ICP-MS를 사용한 다중 원소 측정을 위한 균질화 및 마이크로파 지원 습식 산 분해를 사용한 식품 시료 준비

원소 분석은 다양한 샘플의 원소 조성을 결정하기 위한 분석 프로세스입니다. 금속(특히 중금속¹)의 고농도는 원치 않는 건강 문제를 일으킬 수 있으므로 인체로의 금속 섭취를 제어하는 데 사용할 수 있습니다. 중금속은 또한 주요 환경 오염 물질 중 하나이므로 환경에서의 존재 제어가 필요합니다². 또한, 원소 분석은 식품의 지리적 원산지³ 를 결정하고 식품 및^수자원4의 품질을 제어하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 토양5의 미량 영양소와 다량 영양소를^{측정하고,} 광물과 퇴적물⁶의 화학적 조성을 조사하여 역사를 통틀어 지질학적 과정에 대한 통찰력을 얻는 데 사용된다. 또한 추가^{금속 재생7}을 위해 전기 및 전자 폐기물에서 희귀 금속의 존재를 확인하고, 약물 치료⁸의 성공을 평가하고, 금속 임플란트⁹의 원소 조성을 검증하기 위한 연구도 수행되었다.

유도 결합 플라즈마 질량 분석법(ICP-MS) 및 유도 결합 플라즈마 발광 분광법(ICP-OES)은 다양한 샘플의 원소 분석에 일반적으로 사용되는 기술이다¹⁰. 이를 통해 검출 한계(LOD)와 정량 한계(LOQ)가 ng/L만큼 낮은 여러 원소를 동시에 측정할 수 있습니다. 일반적으로 ICP-MS는 ICP-OES12에 비해 LOD 값⁽¹¹)이 낮고 선형 농도 범위가 더 넓습니다. 원소 조성을 결정하기 위한 다른 기술로는 마이크로파 유도 플라즈마 광학 방출 분광법⁽¹³)과 화염 원자 흡수 분광법(flame atomic absorption spectroscopy), 전열 원자 흡수 분광법(electrothermal atomic absorption spectroscopy)², 저온 증기 원자 흡수 분광법(cold vapor atomic absorption spectroscopy) 및 수소화물 생성 원자 흡수 분광법(hydride generation atomic absorption spectroscopy⁾¹⁴을 포함한 원자 흡수 분광법(AAS)의 여러 변형이 있습니다. 또한, 낮은 LOD 및 LOQ를 사용한 원소 측정은 다양한 전기 분석 방법, 특히 양극 박리 전압전류법^15,16을 사용하여 가능합니다. 물론 샘플의 원소 조성을 결정하는 다른 방법이 있지만 위에서 언급한 방법만큼 자주 사용되지는 않습니다.

고체 시료의 직접적인 원소 측정은 레이저 유도 분해 분광법 및 X선 형광¹⁷을 사용하여 가능합니다. 그러나 ICP-MS, ICP-OES 및 AAS를 사용한 원소 측정을 위해서는 고체 샘플을 액체 상태로 변환해야 합니다. 이를 위해, 산 분해는 산 및 보조 시약(대부분의 경우_H2O2)을 사용하여 수행된다. 산 분해는 고온 및 고압에서 수행되어, 시료의 유기 부분을 기체 생성물로 변환하고, 금속 원소를 수용성 염으로 변환하여, 용액(¹⁸)에 용해시킨다.

위산 분해에는 개방 혈관 소화와 폐쇄 혈관 소화의 두 가지 주요 유형이 있습니다. 개방 용기 분해는 비용 효율적이지만(¹⁴ ) 대기압에서 산의 끓는 온도와 일치하는 최대 분해 온도와 같은 한계가 있다. 샘플은 핫 플레이트, 히팅 블록, 수조, 모래 수조^(sands bath)2 및 마이크로파(^{microwaves)19}에 의해 가열될 수 있다. 이러한 방식으로 샘플을 가열함으로써, 생성된 열의 상당 부분이 주변(²⁰)으로 손실되고, 이는 분해 시간⁽¹⁴)을 연장시킨다. 개방 용기 분해의 다른 단점은 더 많은 화학 물질 소비, 주변 환경으로부터의 더 큰 오염 가능성, 및 휘발성 성분의 형성 및 반응 혼합물로부터의 증발로 인한 분석물의 손실 가능성을 포함한다(²¹).

밀폐형 용기 시스템은 개방형 용기 시스템에 비해 유기 및 무기 시료의 분해에 더 편리합니다. 폐쇄 용기 시스템은 전도 가열 및 마이크로파와 같은 다양한 에너지원을 사용하여 샘플을 가열합니다²². 마이크로파를 사용하는 분해 방법에는 마이크로파 유도 연소(²³), 단일 반응 챔버 시스템(²⁴) 및 일반적으로 사용되는 마이크로파 보조 습식 산 분해(MAWD)^25,26가 포함됩니다. MAWD는 기기의 작동 조건에 따라 220°C에서 260°C 사이의 더 높은 작동 온도와 최대 200bar의 압력에서 분해할 수 있습니다²⁷.

MAWD의 효율과 속도는 시료의 화학적 조성, 최대 온도, 온도 구배, 반응 용기의 압력, 첨가된 산의 양, 사용된 산의 농도 등 여러 요인에 따라 달라진다²⁸. MAWD에서는 개방형 용기 시스템에서 더 오래 지속되는 분해에 비해 반응 조건이 높기 때문에 몇 분 안에 완전한 산 분해를 달성할 수 있습니다. MAWD에서는 더 낮은 양과 농도의 산이 필요하며, 이는 현재 녹색 화학 지침²⁹에 부합합니다. MAWD에서, 산 분해를 수행하기 위해 개방 용기 분해에 비해 더 적은 양의 샘플이 필요하며, 일반적으로 최대 500mg의 샘플이면 충분합니다^30,31,32. 더 많은 양의 시료를 분해할 수 있지만 더 많은 양의 화학 물질이 필요합니다.

MAWD용 기기는 반응 조건을 자동으로 제어하고 가열 중에 사람이 화학 물질과 직접 접촉하지 않기 때문에 MAWD는 개방형 용기 분해보다 작동하기에 더 안전합니다. 그러나 반응 용기에 화학 물질을 첨가할 때는 신체에 접촉하여 해를 끼치지 않도록 항상 주의해야 합니다. 또한 반응 용기는 산 분해 중에 내부에 압력이 축적되므로 천천히 열어야 합니다.

산 분해는 원소 측정을 위한 시료 준비에 유용한 기술이지만, 이를 수행하는 사람은 가능한 한계를 알고 있어야 합니다. 산 분해는 모든 시료, 특히 복잡한 매트릭스가 있는 시료와 반응성이 높거나 폭발적으로 반응할 수 있는 시료에 적합하지 않을 수 있습니다. 따라서 시료 조성을 항상 평가하여 용액에 원하는 모든 원소를 용해시키는 완전한 분해를 위한 적절한 화학 물질 및 반응 조건을 선택해야 합니다. 사용자가 고려하고 해결해야 하는 다른 문제는 시료 전처리의 모든 단계에서 불순물과 분석물 손실입니다. 산 분해는 항상 특정 규칙에 따라 수행하거나 프로토콜을 사용하여 수행해야 합니다.

아래에 설명된 프로토콜은 실험실 크기의 믹서에서 식품 샘플의 균질화, 믹서 구성 요소 세척 절차, 적절한 샘플 칭량, 화학 물질 추가, MAWD에 의한 산 분해 수행, 분해 완료 후 반응 용기 세척, 원소 측정을 위한 샘플 준비 및 ICP-MS를 사용한 정량적 다중 원소 측정 수행에 대한 지침을 제공합니다. 아래 지침을 따르면 원소 측정에 적합한 샘플을 준비하고 분해된 샘플의 측정을 수행할 수 있어야 합니다.

1. 시료 균질화

1. 깨끗한 세라믹 나이프를 사용하여 음식 샘플(브로콜리, 버섯, 소시지, 국수)을 수동으로 더 작은 조각으로 잘라 건조 과정을 가속화합니다. 산 분해를 최소 6회 반복할 수 있는 충분한 샘플을 준비합니다(건조된 샘플의 최소 질량이 1500mg인지 확인).
   알림: 샘플의 표면적을 늘리면 샘플의 더 많은 부분이 가열된 주변 공기에 노출되어 물의 증발 속도가 증가합니다.
2. 샘플을 250mL 유리 비커에 넣고 건조기를 사용하여 105°C에서 일정한 무게로 건조합니다.
3. 샘플이 있는 유리 비커를 건조기에서 꺼내 데시케이터에 넣습니다.
4. 샘플을 실온으로 식히십시오.
   알림: 샘플은 무게가 질량을 정확하게 반영하도록 일정한 온도에서 무게를 측정해야 합니다. 온도 변화는 측정된 샘플의 부피와 밀도에 영향을 미칠 수 있습니다.
5. 데시케이터를 열고 유리 비커를 샘플과 함께 분석 저울로 옮깁니다. 샘플로 유리 비커의 무게를 측정합니다.
6. 계량이 완료된 후 샘플을 건조기에 다시 넣습니다.
   참고: 건조 중에 샘플이 크게 줄어들면 보다 편리한 계량을 위해 플라스틱 주걱을 사용하여 더 작은 유리 비커로 옮길 수 있습니다.
7. 샘플의 일정한 무게에 도달할 때까지 1.3-1.6단계에 설명된 대로 프로세스를 반복합니다.
8. 건조된 이종 샘플을 믹서 비커에 넣고( 재료 표 참조) 믹서 비커의 최대 부피를 초과하지 않도록 합니다.
9. 믹서 비커를 믹서에 삽입하고 가드 도어를 닫습니다(그림 1).
10. 시작 버튼을 눌러 샘플을 분쇄 및 혼합하기 위한 블레이드를 활성화합니다.
11. 샘플이 미세한 분말 또는 균질한 페이스트로 변할 때까지 분쇄를 수행합니다. 이러한 제품을 얻으려면 연삭 과정을 여러 번 반복하십시오.
12. 샘플이 균질화되면 믹서를 끄고 가드 도어를 열고 믹서 비커를 제거합니다.
13. 믹서 비커에서 균질화된 시료를 제거하고 깨끗한 플라스틱 주걱을 사용하여 깨끗한 50mL 유리 비커로 옮깁니다(그림 2).
    알림: 만약 sample이 너무 단단하고 블레이드 및 믹서 비커와 같은 믹서의 구성 요소를 잠재적으로 손상시킬 수 있는 경우 모르타르로 분쇄하는 것과 같은 다른 방법으로 균질화할 수 있습니다. 믹서는 일반적으로 단단한 재료, 냉동 샘플 또는 쉽게 가연성 샘플을 균질화하는 데 적합하지 않아 믹서의 구성 요소를 손상시킬 수 있습니다. 믹서에 유기 용매를 사용하지 않는 것이 좋습니다.
    주의 : 안전 장비를 사용하고 믹서의 블레이드가 고속으로 회전할 때 믹서의 도어가 적절하게 닫혀 있는지 확인하십시오.

2. 믹서 청소

1. 초순수( 재료 표 참조)를 빈 믹서 비커의 표시에 추가합니다.
2. 믹서 비커를 믹서에 삽입하고 표준 혼합 절차를 수행합니다.
3. 믹서에서 비커를 꺼내 폐수를 쏟아냅니다. 필요한 경우 혼합 후에도 물이 깨끗해질 때까지 초순수로 여러 번 반복합니다.
4. 믹서에서 오염된 블레이드와 다이어프램 씰을 제거하고 초순수로 철저히 청소하십시오.
   알림: 특히 지방 함량이 높은 샘플을 처리할 때 지방이 실험실 인벤토리 표면에 쉽게 부착되므로 세척 효율성을 높이려면 중성 세제를 사용하십시오.
   주의 : 날카로운 모서리로 인한 잠재적인 부상 위험을 줄이기 위해 블레이드를 제거하고 청소할 때 장갑과 같은 적절한 보호 장비를 착용하십시오.
5. 세척한 부품을 건조기에서 105°C로 건조하고 믹서에 다시 넣습니다.
   알림: 믹서에 다시 설치하기 전에 믹서의 구성 요소가 완전히 건조되었는지 확인하여 물이 다음 s로 옮겨지는 것을 방지하십시오.amp르.

3. 샘플 칭량

1. 100mL 트리플루오로메톡실-폴리테트라플루오로에틸렌 TFM-PTFE 반응 용기(³³)에서 커버 뚜껑을 제거합니다.
2. 개방 반응 용기를 분석 저울 위에 놓고 각 측정 전에 저울이 수평을 이루고 영점 조정되었는지 확인합니다(그림 3).
   알림: 계량은 실온에서 수행해야 합니다. 심한 온도 변화와 공기 흐름이 측정된 무게에 영향을 줄 수 있는 장소를 피하십시오. 칭량 영역이 깨끗하고 오염 물질이 없는지 확인하십시오.
3. 플라스틱 주걱을 사용하여 균질화된 시료를 반응 용기로 옮기고 시료 250mg을 칭량합니다. sample을 분석 저울의 최소 유효 한도 미만으로 칭량하지 마십시오.
4. 칭량이 완료되면 샘플이 오염되지 않도록 보호하기 위해 반응 용기에 덮개 뚜껑을 놓습니다.
   알림: 분해 절차의 중량 제한을 초과하면 불완전 소화가 발생할 수 있습니다. 외부 오염을 방지하기 위해 샘플과 반응 용기를 조심스럽게 다루십시오.

4. 산 첨가

1. 약 40.0mL의 68wt%_HNO3 및 5.0mL의 30wt%_H2O2를 각각 별도의 50mL 유리 비커에 붓습니다.
   참고: 화학 물질은 미량 금속 불순물이 1.0μg/L(ppb) 미만인 고순도여야 하며, 이상적으로는 ng/L(ppt) 범위여야 합니다. 미량 금속 불순물은 원소 측정의 정확도와 반복성에 영향을 미칩니다.
2. 반응 용기를 흄 후드에 넣고, 커버 뚜껑을 열고, 다음 사양에 따라 1mL 또는 5mL 자동 피펫을 사용하여 아래에 언급된 부피의 68wt%_HNO3 및 30wt%_H2O2를 추가합니다.
   1. 브로콜리, 버섯, 소시지, 국수; 샘플 250mg에 대해 5.0mL 68wt%_HNO3 및 1.0mL 30wt%_H2O2를 추가합니다. 모든 표본에 대해 반복실험 3회를 준비합니다.
   2. 분석법의 정확도(회수율, Rec)를 결정하기 위해 4.2.1단계에 설명된 절차를 사용하고 200μL 자동 피펫을 사용하여 37.5μL의 100mg/L ICP 다원소 표준물질 용액( 재료 표 참조)을 반응 용기에 추가합니다. 모든 표본에 대해 반복실험 3회를 준비합니다.
      참고: 37.5μL의 부피는 샘플의 스파이크되지 않은 용액의 농도와 비교하여 샘플의 스파이크 용액에 대해 15.0μg/L의 증가에 해당하므로 선택되었습니다. 또한, 샘플의 스파이크 용액에 대한 농도 증가는 측정된 모든 분석물에 대해 여전히 선형 농도 범위에 있는 최종 농도에 해당합니다.
   3. 단계 4.2.1에서 식품 샘플의 분해에 사용된 것과 동일한 부피의 68wt%_HNO3 및 30wt%_H2O2를 사용하여 샘플 블랭크를 준비합니다. 샘플 블랭크의 경우 샘플을 반응 용기에 추가하지 마십시오.
      주의 : 소화에 사용되는 HNO₃ 는 부식성이며 연기를 생성합니다. 이러한 이유로 흄 후드에서 산 첨가를 수행해야 합니다. 표준 실험실 보호 장비(장갑, 보안경 및 실험실 가운)를 사용해야 합니다. 산과 접촉한 경우 즉시 해당 부위를 찬물로 헹구고 의사의 도움을 받아야 합니다.
3. 반응 용기에 덮개 뚜껑을 놓고 샘플이 첨가된 68wt%_HNO3 및 30wt%_H2O2와 2-3분 동안 반응하도록 합니다.
4. 용기에 실 덮개를 조이고 덮개 뚜껑을 조입니다.
5. 시료를 화학 물질에 완전히 통합하기 위해 가벼운 손 움직임으로 반응 용기를 흔듭니다.
   알림: 표본이 완전히 소화되지 않을 가능성이 있으므로 반응 용기의 벽이나 뚜껑에 표본을 두지 마십시오.

5. 마이크로파 보조 습식 산 소화

1. 시작 버튼을 눌러 산 분해를 위해 마이크로웨이브 시스템(재료 표 참조)을 켭니다(그림 4).
2. 전자레인지 도어를 열고 랙을 제거하세요.
3. 닫힌 반응 용기를 랙에 대칭으로 분배하여 마이크로파로 시료를 균일하게 조사할 수 있도록 합니다.
4. 랙을 전자레인지 챔버에 삽입하고 홀더에 장착합니다(그림 5).
5. 전자레인지 문을 닫습니다.
6. 펜 모양의 도구를 사용하여 전자레인지 터치 스크린에 적절한 소화 프로그램을 설정합니다. 적절한 온도 구배, 최종 온도 및 분해할 시료 수를 선택합니다. 다양한 식품 샘플에 권장되는 분해 프로그램은 다음과 같습니다.
   1. 브로콜리, 버섯, 소시지, 국수: 160°C로 10분 증가, 200°C로 10분 증가, 200°C에서 15분, 최대 전력 900W.
7. 분해 프로그램을 시작하고 화면에서 반응 조건의 변화를 모니터링합니다. 규정된 프로그램에 따라 온도가 상승하지 않으면 소화 과정을 중지하십시오.
   알림: 소화 중에 전자레인지 화면에 갑작스러운 온도 스파이크가 나타날 수 있습니다. 샘플이 화학 물질과 발열적으로 반응할 때 발생합니다. 마이크로파 시스템은 출력 전력을 조정하여 자동으로 온도를 조절합니다.
8. 마이크로파 보조 분해가 완료되고 샘플의 온도가 낮아질 때까지 기다리십시오.
9. 전자레인지 도어를 열고 전자레인지 챔버에서 랙을 제거합니다. 문을 닫고 악기를 끕니다.
10. 랙에서 반응 용기를 제거하고 실온으로 식을 때까지 기다립니다.
11. 뚜껑 덮개를 수동으로 천천히 열어 산 분해 중에 형성된 가스를 방출합니다. 반응 용기를 흄 후드 방향으로 돌립니다(그림 6).
12. 덮개를 완전히 제거하고 소량의 초순수로 덮개와 반응 용기의 벽을 헹굽니다.
13. 커버와 반응 용기를 초순수로 반복적으로 헹구어 유리 깔때기를 통해 반응 용기의 내용물을 깨끗한 25mL 유리 부피 플라스크로 정량적으로 옮깁니다.
14. 샘플을 부피 플라스크의 표시까지 초순수로 희석합니다. 스토퍼로 부피 플라스크를 닫고 부피 플라스크의 내용물을 혼합합니다.
    참고: 분해된 샘플은 5% 미만의 잔류 산(³⁴)과 2g/L 미만의 용존 원소(총 용존 고형물(³⁵)라고도 함)를 함유해야 하므로 초순수로 추가 희석해야 합니다.
15. 20mL 플라스틱 주사기를 폴리아미드 주사기 필터(직경 25mm, 공극 크기 0.20μm)에 연결합니다. 플라스틱 주사기에 희석된 샘플을 채우고 압력을 가하여 내용물을 50mL 플라스틱 원심분리 튜브로 여과합니다. 교차 오염을 방지하기 위해 모든 샘플에 새로운 플라스틱 주사기 및 주사기 필터를 사용하십시오.
    참고: MAWD 후 분해되지 않은 상태로 남아 있을 수 있는 불용성 물질 또는 고체 입자를 제거하기 위해 샘플을 여과해야 합니다. 이러한 입자는 기기 구성 요소를 막아 원소 측정 측정을 방해할 수 있습니다. 샘플을 필터링할 때 처음 몇 방울은 버려야 합니다. 수용액에는 친수성 필터(폴리아미드로 만든)를 사용하십시오. 소수성 필터(PTFE)는 더 높은 적용 압력을 필요로 하기 때문에 수용액의 여과에 적합하지 않으며, 이는 멤브레인 파열을 초래할 수 있다³⁶.
16. 스크류 캡으로 50mL 플라스틱 원심분리기 튜브를 닫고 측정이 완료될 때까지 샘플을 냉장고에 넣습니다.
    알림: 분해된 샘플은 보존하고 보관 시간을 연장하기 위해 더 낮은 온도의 냉장고에 보관됩니다.

6. 반응 용기 세척

1. 분해된 샘플을 50mL 용량 플라스크로 옮긴 후 5.0mL의 68wt% HNO₃ 및 5.0mL의 초순수를 5mL 자동 피펫과 함께 반응 용기에 추가합니다.
2. 덮개 뚜껑으로 반응 용기를 닫고 랙에 삽입합니다. 랙을 전자레인지 챔버로 옮깁니다.
3. 다음 마이크로파 프로그램을 적용합니다: 160°C로 15분 증가, 180°C로 10분 증가, 최대 전력 900W.
4. 가열 중 반응 조건을 모니터링하십시오. 가열이 완료된 후 반응 용기를 식힌다.
5. 전자레인지를 열고 랙에서 반응 용기를 제거한 다음 흄 후드에서 천천히 엽니다.
6. 반응 용기의 내용물을 플라스틱 폐기물 용기에 버리십시오.
7. 반응 용기를 초순수로 헹구어 과도한 물질이나 화학 물질을 제거합니다.
8. 다음 사용 전에 105°C의 건조기에서 반응 용기를 건조시킵니다.
   알림: 샘플의 산 분해에 사용되는 것과 동일한 마이크로파 절차(시간, 전력, 온도 구배 및 화학 물질의 부피)를 반응 용기 세척에 사용할 수 있습니다. 대안적으로, 반응 용기를 농축된 HNO₃ 또는 HCl에 몇 시간 동안 담그고 초순수로 헹구어 마이크로웨이브 시스템 없이 세척할 수 있습니다.

7. ICP-MS를 사용한 다중 원소 측정

1. 냉장고에서 분해된 샘플이 들어 있는 50mL 플라스틱 원심분리기 튜브를 가져와 실온으로 예열합니다.
2. 샘플을 10배로 희석하여 분해된 샘플의 산 농도를 낮추고 샘플 매트릭스 성분의 농도를 줄입니다. 자동 피펫을 사용하여 샘플 2.50mL를 25mL 유리 용량 플라스크에 옮긴 다음 초순수로 표시선까지 채웁니다.
3. 희석된 시료를 15mL 플라스틱 튜브에 옮기고 자동 시료 주입기의 적절한 위치에 놓습니다.
4. 측정을 위해 ICP-MS 기기( 재료 표 참조)를 준비합니다.
   1. 환기 장치와 ICP-MS에 냉각수를 공급하고 구성 요소를 냉각하는 냉각기를 켭니다.
   2. 호환 가능한 소프트웨어를 사용하여 헹굼 용액(1wt% HNO₃)이 맥동 없이 자동 시료 주입기에서 ICP-MS로 연속적으로 흐르도록 하십시오.
   3. Ar(순도 99.999%) 및 He(순도 99.999%) 가스 실린더를 열어 ICP-MS에 두 가스를 모두 공급합니다. 소프트웨어에서 가스 흐름을 확인하고 필요한 경우 조정하십시오.
      알림: 다원자 이온의 형성으로 인해 스펙트럼 간섭이 예상되는 경우(예: ⁴⁰Ar¹⁶O⁺ 가 ⁵⁶Fe⁺를 방해함)³⁷ He 가스와 충돌 셀을 사용하십시오.
   4. 플라즈마를 시작하고 튜닝 용액을 사용하여 기기를 교정합니다( 재료 표 참조).
   5. 계측기가 교정되면(토치 위치, 게인 전압, 렌즈 전압, 질량/분해능, 펄스/아날로그(P/A) 교정, 데이터베이스(DB) 교정 및 검증)하여 원하는 측정 방법을 선택하고 측정을 수행합니다.
5. 알려지지 않은 샘플로 작업할 때 샘플에 존재하는 원소와 대략적인 농도에 대한 정보를 얻기 위해 반정량적 측정을 수행합니다.
   알림: 검출기는 한 번에 검출할 수 있는 원소의 농도에 한계가 있으므로 반정량 측정을 위해 샘플을 추가로 희석하는 것이 좋습니다. 시료 농도가 낮을수록 기기 구성 요소의 수명이 연장될 수 있습니다.
6. 샘플에 있는 원소의 대략적인 농도에 대한 데이터를 얻은 후 소프트웨어에서 정량적 원소 측정을 위한 방법을 만듭니다. ICP-MS의 작동 조건(표 1)을 선택하고 원하는 원소(이 경우 Cu, Fe, Mn 및 Zn)를 선택합니다. 검량선(분석 곡선 또는 작업 곡선이라고도 함)을 생성하는 데 필요한 표준물질 용액의 수와 농도를 결정합니다(표 1).
   알림: 검량선의 검량점으로 최소 6개의 다른 농도를 준비하십시오.
7. 검량선에 대한 표준 용액을 준비합니다. 자동 피펫을 사용하여 필요한 부피의 100mg/L 다원소 표준물질을 25mL 유리 부피 플라스크에 피펫팅하여 1.0μg/L, 2.5μg/L, 5.0μg/L, 10.0μg/L, 20.0μg/L, 30.0μg/L, 40.0μg/L 및 50.0μg/L 농도의 표준물질 용액을 준비합니다. 플라스크를 1wt% HNO₃로 표시선까지 채웁니다. 또한 1wt% HNO₃ 용액을 사용하여 교정 블랭크를 준비합니다.
8. 준비된 표준물질 및 샘플의 용액을 15mL 플라스틱 튜브에 옮기고 자동 시료 주입기에 넣은 다음 7.4단계에 설명된 절차에 따라 기기를 시작합니다.
9. 검량선 방법론을 사용하여 선택한 요소의 정량적 측정을 수행합니다.
10. 측정이 완료되면 플라즈마를 끄고, Ar 및 He 가스 공급 장치를 닫고, ICP-MS 냉각기를 끄고, 환기 시스템을 끕니다.

균질
모든 샘플은 수분을 제거하기 위해 실험실 건조기로 일정한 덩어리로 건조되었습니다. 샘플을 데시케이터로 옮기면 주변 환경의 수분을 결합하지 않고 실온으로 냉각할 수 있습니다. 그런 다음 식품 샘플을 실험실 믹서를 사용하여 균질화하여 미세한 분말을 얻었습니다. 그 결과 균질화된 입자는 크기가 균일하고 고르게 분포되어 산 분해에 사용되는 하위 샘플(더 큰 샘플에서 추출한 샘플)이 대표성을 갖도록 했습니다. 샘플은 플라스틱 주걱을 사용하여 믹서 비커에서 쉽게 제거할 수 있었지만 지방 함량이 높아 제거하기가 더 어려웠던 건조 육류 샘플은 예외였습니다. 지방 함량이 높을수록 샘플이 믹서 비커의 유리벽에 부분적으로 부착되었습니다. 신선 시료, 건조 시료 및 균질화 시료의 비교는 그림 2에 나와 있습니다.

믹서에 남아 있는 모든 음식물 찌꺼기를 제거하기 위해 기기의 구성 요소를 초순수로 여러 번 세척해야 했습니다.

샘플의 칭량 질량이 반응 용기에서 허용되는 최대값을 초과하지 않도록 하는 것이 중요합니다. 계량은 일정한 온도에서 분석 저울을 사용하여 수행되었으며, 금속 주걱에서 발생할 수 있는 금속 오염을 방지하기 위해 플라스틱 주걱을 사용했습니다.

산 분해
프로토콜에 사용된 모든 샘플은 다양한 양의 탄수화물, 단백질 및 지방을 포함하는 식품 샘플이었습니다. HNO3 는 H2O2 와 함께 이러한 분자의 분해에 적합하며 다른 화학 물질이 필요하지 않습니다. 화학 물질은 HNO3 가 흄을 형성하기 때문에 흄 후드에서 처리되었습니다. TFM-PTFE 반응 용기에 화학 물질을 첨가한 후 반응 용기 상단에 덮개 뚜껑을 장착하고 분석물의 오염 및 손실을 방지하기 위해 잘 밀봉했습니다. 반응 용기는 마이크로파 시스템 내부에서 균일한 마이크로파 조사를 보장하기 위해 랙에 대칭으로 분포되었습니다.

산 분해 중에 마이크로파 시스템의 문이 닫혔고 프로토콜이 끝날 때까지 문을 열 수 없었습니다. 산 분해의 전체 과정을 장치 화면에서 모니터링하여 시간에 따른 온도 변화를 보여줄 수 있습니다(그림 7).

산 분해가 완료되고 소화된 샘플의 용액이 실온으로 냉각된 후, 반응 용기를 흄 후드에서 열었다. 그들은 가능한 한 천천히 열렸습니다. 압력이 너무 빨리 해제되면 반응 혼합물의 작은 액적도 빠져나가 분석물이 손실될 수 있습니다. 반응 용기가 열렸을 때 노란색 또는 노란색-주황색 가스가 방출되었습니다(그림 8). 연기의 착색은 더 높은 온도에서 주황색 연기를 형성하는 NO2에 기인할 수 있습니다. 반응 용기의 압력 증가는 HNO3 로 식품 샘플의 산화로 인해 CO2 , H2O, NO 등과 같은 가스가 형성되었습니다. 반응 용기를 탈기한 후, 분해된 샘플의 담황색 또는 무색 용액이 반응 용기에 남아 MAWD에 의한 총 산 분해가 달성되었음을 나타냅니다. 이것은 용액에 눈에 보이는 입자가 남아 있지 않음으로써 추가로 확인되었습니다.

시료 전처리의 마지막 단계는 분해된 시료를 초순수로 희석하여 잔류 산도(RA)를 낮추는 것이었습니다. RA 값이 높으면 배경 신호가 증가하여 측정을 방해합니다. 희석은 또한 액체 샘플(26) 내의 금속 이온의 농도를 감소시킨다. 분해된 샘플의 용액을 부피 플라스크로 옮길 때, 반응 용기의 성분을 초순수로 완전히 헹구어 분석물을 완전히 옮겼습니다. 발생하는 한 가지 문제는 관심 분석물을 포함할 수 있는 작은 초순수 방울이 반응 용기의 벽에 부착된다는 것입니다. 초순수로 25mL 표시로 희석한 후 모든 샘플이 무색이 되었습니다. 분해된 샘플의 최종 용액에는 수용성 염이 포함되어 있는데, 이는 샘플에 존재하는 금속 원소가 HNO3 와 반응하여 고용해성 질산염을 형성하기 때문입니다. 원소 분석 기술은 수용성 염을 형성하는 금속 이온을 측정할 수 있습니다. 희석된 용액을 여과할 때 입자나 오염 물질이 제거되도록 처음 몇 방울을 버리는 것이 중요합니다. 여과 후 용액을 단단히 밀봉하여 누출을 방지한 다음 냉장고에 보관했습니다.

산 분해 절차의 주요 한계는 시료 처리량입니다. MAWD 시스템은 한 번에 제한된 수의 샘플만 분해할 수 있습니다. 또한 각 분해 및 후속 시료 전처리 단계를 완료하는 데 몇 시간이 걸릴 수 있습니다. 또한 반응 용기 세척도 시간이 많이 걸리지만 샘플 간 교차 오염 위험을 최소화하는 것이 중요합니다.

ICP-MS를 사용한 다중 원소 측정
각 요소에 대해 검량선이 구성되었습니다. 이는 분석물 농도의 함수로 강도를 표시하여 얻었습니다(그림 9). 측정된 모든 원소의 선형 농도 범위는 1.0 μg/L에서 50.0 μg/L 사이였습니다.

모든 요소에 대한 LOD 및 LOQ는 각각 수식 1 및 수식 2를 사용하여 계산되었습니다. 두 방정식 모두에서 s블랭크는 검량 블랭크(10회 반복)38,39의 여러 측정값의 표준 편차를 나타내고, b1은 검량선의 기울기를 나타냅니다.

(1)

(2)

얻어진 LOD는 Mn, Cu, Fe 및 Zn에 대해 각각 0.5ng/L, 2.8ng/L, 2.8ng/L 및 3.2ng/L였습니다. 얻어진 LOQ는 Mn, Cu, Fe 및 Zn에 대해 각각 1.6ng/L, 9.2ng/L, 9.5ng/L 및 10.8ng/L였습니다.

모든 샘플에 대해 6회 반복 분해를 수행했습니다. 표준물질 용액으로 시료를 스파이크하지 않고 모든 시료에 대해 3회 반복 분해를 수행했으며, 전체 방법론의 정확도(스파이크 회수 테스트40) 및 정밀도를 테스트하기 위해 알려진 양의 분석물 표준물질 용액을 추가하여 3회 반복 분해를 수행했습니다. 분해 절차 전 정확도 측정을 위해 37.5μL의 100mg/L ICP 다중 원소 표준물질을 시료가 포함된 반응 용기에 피펫으로 주입한 결과, 10배 희석된 스파이크 시료의 농도가 15.0μg/L로 증가했습니다. 이는 또한 측정된 모든 금속 이온에 대해 샘플 그램당 15.0μg의 증가에 해당합니다. 정확도와 정밀도는 각각 Rec 및 상대 표준 편차(RSD)를 사용하여 결정되었습니다.

분석 방법의 정확도는 스파이크 회복 테스트로 평가할 수 있습니다. 이를 위해, 공지된 양의 분석물 표준물질의 용액이 샘플에 첨가되고, 이어서 스파이크되지 않은 샘플과 동일한 반응 조건 하에서 분해된다(41). Rec는 수학식 3을 사용하여 계산되며, 여기서 γi 는 분해 후 스파이크된 샘플의 측정된 농도이고, γt 는 분석물 표준물질의 첨가된 용액의 증가를 고려하여 스파이크되지 않은 샘플의 측정된 농도를 나타냅니다. γi와 γt 는 세 번의 반복실험의 평균입니다. 분석 방법은 Rec가 80.00%-120.00%42 범위에 있을 때 정확한 것으로 간주됩니다.

(3)

분석 방법의 정밀도는 RSD로 평가됩니다. 여러 반복 측정을 통해 얻은 독립적인 결과 간의 일치도에 대해 설명합니다. RSD는 수학식 4를 사용하여 계산되며, 여기서 sm은 농도 측정을 위한 반복실험 측정값의 표준 편차를 나타내고, 측정된 농도의 평균값을 나타냅니다. 분석 방법은 RSD 값이 20.00%43보다 낮으면 정확한 것으로 간주됩니다.

(4)

모든 샘플은 ICP-MS 측정 전에 초순수로 10배 희석되었습니다(첫 번째 측정 세트의 경우). 희석은 분석기에 도입된 매트릭스 성분의 농도를 감소시켰습니다. 또한, 샘플을 희석함으로써 RA가 감소합니다. RA가 높으면 플라즈마 이온화 효율이 저하되거나 매트릭스 간섭 문제가 발생할 수 있습니다. 첫 번째 측정 세트 후 분석물의 농도가 LOQ보다 낮으면 희석 계수는 10보다 낮아야 합니다. 금속 이온의 정량화는 보정 곡선을 사용하여 수행되었습니다. 계산된 결과의 값은 교정에 사용된 표준물질의 용액과 동일한 정밀도(동일한 유효 숫자 수)를 가져야 합니다. 샘플의 금속 이온 함량은 중량 그램당 μg(μg/g)으로 표시되었습니다. 이는 분석된 샘플의 측정된 질량 농도에 희석 계수를 곱하여 원래 분해된 샘플의 농도를 구함으로써 달성되었습니다. 그런 다음 이 질량 농도에 분해된 샘플의 부피(25mL)를 곱한 다음 균질화된 샘플의 초기 칭량 질량으로 나눴습니다(초기 가중 질량은 MAWD에 대한 반응 용기에 가중된 샘플의 질량임). 모든 값은 반복실험 3회의 평균으로 보고됩니다.

아래 요소의 보고된 내용은 ± sm으로 제공됩니다. 브로콜리 샘플에서 Cu, Mn 및 Zn의 함량은 각각 5.9 ± 0.5 μg/g, 32.5 ± 2.7 μg/g, 및 42.8 ± 0.2 μg/g이었다. 브로콜리 샘플에서 측정된 Fe의 질량 농도가 검량선의 선형 농도 범위의 상한(즉, 50.0μg/L)을 초과했습니다. 따라서, 시료의 용액을 초순수로 2배 희석하고, 이 용액의 ICP-MS 측정을 수행하였다. 그 결과 브로콜리에는 63.0 ± 1.9 μg/g의 Fe가 함유되어 있는 것으로 나타났습니다.

버섯의 경우, Zn, Fe, Cu 및 Mn의 함량은 각각 35.6 ± 1.4 μg/g, 30.4 ± 1.3 μg/g, 18.5 ± 1.0 μg/g, 및 5.4 ± 0.3 μg/g이었다. 소시지는 42.2 ± 0.9 μg/g의 Fe, 25.1 ± 2.6 μg/g의 Zn, 1.0 ± 0.1 μg/g의 Cu를 함유하였다. 10배 희석한 분해 용액의 ICP-MS를 사용한 다중 원소 측정은 Mn의 농도가 선형 농도 범위의 하한(즉, 1.0μg/L)보다 낮다는 것을 보여주었습니다. 따라서, 소시지 샘플의 원래 용액을 5배로 희석하고, ICP-MS를 사용한 다원소 측정을 반복하였다. 소시지 샘플에서 Mn의 함량은 0.9 ± 0.3 μg/g으로 측정되었습니다. 면에는 5.4 ± 2.8 μg/g의 Zn, 10.3 ± 1.2 μg/g의 Fe, 1.6 ± 0.3 μg/g의 Cu, 7.5 ± 0.2 μg/g의 Mn이 함유되어 있습니다.

4개의 샘플 모두에서 측정된 모든 분석물에 대한 Rec는 80.00%-120.00% 범위로 분석 방법의 정확도를 나타냅니다. 계산 결과 RSD 값이 20.00% 미만이었기 때문에 국수 샘플의 Zn에 대한 RSD를 제외하고는 분석 방법이 정확했습니다. 그 결과를 표 2에 보고하였다.

그림 1: 식품 샘플의 균질화에 사용되는 실험실 믹서. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 신선 시료, 건조 시료 및 균질화 시료 비교. (A-D) 브로콜리, 버섯, 소시지, 국수의 신선한 샘플. (E-H) 브로콜리, 버섯, 소시지, 국수의 말린 샘플. (I-L) 브로콜리, 버섯, 소시지 및 국수의 균질화된 샘플. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 분석 저울에서 샘플 칭량. 이것은 상부 플랩을 열어 위에서 수행됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 마이크로웨이브 시스템. 반응 조건을 선택하고 산 분해 과정을 모니터링하기 위한 측면 터치 스크린이 있는 산 분해용 마이크로파 시스템. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 마이크로파 보조 산 분해에 사용되는 구성 요소. (A) 전자레인지 챔버 내부의 산 분해를 위한 14개의 반응 용기가 있는 랙. (B) TFM-PTFE 반응 용기는 3개의 부품으로 구성됩니다. 용기가 뚜껑으로 닫히면 샘플이나 가스가 반응 용기에서 빠져나가거나 들어갈 수 없습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6: 흄 후드에서 열렸을 때의 반응 용기 내부. (A) 연기의 황색-주황색 착색은 산 분해 중에 생성되는 NO2 때문입니다. (B) 대부분의 가스가 반응 용기에서 빠져 나간 후 분해 된 샘플 용액의 노란색 착색. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7: 시간에 따른 온도 변화. MAWD를 사용한 산 분해 중 시간의 함수로 온도 변화를 보여주는 플롯. T2는 반응 용기 내부의 반응 혼합물의 온도를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 8: 황색-주황색 가스가 방출되는 흄 후드 아래의 반응 용기 열기. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 9: Mn에 대한 검량선의 예. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 10: 다중 원소 측정에 사용되는 ICP-MS 기기. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: ICP-MS 기기의 작동 조건. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 2: 브로콜리, 버섯, 소시지, 국수의 Rec 및 RSD 값. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

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