 포도당 (10.0)은 실온에서 HCl 및 NaOH를 사용하여 7.4로 pH를 제공합니다 (재료 표 참조). HCl 및 NaOH를 취급할 때는 고글과 장갑의 적절한 PPE를 착용하십시오.
   4. 실온과 pH 7.4에서 Krebs-Henseleit 용액으로 수조를 채웁니다. 근육과 후크를 용액에 완전히 담그십시오.
   5. 모든 장비를 켭니다; 듀얼 모드 근육 레버 시스템, 자극기 및 신호 인터페이스(DAQ 보드)(목차 참조).
2. EDL 근육 절제술.
   1. 생쥐를 깊이 마취시킨 다음 경추 탈구에 의한 안락사를 수행합니다. 마우스를 오른쪽 또는 왼쪽 측면 누운 자세로 눕히고 위쪽 뒷다리를 펴고 발가락이 해부판에 닿도록 합니다. 발목에서 무릎 관절 위까지 털을 제거합니다.
   2. 집게로 피부를 감싸고 발목 관절에서 엉덩이 부위까지 자릅니다. 근육이 드러나면 발목 주위를 바지 "밑단"처럼 자릅니다. 다리 근육이 더 선명하게 보이도록 피부를 위로 당깁니다.
   3. 경골 전방(TA)과 비복근을 분리하는 근막 라인을 찾아 해부 가위를 사용하여 무릎 힘줄을 노출시킵니다. 노출된 두 무릎 힘줄 사이에 해부 가위를 놓습니다. 가위는 노출된 무릎 힘줄 바로 아래 주머니에 "걸릴" 것입니다. Blunt는 가위가 발목에 닿아 EDL이 노출될 때까지 가위를 다리에서 떼어내면서 "주머니"를 해부합니다.
   4. 4-0 실크 수술용 봉합사(재료 표 참조)의 미리 묶인 루프 매듭을 사용하여 무릎에 가장 가까운 힘줄 아래에 봉합사의 한쪽 끝을 묶습니다. 근위 근육-힘줄 접합부 위에 이중 사각형 매듭을 근육에 놓거나 힘줄을 포함하지 않고 묶습니다. 매듭 위를 자릅니다. 힘줄에 묶인 고리를 부드럽게 당기면 EDL이 "포켓"에서 나옵니다.
   5. EDL에 장력을 만들기 위해 루프를 해부 영역에 테이프로 붙입니다. 원위 근육-힘줄 접합부에서 미리 묶인 다른 고리 매듭을 사용하여 근육에 올려 놓거나 힘줄을 포함하지 않고 이중 사각형 매듭을 묶습니다. 다리에 가까운 쪽의 매듭을 잘라 마우스에서 전체 EDL을 제거합니다. 근육의 근위부와 원위부에 있는 이중 사각 매듭에서 여분의 봉합사를 잘라내고 근육을 수술 부위 옆의 폭기된 욕조에 넣습니다.
      알림: 근육을 폭기된 욕조에 넣는 경우 어느 쪽이 근위 및/또는 원위부인지 기록하십시오.
   6. 서보 모터 레버 리그에 배치하려면 부유 백금 전극 사이에 EDL을 수직으로 부착하십시오. 말단 루프 매듭을 고정 후크에 부착하고 근위 루프 매듭을 서보 모터 암에 부착된 후크에 부착합니다. 폭기된 Krebs-Henseleit 용액에 근육을 담그기 위해 조직 수조를 올립니다.
      알림: 폭기는 근육이 물에 잠겼을 때 근육을 방해해서는 안 됩니다. 그렇다면 가스의 압력을 낮추십시오. 자극을 시작하기 전에 10분 동안 근육이 평형을 이루도록 합니다.
3. EDL muscle.
   의 최대 등척력을 측정합니다. 알림: 트위치와 파상풍을 사용하여 최대 등척력을 측정하는 방법에 대한 프로토콜은 표 1을 참조하십시오. 저자가 사용한 프로그램의 그림은 보충 그림 1을 참조하십시오.
   1. 수술 중 근육이 손상되지 않았는지 확인하기 위해 극상 경련으로 근육을 자극합니다(80 V, 1 pps, 1ms; 표 1; 보충 그림 2 참조). 손상이 발생하지 않은 경우 근육 레버 시스템의 길이 손잡이를 사용하여 활성 장력이 ~1V / 0.1271N 미만이고 ~0.1V / 0.01271N 미만의 트위스트 자극을 사용하여 근육 길이를 찾습니다.
   2. 봉합사 매듭에서 봉합사 매듭까지의 근육의 시작 길이를 볼트와 밀리미터 단위로 기록하십시오. 시작 길이에 대한 프로그램의 교정 부분에 측정값을 입력합니다(보충 그림 1 참조).
   3. EDL의 최적 길이(L₀)에서 초최대 트위치 최대 등척력을 찾습니다(표 1). 기술적으로 휴식시간은 필요하지 않지만, 자극 사이에 1분 정도 기다리면 수동 긴장이 안정됩니다. supramaximal twitch가 최대인 길이(볼트)를 기록합니다. 이것은 경련을 위한 최적의 근육 길이(L₀)입니다.
   4. 이 길이에서 캘리퍼로 근육을 측정하십시오. 봉합사 매듭에서 봉합사 매듭까지 근육을 측정합니다. L₀가 발견되면 근육을 다시 시작 길이(활성 장력 ~1V / 0.1271 N)로 줄입니다.
   5. EDL의 초최대 파상풍 최대 등척 힘 찾기(80 V, 180 pps, 500 ms; 표 1). L₀에서 초최대 파탄력의 길이(볼트 및 밀리미터 단위)를 기록하고 봉합사 매듭에서 봉합 매듭까지의 섬유를 캘리퍼로 다시 측정합니다.
      알림: 0.5V/0.65mm 단계에서 근육 길이를 늘리면 경련과 파상풍 모두에 대해 더 정확한 L₀을 얻을 수 있습니다.
   6. EDL의 준최대 등척력 찾기(45 V, 110 pps, 500ms; 표 1) 자극 프로토콜로 인해 피로가 발생하지 않았는지 확인하기 위해_{실험 전후에} L0에서. 힘이 10% 감소하면 "피로한" 근육으로 간주됩니다.

. .

실험			시뮬레이션 강도 (V)		펄스 주파수 (pps / Hz)		자극 지속 시간(ms)		코멘트
1. "워밍업"			80		1		1		길이를 0.50V씩 늘리거나 줄여 1V의 수동 장력을 찾습니다
2. 최적의 근육 길이 트위스트 (L0)			80		1		1		길이를 0.50V씩 늘리거나 줄여 ~1V의 수동 장력을 찾습니다
3. 최적의 근육 길이 파상풍 (L0)			80		180		500		휴식 0.50V 길이 변경 사이에 3분
4. 실험 전 submaximal L0			45		110		500		L0의 길이
6. 아바타 실험			45		110				마우스 EDL에 대한 대표 길이 변경을 주기적으로 사용
7. 실험 후 submaximal L0			45		110		500		실험 후 L0로 돌아가서 L0 측정

표 1: 자극 프로토콜. 초최대(supramaximal) 및 준최대(submaximal) 경련과 파상풍 최적 길이를 찾기 위한 자극 프로토콜. 프로토콜은 자극 강도, 타이밍 및 초당 펄스에 따라 다릅니다.

3. 선택된 in vivo 변형 궤적을 사용하여 "아바타" 작업 루프 기술 완료

1. "아바타" 작업 루프 기술을 완료하는 데 필요한 소프트웨어를 설정합니다(재료 표 참조).
   참고: 각 시간 단계에서 근육 길이를 지정하는 입력 파일(.csv 또는 이와 유사한 파일)이 필요합니다(1.4단계 참조). 자극이 시작되는 주기의 백분율과 자극 지속 시간에 대한 입력이 필요합니다(예를 들어 보충 그림 3 참조).
2. "아바타" 작업 루프 기술을 완성합니다.
   참고 : 사용자 정의 LabView 프로그램을 사용하는 동안 연구원은 서보 모터 레버에서 마우스 EDL의 길이 변경 제어, 지정된 시간에서의 자극 시작(% 주기) 및 지속 시간(ms) 제어, 근력 측정을 허용하는 모든 프로그램을 사용할 수 있습니다. Supplementary Figure 3에서 프로그램 작성자가 사용하는 방법에 대한 설명을 볼 수 있습니다.
   1. 1.4단계부터 스케일링된 길이 편위와 함께 스케일링된 변형률 변경 사항을 프로그램에 업로드합니다. 1.4, 3.3 단계 및 "스케일링된 변형률 변경"에 대한 자세한 내용은 토론 섹션을 참조하십시오.
   2. 필요한 경우 근육의 시작 길이를 조정합니다(섹션 3.3 참조). 시작 길이를 V 및 mm 단위로 입력하여 결과를 보정합니다(보충 그림 3 참조).
   3. 1.3단계에서 계산된 자극 시작 및 지속 시간을 사용합니다.
   4. 두 사이클 동안 결정된 길이 편위(length excursion)로 스케일링된 길이 변화를 통해 근육을 실행합니다.
   5. 데이터를 저장합니다. 동일한 근육에 여러 자극 프로토콜이 모인 경우 각 자극 사이에 3분 동안 기다립니다.
   6. 피로가 발생했는지 확인하기 위해 준최대 활성화를 사용하여 최적의 길이(L₀)로 자극합니다. 힘이 10% 이상 감소하면 근육이 피로한 것으로 간주됩니다. 자극 프로토콜에 대해서는 표 1을 참조하십시오.
   7. 욕조에서 근육을 제거하십시오. 절단 루프로 근육을 매듭짓고 근육에서 여분의 용액을 두드려 제거합니다. 근육의 무게를 잰다. 표준 공식을 사용하여 생리학적 단면적을 결정합니다: muscle mass/(L₀*1.06)¹⁹.
3. "아바타" 작업 루프 기술에 대한 매개변수를 조정합니다(토론 섹션 참조).
   1. 생체 외 수동 장력 상승을 생체 내에서 관찰된 수동 장력 상승과 일치시켜 시작 길이와 길이 편위를 결정합니다(그림 2).
      참고: 이 연구에서는 시작 길이(mm)와 편위(% L₀, 1.4단계 및 논의 섹션 참조)를 조정하기 위해 퍼센트 L₀을 사용했습니다. 저자는 생체 외 마우스 EDL의 장력 상승을 생체 내 쥐 MG의 장력 상승과 일치시키기 위해 L₀에서 시작하는 길이가 가장 적합하다는 것을 발견했습니다(그림 2).
   2. 세 가지 시작 길이(예: -5% L₀, L₀ 및 +5% L₀)를 선택합니다. 지정된 길이 편위(예: 10% L₀)로 이러한 각 시작 길이에서 "아바타" 작업 루프를 수행합니다.
      참고: 마우스 EDL을 사용한 본 "아바타" 실험에서는 10%_L0의 길이 편위가 사용되었습니다.
   3. 생체 외 수동 장력 상승 속도가 생체 내 수동 장력 상승 속도와 유사해질 때까지 새로운 시작 길이 및/또는 편위를 반복합니다(그림 2B 참조).
   4. 섬유질 유형과 사용된 근육의 활성화 역학에 따라 자극 지속 시간을 늘리거나 줄여 체외력과 생체 내 힘 간의 일치를 최적화합니다. 따라서, "아바타" 실험 동안 생체 내 힘 생성과 가장 잘 일치하도록 자극의 시작 및/또는 지속 시간을 변경해야 할 수도 있습니다.
   5. 이것이 필요한지 여부를 결정하기 위해(논의 섹션 참조), "아바타" 및 생체 내 근육(그림 3)의 시간 경과에 따른 힘을 플롯하고 목표와 "아바타" 근육 힘 사이의 스케일링된 상관 관계를 제곱하여 결정 계수 R²를 계산합니다(대표 결과 참조).

그림 2: 매칭 패시브 텐션 상승. 수동 장력(화살표)에서 in vivo 및 ex vivo 상승을 보여주는 작업 루프. 2.9Hz로 걷는 쥐 MG(검은색)의 생체 내 확장 작업 루프(데이터: Wakeling et al.¹⁵). 2.9Hz에서 마우스 EDL(녹색)의 생체 외 스케일 작업 루프. (A) 마우스 EDL 근육의 시작 길이는 +5% L₀입니다. (B) 마우스 EDL 근육의 시작 길이는_L0입니다. 생체 외 수동 장력 상승은 A의 생체 내 장력 상승과 일치하지만 B에서는 일치하지 않습니다. 두꺼운 선은 자극을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 쥐 MG(검은색 선)의 생체 내 힘과 일치하도록 마우스 EDL의 자극 지속 시간 최적화. EMG 기반 자극(녹색 점선)을 사용하여 마우스 EDL에 의해 생성된 힘은 생체 내 힘보다 일찍 감소하는데, 이는 랫드 MG에 비해 마우스 EDL의 비활성화가 더 빠르기 때문일 수 있습니다. in vivo forces와 ex vivo forces 사이의 적합을 최적화하기 위해 마우스 EDL을 더 긴 기간(녹색 실선) 동안 자극했습니다. 근전도 기반 자극 R² = 0.55, 최적화된 자극 R² = 0.91. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Results

"아바타" 실험의 목표는 생체 외 작업 루프 실험 중에 생체 내 힘 생산 및 작업 출력을 가능한 한 가깝게 복제하는 것입니다. 이 연구는 마우스 EDL과 랫트 MG가 모두 대부분 빠르게 움직이는 근육으로 구성되어 있기 때문에 마우스 EDL을 쥐 MG의 "아바타"로 사용하기로 결정했습니다^20,21. 두 근육 모두 유사한 수심 각도(마우스 EDL 12.4 + 2.12°²², 이 연구에서 사용된 랫트 MG 20°^{15)를 가진 발목 관절(EDL 발목 배굴근, MG 발목 발바닥 굴곡근)의 주요 운동원입니다}. 쥐 MG^{15의 스케일링된 대표 작업 루프}를 두 가지 다른 자극 프로토콜(측정된 EMG 활성에서 얻은 것과 3.3단계에서와 같이 최적화된 것)을 사용하여 ...

Discussion

유기체는 풍경을 가로질러 원활하게 이동하지만 근육이 경험하는 근본적인 부하와 긴장은 크게 다릅니다^1,6,23. 생체 내 이동 ^1,24 및 "아바타" 실험 모두에서 근육은 주기적이고 비정상적인 조건에서 최대값 이하로 자극됩니다. 등척성 힘-길이 및 등장성 힘-속도 관계는 이러한 조건에서 근력을 예측하는 데 적합하지 않습니다². 비정상 변형률(즉, 과도 현상) 및 하중의 영향을 이해하는 것은 생체 내 이동 중 힘 생성을 예측하는 데 필수적이므로 이러한 "아바타" 실험을 개발하는 주요 근거입니다². "아바타" 실험을 통해 힘 출력을 측정하면서 근육 ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
땋은 비흡수성 실크 봉합사 4-0	머실크	734H
칼슘 클로라이드 이수화물 (CaCl2)	Sigma-Aldrich	1086436	Krebs-Henseleit  솔루션
덱스트로스	시그마-알드리치	D9434	크렙스-헨셀라이트  솔루션
HEPES	Sigma-Aldrich	PHR1428	Krebs-Henseleit  용액
: hydorchloric acid (HCl)	시그마-알드리치	1.37055	크렙스-헨셀라이트
솔루션 LabView 데이터 수집	Lab-View
마그네슘 황산염 (MgSO4)	Sigma-Aldrich	M7506	Krebs-Henseleit  용액
염화칼륨 (KCl)	시그마-알드리치	P3911	크렙스-헨셀라이트  용액
인산칼륨 일염기성 (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	5.43841	Krebs-Henseleit  솔루션
S88 스티뮬레이터	잔디	M643H05	Ebay에서 구매 가능
시리즈 300B 레버 시스템	Aurora	1200A는	워터재킷 티슈 욕조를 포함하고 있습니다
Sodium Bicarbonate (NaHCO3)Sigma-Aldrich		S5761	Krebs-Henseleit  용액
염화나트륨 (NaCl)	시그마-알드리치	S9888	크렙스-헨셀라이트  용액
수산화나트륨 (NaOH)	시그마-알드리치	S5881	크렙스-헨셀레이트  솔루션
: 야생형 마우스	: 잭슨 연구소	: B6C3Fe, a / a, Ttn : mdm / J