이 프로토콜은 미토콘드리아 부피의 변화, 미토콘드리아 호흡 사슬(MRC) 복합 소단위의 양 및 미토콘드리아 DNA(mtDNA) 복제를 포함한 여러 미토콘드리아 기능 매개변수를 동시에 평가하기 위해 스트리밍 세포분석기와 여러 항체를 사용하는 고유한 방법을 보고합니다.
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이 논문에서
요약
초록
미토콘드리아 기능 장애는 많은 유형의 신경 퇴행에 대한 일반적인 1차 또는 2차 원인이며, 미토콘드리아 질량, 미토콘드리아 호흡 사슬(MRC) 복합체 및 미토콘드리아 DNA(mtDNA) 복제 수의 변화가 이러한 과정에서 자주 나타납니다. 인간 유도 만능 줄기세포(iPSC)에서 유래한 인간 뇌 오가노이드는 뇌의 3차원(3D) 세포구조학적 배열을 재현하고 복잡한 인간 시스템에서 질병 메커니즘을 연구하고 새로운 치료법을 스크리닝할 수 있는 가능성을 제공합니다. 여기에서는 iPSC 유래 피질 오가노이드에서 여러 미토콘드리아 매개변수를 측정하기 위한 고유한 유세포 분석 기반 접근 방식을 보고합니다. 이 보고서는 iPSC에서 피질 뇌 오가노이드를 생성하는 프로토콜, 생성된 오가노이드의 단일 세포 해리, 고정, 염색 및 후속 유세포 분석을 통해 여러 미토콘드리아 매개변수를 평가하기 위한 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. MRC 복합체 소단위 NADH에 대한 항체를 사용한 이중 염색: 유비퀴논 산화환원효소 소단위 B10(NDUFB10) 또는 미토콘드리아 전사 인자 A(TFAM)와 전압 의존성 음이온 선택적 채널 1(VDAC 1)을 함께 사용하면 미토콘드리아당 이러한 단백질의 양을 평가할 수 있습니다. TFAM의 양은 mtDNA의 양에 해당하기 때문에 미토콘드리아 함량당 mtDNA 복제 수를 간접적으로 추정할 수 있습니다. 이 전체 절차는 2-3시간 이내에 완료할 수 있습니다. 결정적으로, 이는 미토콘드리아 질량에 대한 총 및 특정 수준을 모두 포함하는 여러 미토콘드리아 매개변수의 동시 정량화를 허용합니다.
서론
미토콘드리아는 필수 세포 소기관이며 아데노신 삼인산(ATP) 생산의 주요 부위입니다. 미토콘드리아는 세포에 에너지를 제공하는 것 외에도 세포 정보 전달, 세포 분화, 세포사멸을 포함한 여러 세포 과정에 참여하며 세포 성장과 세포 주기를 조절하는 능력을 가지고 있습니다. 파킨슨병(PD)1,2, 알츠하이머병(AD)3, 근위축성 측삭 경화증(ALS)4을 포함한 다양한 신경퇴행성 질환에서 미토콘드리아 기능의 변화가 확인되었습니다. 미토콘드리아 기능 장애는 노화 과정에서 체세포 mtDNA 돌연변이를 축적하고 호흡 사슬 기능을 저하시키는 역할을 한다5.
신경 퇴행에서는 다양한 유형의 미토콘드리아 기능 장애가 발생하며, 이러한 변화를 측정하는 능력은 질병 메커니즘을 연구하고 잠재적인 치료법을 테스트할 때 매우 유용합니다. 또한 인간 뇌 세포의 질병을 재현하는 적절한 체외 모델 시스템을 구축하는 것은 질병 메커니즘을 더 잘 이해하고 새로운 치료법을 개....
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프로토콜
1. iPSC를 피질 오가노이드로 분화
- 매트릭스 코팅 플레이트의 준비
- 시중에서 판매되는 기저막 매트릭스의 바이알을 얼음 위에서 밤새 해동합니다. 차갑게 1:100으로 희석하여 Advanced Dulbecco의 Modified Eagle's Medium/Ham's F12 DMEM/F12(최종 농도 1%). 부분 표본을 만들어 -20 °C에서 보관합니다( 재료 표 참조).
- 멤브레인 매트릭스 용액을 4°C에서 해동하고(차갑게 유지) 필요한 수의 웰(6웰 플레이트의 웰 1개당 1mL)을 코팅합니다. 37 ° C에서 1 시간 동안 배양하십시오.
- 인큐베이터에서 접시를 꺼내 실온(RT)에 도달하도록 합니다(한 시간 동안 그대로 두십시오).
알림: 플레이트는 냉장고에서 최대 2주 동안 보관할 수 있습니다(사용하기 전에 꺼내서 RT에서 그날 필요한 코팅된 웰을 만졌을 때 더 이상 식지 않을 때까지 따뜻하게 하는 것을 잊지 마십시오). 플레이트는 3일 이내에 사용하는 것이 좋습니다. 장기간 보관하는 경우, 코팅된 플레이트에 Essential 8 Medium( 재료 표 참조) 1....
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결과
그림 1은 차별화 프로세스와 유세포 분석에 사용되는 전략을 다이어그램으로 표시한 것입니다. 인간 iPSC를 비접착성 96웰 플레이트에서 배양하여 EB를 형성한 다음 비접착성 6웰 플레이트로 옮겨 완전히 성장한 피질 오가노이드를 얻었습니다. 오가노이드의 세포 조성은 neuronal16 및 glial markers17로 면역염색한 후 컨포칼 현미경을 사용하여 검증되었습니다. 오가노이드는 개별 세포에서 여러 미토콘드리아 매개변수의 유세포 분석 기반 측정을 용이하게 하기 위해 단일 세포로 해리되었습니다. 이 프로토콜에서는 미토콘드리아 질량의 매개변수, MRC 복합체 I 소단위 및 TFAM의 양, 상대 mtDNA 복제 수의 간접 측정을 획득하고 분석하기 위해 여러 염색 전략이 사용됩니다. 이 프로토콜은 오가노이드를 해리하고 유세포 분석 데이터를 획득하는 단계를 제공합니다.
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토론
인간 iPSC에서 피질 뇌 오가노이드를 생성하고 이러한 오가노이드에서 분리된 단일 세포에서 미토콘드리아 매개변수의 유세포 분석을 수행하기 위한 프로토콜이 제시됩니다. 오가노이드의 세포 구성은 신경 세포 및 신경교세포 마커에 대한 면역조직화학적 염색을 사용한 컨포칼 현미경으로 검증되었습니다. anti-NDUFB10, VDAC 1 및 TFAM과 함께 염색하는 유세포 분석 기반 전략은 세포 내 미토콘드리아의 수에 상대적인 complex I 및 mtDNA의 특정 수준을 측정할 수 있는 것으로 나타났습니다. 이 프로토콜은 모든 유형의 뇌 유사 세포에서 미토콘드리아를 측정하는 데 적합하며 미토콘드리아 기능 장애 질병을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
이 프로토콜은 이중 SMAD와 Wnt 억제의 조합을 사용하여 뇌 오가노이드를 생성할 수 있습니다. 이 삼중 억제는 이중 SMAD 억제에 비해 더 균일한 피질 NSC 프로파일을 생성합.......
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공개 사항
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감사의 글
노르웨이 오슬로 대학교 기초의학연구소(Institute of Basic Medical Sciences)의 가레스 존 설리번(Gareth John Sullivan)에게 AG05836(RRID:CVCL_2B58) 세포주를 아낌없이 제공해 주신 데 대해 진심으로 감사드립니다. 노르웨이 베르겐 대학교(University of Bergen)의 유세포 분석 핵심 시설(Flow Cytometry Core Facility)의 분자 이미징 센터(Molecular Imaging Centre)에 감사드립니다. K.L은 베르겐 멜처 대학(University of Bergen Meltzers Høyskolefonds, 프로젝트 번호: 103517133)과 게르다 마이어 나이퀴스트 굴드브란드슨(Gerda Meyer Nyquist Guldbrandson og Gerdt Meyer Nyquiists) 레가트(프로젝트 번호: 103816102)의 일부 지원을 받았다. L.A.B는 노르웨이 연구 위원회(프로젝트 번호: 229652), Rakel og Otto Kr.Bruuns legat 및 Gerda Meyer Nyquist Guldbrandson og Gerdt Meyer Nyquists legat의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 유세포 분석을 | |||
| anti-DUFB10, Alexa Fluor 405 | NOVUS biologicals, | NBP2-72915AF405 | |
| anti-VDAC1, Alexa Fluor 647 | Santa cruz technology | sc-390996 | |
| anti-TFAM, Alexa Fluor 488 | Abcam | ab198308 | |
| L/D, fixable near-IR dead cell stain kit | Life technologies | L10119 | |
| 면역형광 염색에 | |||
| Anti-Tuj1 | Abcam | ab78078 | |
| anti-SOX2 | Abcam | ab97959 | |
| anti-Alexa Flour 488 | Thermo Fisher Scientific | A28175 | |
| anti-Alexa Flour 594 | Thermo Fisher Scientific | A-21442 | |
| Commercial cells | |||
| AG05836 (RRID:CVCL_2B58) | 기초 의학 연구소(Institute of Basic Medical Sciences)의 Gareth John Sullivan이 제공합니다. 노르웨이 오슬로 대학교 | ||
| 필수 8 배지(iPSC 배양 배지) | |||
| 필수 8 기초 배지 | Thermo Fisher Scientific | A1516901 | |
| Essential 8 Supplement (50x) 2% (V/V) | Thermo Fisher Scientific | A1517101 | |
| 4°C에 보관; C를 사용하고 사용하기 전에 RT로 워밍업하십시오. | |||
| Instruments | |||
| Heracell 150i CO2 인큐베이터 | Fisher Scientific, 미국 | ||
| 오비탈 쉐이커 - SSM1, SSL1 | Stuart Equipment, 영국 | ||
| CCD 현미경 카메라 Leica DFC3000 G | Leica Microsystems, 독일 | ||
| 수조 JB Academy Basic JBA5 JBA5 보조금 Instruments | Grant Instruments, 미국 | ||
| 유체 흡입 시스템 BVC 제어 | Vacuubrand, 독일 | ||
| Leica TCS SP8 STED 컨포칼 현미경 | Leica Microsystems, 독일 | ||
| 50 mL 팔콘 튜브 | Sigma-Aldrich | CLS430828 | |
| BD LSR Fortessa | BD Biosciences, 미국 | ||
| Flowjo 샘플러 분석 | FlowJo LLC, 미국 | ||
| 10 mL 피펫 | Sigma-Aldrich | SIAL1100 | |
| 1, 10, 100, 1000 mL 피펫 | Sigma-Aldrich | ||
| 40 µ m Cell stariner | Sigma-Aldrich | CLS431750 | |
| 초저 부착 96-웰 플레이트 | S-BIO | MS-9096UZ | |
| Countess II 자동 세포 카운터 | Thermo Fisher Scientific | ||
| Neural differentiation medium (NDM+) | |||
| DMEM/F12 | Life technologies | 11330032 | |
| Neurobasal medium | Life technologies | 2110349 | |
| Glutamax supplement 1% (v/v) | Life technologies | 35050 | |
| N2 supplement 0.5% (v/v) | Life technologies | 17502-048 | |
| B27 supplement 1% (v/v) | Life 기술 | 17504-044 | |
| β-Mercaptoethanol 50 µ M | 시그마-알드리치 | M3148 | |
| BDNF 20 ng/mL | Peprotech | 450-02 | |
| 아스코르브산 200 &마이크로; M | 시그마-알드리치 | A92902 | |
| 4°에 저장; 최대 2주 | |||
| <강한>신경 분화 매체 - 비아민 A (NDM-) | |||
| DMEM/F12 | 생명 기술 | 11330032 | |
| 신경 기초 매체 | 생명 기술 | 2110349 | |
| 글루타맥스 보충제 1% (v/v) | 생명 기술 | 35050 | |
| N2 보충제 0.5% (v/ v) | Life technologies | 17502-048 | |
| B27 보충제 W/O vit. A 1% (v/v) | Life technologies | 12587010 | |
| β-Mercaptoethanol 50 µ M | 시그마-알드리치 | M3148 | |
| 4°에 보관; 최대 8일 | |||
| Neural Induction Medium (NIM) | |||
| DMEM/F12 | Life technologies | 11330032 | |
| Knockout serum replacement 15% (v/v) | Life technologies | 10828028 | |
| Glutamax supplement 1% (v/v) | Life technologies | 35050 | |
| β- 메르캅토에탄올 100 &마이크로; M | 시그마-알드리치 | M3148 | |
| LDN-193189 100 nM | 스템젠트/리프로셀 | 04-0074 | |
| SB431542 10 &마이크로; M | 토크리스 | 1614 | |
| XAV939 2 &마이크로; M | Sigma-Aldrich | X3004 | |
| 4° 매장; 최대 10일 | |||
| Neutralization medium | |||
| IMDM | Life technologies | 21980032 | |
| FBS 10% | Sigma-Aldrich | 12103C | |
| 기타 시약 | |||
| DPBS (Ca2+/Mg2+ free) | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | |
| 소 혈청 알부민 | 유로파 바이오 제품 | EQBAH62-1000 | |
| Accutase | Life Technologies | A11105-01 | |
| Geltrex | Life 기술 | A1413302 | |
| EDTA | Life 기술 | 15575038 | |
| Advanced DMEM / F12 | Life Technologies | 12634010 | |
| 신경 조직 해리 키트 | Miltenyi biotec | 130-092-628 | |
| Y-27632 dihydrochloride Rock Inhibitor | Biotechne Tocris | 1254 | |
| Fluoromount-G™ 마운팅 매체 | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| PFA | Thermo Fisher Scientific | 28908 |
참고문헌
- Bindoff, L. A., Birch-Machin, M., Cartlidge, N. E., Parker, W. D. Jr, Turnbull, D. M. Mitochondrial function in Parkinson's disease. The Lancet. 2 (8653), 49(1989).
- Gonzalez-Rodriguez, P., et al. Disruption of mitochondrial complex I induces progressive parkinsonism. Nature. 59....
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