방법 논문

개선된 샘플링 기법 및 조직학적 특성 분석을 통한 전립선 종양 바이오뱅킹 신뢰성 향상

DOI:

10.3791/65635

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2023년 11월 17일

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1Department of Pathology, Hospital Universitario y Politécnico La Fe, 2Department of Urology, Hospital Universitario y Politécnico La Fe, 3Biobanco La Fe, Instituto de Investigación Sanitaria La Fe, 4Department of Medicine, Jaume I University of Castellon, 5Department of Surgery, University of Valencia, 6Department of Pathology, University of Valencia

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 근치적 전립선 절제술 표본에서 샘플 수집을 용이하게 하는 방법을 설명합니다. 목표는 해부병리학적 기준에 따라 표본의 조직 샘플을 Biobank에 저장하기 전에 매핑, 특성화 및 미시적 매크로 절개하는 것입니다.

초록

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신선하고 특성이 잘 규명된 종양 조직 샘플을 획득하는 것은 고품질 "오믹스" 연구를 수행하는 데 매우 중요합니다. 그러나 전립선암(PC)의 경우 이 장기의 고유한 특성과 이 종양과 관련된 높은 이질성으로 인해 특히 어려울 수 있습니다. 다른 한편으로는, 중요한 조직 변화를 일으키지 않고 보관하기 전에 샘플을 조직병리학적으로 특성화하는 것도 흥미로운 도전입니다. 이러한 맥락에서 우리는 해부병리학적 기준에 따라 절제된 전립선 조직을 획득, 매핑, 특성화 및 미세 절제하는 새로운 방법을 제시합니다.

이전에 발표된 프로토콜과 달리 이 방법은 전립선 표본의 구조를 손상시키지 않으면서 전립선 표본의 조직 병리학적 분석에 필요한 시간을 줄여주며, 이는 수술 마진을 평가하는 데 중요합니다. 또한 Gleason 점수, 전구체 병변(고급 전립선 상피내 종양 - PIN) 및 염증성 병변(전립선염)과 같은 병리학적 기준에 의해 정의된 조직학적 종양 영역에 중점을 두고 새로운 전립선 조직 샘플의 묘사 및 미시적 거시적 해부를 가능하게 합니다. 그런 다음 이 샘플은 후속 연구 분석을 위해 바이오뱅크에 저장됩니다.

서론

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전립선암(PC)은 전 세계적으로 남성에서 2번째로 흔한 암이며 5번째 주요 사망 원인입니다1. 환자의 치료 및 예후는 종양의 병기 및 등급(Gleason 점수)에 따라 달라지며, 이는 국소 및 저등급 종양(Gleason 등급 6)의 5년 생존율(99%)이 높은 Gleason 등급 및 전이성 종양(31%)에 비해 더 높다는 사실에서 입증되었습니다2.

PC 국소 재발 및 치료 실패는 이 종양 유형3의 특징적인 높은 유전적 종양 내 이질성과 관련이 있습니다. 또한, PC는 다양한 형태학적, 조직학적, 분자적 특성을 보이는 여러 종양 병소를 가진 다초점 질환으로 간주되며4, 이는 독립적으로 발생하거나 공통 종양 세포 조상에서 유래할 수 있다5. 이전 연구에서는 전이를 촉진하거나 세포 계통을 전립선에 국한시킬 수 있는 특정 유전적 요인에 따라 환자마다 종양 진화가 다르다는 것을 보여주었다5. 따라서 다양한 종양 병소의 분자 특성 분석은 보다 정확한 진단과 예후를 제공하는 것뿐만 아니라 환자를 위한 효과적이고 개인화된 치료를 맞춤화하는 데 매우 중요합니다.

이러한 맥락에서 생물의학 연구 및 통합적 다중 오믹스 접근 방식은 암을 다양한 하위 유형으로 분류하고, 진단 및 예후 바이오마커를 식별하고, 치료 반응과 관련된 마커를 발견할 수 있는 전례 없는 기회를 제공하고 있습니다. 또한, 이러한 접근법은 이 질병의 생물학을 더 잘 이해하는 데 기여한다 6,7. 조직이든 생체액이든 생물학적 시료는 다양한 다중 오믹스 플랫폼(유전체학, 전사체학, 단백질체학, 대사체학 등)을 사용하여 분석하여 암 병태생리학의 기저에 있는 생물학적 특징을 밝혀냄으로써 유전 및 표현형 이질성과 관련된 현재의 한계를 해결할 수 있습니다6. 그러나 오믹스 연구에서 도출된 데이터의 품질은 종양에서 수집된 샘플의 품질, 정확한 특성화, 후속 처리 및 보관에 따라 달라진다는 점을 고려하는 것이 중요하다8.

이러한 맥락에서, 연구를 위해 새로운 PC 조직을 얻는 것은 성공적인 종양 샘플링의 어려움으로 인해 방법론적 도전을 제시한다9. 이전의 방법은 근치적 전립선 절제술 후 무작위 표본 추출을 포함했는데, 결과가 좋지 않았다10. 그러나 최근의 접근법은 자기공명영상(MRI)과 생검 데이터를 기반으로 하는 표적 프로토콜을 통합하여 종양 검체 채취의 효능을 개선했다11.

다른 한편으로는, 중요한 조직 변화 없이 보관하기 전에 샘플의 조직병리학적 특성을 분석하는 것도 흥미로운 도전 과제입니다. 결과적으로, 많은 경우에, 샘플의 조직병리학적 측정은 분석 후에 수행된다(예: HR 1H NMR 대사체 분석)12. 이러한 관행은 불필요한 비용, 시간 소비 및 결국 분석에서 제외되는 상당한 수의 샘플(예: 조직 병리학적 분석 후 종양 샘플이 아닌 것으로 판명된 샘플)의 손실을 수반합니다. 다른 경우에는 분석 전에 샘플의 조직 병리학적 특성 분석이 수행됩니다. 실제로, 일부 선행 연구에서는 근치적 전립선 절제술 검체로부터 유전체학 및 대사체학을 위한 대표적인 고품질 연구 샘플을 제공하는 방법을 표준화하려고 시도하였다 13,14. 그럼에도 불구하고, 검체 채취 효율은 조직을 파괴하는 조직학적으로 이미 확인된 절편(88%)에서 수행할 때 확인되지 않은 절편(45%)에서 수행한 경우보다 훨씬 높습니다1.

여기에서는 이러한 한계를 극복하기 위한 새로운 방법론을 제시하며, 바이오뱅크에 보관하기 전에 신선하고 잘 특성화된 PC 샘플을 얻는 것을 목표로 합니다. 이 방법은 다양한 임상 서비스(비문과, 병리학 및 La Fe Hospital Biobank) 간의 협력 노력을 통해 개발되었습니다. 바이오뱅크는 생물학적 시료의 수집, 처리, 보존 및 보관에 필수적인 역할을 하는 동시에 시료 및 데이터의 고품질을 보장하고 윤리적 및 법적 요구 사항 8,15,16을 준수한다는 점을 강조하는 것이 중요합니다.

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프로토콜

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이 방법은 다양한 임상 서비스(비뇨기과, 병리학 및 La Fe Hospital Biobank)와 관련된 협업 노력을 통해 개발되었습니다. 이 연구는 인간 복지에 대한 제도적, 국가적, 국제적 지침에 따라 수행되었으며, 스페인 발렌시아 La Fe Universitario y Politécnico Hospital Instituto de Investigación Sanitaria Hospital의 생물의학 연구 윤리 위원회의 승인을 받았습니다. 모든 샘플은 La Fe Hospital Biobank(PT13/0010/0026)에 보관되었습니다. 전체 절차는 그림 1에 자세히 설명되어 있습니다.

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그림 1: 전체 절차 체계. 프로토콜 섹션에 설명된 단계별 절차의 개략도입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

1. 종양 표적화

  1. 수술 전에 다중 파라메트릭 또는 바이파라메트릭 자기 공명 영상(mpMRI 또는 bpMRI)17,18을 사용하여 종양의 위치를 찾고 전립선 내 위치를 매핑합니다. MRI에서 얻은 정보를 경직장 초음파 또는 직장 검사의 결과와 결합하여 후자가 불일치하는 결과를 산출하는 경우 결합합니다.
  2. 종양 국소화를 강화하려면 수술 전 초음파 유도 및 MRI 유도 경직장 전립선 생검 결과를 검토하십시오.
    참고: 전립선암 진단 절차에서 생검은 경직장 접근을 통해 전립선에서 직접 채취합니다. 이러한 생검에는 전립선의 체계적인 샘플링(분비샘 전체에 분포된 실린더 포함)과 MRI에서 의심스러운 소견을 직접 대상으로 하는 실린더가 포함됩니다. 이러한 샘플의 회수를 목표로 하기 위해 경직장 초음파가 사용되며, 이는 인지 방식("인지 융합")으로 MRI 결과와 결합되거나 사용 가능한 경우 "실제 MRI-초음파 융합 소프트웨어"와 결합됩니다.

2. 근치적 전립선 절제술과 전립선 채취

  1. Huynh et al.19에 설명된 단계에 따라 경복막 접근법을 통해 표준화된 로봇 보조 근치적 전립선 절제술을 수행합니다.
    1. 복부 접근, 삽입 및 카메라 포트 배치로 시작합니다( 재료 표 참조). 나머지 5개의 포트를 직접 볼 수 있는 곳에 놓습니다. 폐복막을 12mm로 설정합니다.
    2. 복막을 절개하여 방광을 풀어주고 직장 주위 공간을 절개합니다.
    3. 양쪽의 골반 근막을 엽니다.
    4. 전립선과 방광의 전방 및 외측 측면을 완전히 절제합니다.
    5. 방광 경부의 개구를 수행하고 근위 요도를 식별하고 절제하여 전립선과 방광의 후방 측면에 접근할 수 있도록 합니다.
    6. 정낭과 직장 공간 절개19.
    7. 전립선의 측면 측면을 절개하고 신경 혈관 다발을 보존합니다.
    8. 후치골 공간에서 혈관의 지혈을 보장합니다.
    9. 정점을 절개하고 원위 요도를 절제합니다.
    10. 수포 문합을 완료합니다.
    11. 전립선을 적출하고 절개 부위의 봉합을 시행한다19.
  2. 신선한 전립선을 건조한 용기에 담습니다. 샘플 표본을 고정하거나 파라핀으로 삽입하지 않는 것이 중요합니다.
  3. 전립선 전체를 포함하는 신선한 수술 검체를 검체 처리를 위해 Biobank로 운반합니다.

3. 전립선 처리 및 검체 채취

  1. 수술 전 mpMRI, 수술 전 생검 결과 및 직접 전립선 절제술 표본 촉진에서 검색한 종양 위치 정보를 기반으로 샘플링을 위한 표적 전립선 영역을 선택합니다. 환자 식별 데이터, 최종적으로 샘플링된 전립선 영역 및 수집된 샘플 수가 포함된 양식에 이 정보를 기록합니다.
    참고: MRI 소견, 수술 전 생검 결과 및 직접 전립선 절제술 표본 촉진이 일치하면 모든 샘플을 해당 위치 또는 해당 위치(4-6 실린더)로 표적으로 삼습니다. 불일치가 있는 경우 실린더 수를 늘리고 이러한 방법의 영향을 받는 것으로 의심되는 모든 영역을 개별적으로 대상으로 지정합니다.
  2. 일회용 자동 바늘(외과 의사)을 사용하여 선택한 영역에서 원통형 샘플을 검색합니다(1.1단계). 그런 다음 실린더의 외부 영역을 식별(병리학자)하고 조직 집게로 실린더를 고정하고 슬라이드에 놓고 외부 영역을 조직 잉크로 표시합니다. 가져온 모든 실린더에 대해 이 과정을 반복합니다.
  3. 수집된 실린더를 저온 유지 장치 매매 매체로 채워진 샘플 홀더 디스크( 재료 표 참조)에 수평으로 놓고 절단을 위해 마이크로톰 냉각 플래튼으로 옮깁니다.
  4. 플래튼에 놓으면 샘플 홀더 디스크를 샘플 척에 부착하고 다음 단계에 따라 휠을 조심스럽게 움직여 절단합니다.
    1. 최적의 절단 온도 화합물(OCT 화합물, 재료 표 참조)을 사용하여 마이크로톰 저온 유지 장치에 동결 절편하기 전에 조직 샘플을 매립합니다.
    2. 그런 다음 -25°C에서 cryostat-microtome을 사용하여 샘플을 절단합니다. 얇은 원통 모양의 조직 부분(10μm)을 처리된 현미경 슬라이드에 수집합니다. Biobank에 보관할 수 있는 적절한 양의 온전한 종양 조직을 보장하기 위해 몇 미크론의 조직만 수집해야 합니다.
    3. 슬라이드당 2개 또는 3개의 얇은 섹션을 모으고 수동으로 염색하여 최종 착색을 제어합니다. 기술자의 눈은 최적의 염색을 보장하며 필요한 모든 재염색을 수행할 수 있습니다. 다음 단계를 수행합니다
      1. 96% 에탄올로 슬라이드를 고정하고 증류수에 수화한 다음 Harris hematoxylin( 재료 표 참조)으로 1분 동안 염색하여 핵을 염색합니다. 슬라이드를 증류수로 헹구어 과도한 헤마톡실린을 제거합니다.
      2. 슬라이드를 30% 수산화암모늄으로 처리하여 헤마톡실린을 파란색으로 바꿉니다. 증류수를 헹구어 과도한 용액을 제거하십시오.
      3. 30초 동안 에오신( 재료 표 참조)으로 슬라이드를 염색합니다.
      4. 다음으로, 알코올의 적정을 증가시켜 슬라이드를 탈수하고 자일렌(100%)으로 투명하게 한 다음 DPX(가소제인 디스티렌과 자일렌을 대체하는 합성 수지 장착 매체로 사용되는 자일렌의 혼합물, 재료 표 참조)로 장착합니다. 이 단계에서 슬라이드를 Coplin 용액 병에 담그고 제거합니다.
      5. 마지막으로, 염색된 조직 위에 커버슬립을 놓고 현미경으로 볼 수 있도록 적절한 굴절률( 재료 표 참조)이 있는 매체를 사용합니다.

4. 시료 특성화

  1. 광학 현미경(병리학자)으로 샘플을 분석하여 암종 영역을 구별하고 종양의 Gleason 점수를 결정합니다. 이러한 모든 데이터를 문서화하고 슬라이드에 정확한 종양 영역을 표시하십시오.
  2. 이 단계에서 슬라이드에 종양의 정확한 위치와 각각의 Gleason Score20을 레이블을 지정합니다. 또한 형태학적 식별을 기반으로 PIN(Prostatic Intraepithelial Neoplasm)의 위치를 표시합니다.

5. 표본 micro-macro-dissection 및 저장

  1. 슬라이드에 뚜렷한 마커를 사용하여 다양한 조직학적 구성 요소를 명확하게 표시하고(병리학자) 디스크의 동결 조직과 직접 연관시킵니다.
  2. 그런 다음 수술용 칼날을 사용하여 OCT 디스크 내 슬라이드에 표시된 샘플 영역을 매크로 마이크로 절개하여 종양, 종양 주위, PIN 및 정상 전립선 조직으로 나눕니다.
  3. 매립 매체가 해동되기 시작하면 조직을 겸자로 다루고 올바르게 라벨이 부착된 cryotube에 넣습니다.
    참고: cryo slices의 조직학적 진단에 따라 절개된 각 단편을 해당 튜브 내에 조심스럽게 보관하십시오.
  4. 완전히 특성화된 조직학적 샘플과 함께 라벨링된 cryotubes를 -80°C의 Biobank에 보관하여 후속 연구에 사용할 수 있습니다.
    알림: 이 섹션에 설명된 단계는 병리학자의 감독하에 숙련된 기술자가 수행할 수 있습니다. 수술 검체는 조직 및 핵산 분해를 방지하기 위해 가능한 한 빨리 Biobank로 운송해야 합니다. 참조 가이드에 따르면 허혈 시간이 연장되지 않도록 노력해야 합니다(>30분)21. 시료는 시료 품질 원칙이 유지되는 한 Biobank에 무기한 보관할 수 있습니다.

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결과

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그 결과, 이 기법은 연구된 증례의 61%(41례 중 25례)에서 종양 물질을 얻을 수 있게 해주었다는 것을 보여준다(표 1).

표 1: 연구 샘플의 조직병리학적 데이터. 연구에 사용된 샘플에 대한 조직 병리학적 데이터 요약. 진단 실린더는 진단 목적으로 얻은 전립선 생검 샘플을 의미하며, 가공된 실린더는 연구 목적으로 전립선 절제술 샘플에서 얻은 실린더에 해당합니다. ND: 데이터 없음; LL : 왼쪽 소엽; RL: 우측 소엽; TTB: 총 종양 부담. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

이 분석을 위해, 각 소엽의 근치적 전립선 절제술 표본에서 얻은 실린더에서 얻은 종양이 있는 샘플의 수를 ...

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토론

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모든 연구에서 양질의 샘플을 얻는 것은 체계적 편향을 줄이고 신뢰할 수 있는 결과를 얻기 위한 필수 요건입니다22. 따라서 시료가 처리 및 보관되는 온도, 시료 채취에서 보관까지 경과된 시간, 멸균 물질의 사용 또는 방부제 또는 기타 첨가제의 첨가가 시료에 미칠 수 있는 영향과 같은 사전 분석 변수의 제어는 생물학적 시료와 관련된 모든 프로토콜에서 고려되어야 합니다. 이 열쇠뿐만 아니라 샘플의 정확한 식별 및 코드화, 병리학적 특성 분석도 중요합니다. 그렇지 않으면 많은 수의 고품질 샘플이 저장되어 있지만 사용되지 않은 상태로 남아 있을 수 있습니다.

Biobank에 보관하기 전에 종양 및 비종양 샘플의 수집 및 유형화는 PC의 맥락에서 매우 중요하기 때문에 이 프로토콜의 주요 초점입니다. 연구를 위해 새로운 PC 조직을 확보하는 것은 성공적인 종양 샘플링의 어려움으로 인해 방법론적 관점에서 상당히 어려운 과제가 된다

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공개 사항

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저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AL은 "Margarita Salas" 박사후 계약 (번호 21-076) 및 MAM-T는 'Maria Zambrano' 연구 계약(번호 MAZ/2021/03 UP2021-021)을 인정합니다. 두 계약 모두 유럽연합(EU)-차세대 유럽연합(EU)의 자금 지원을 받았다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Cadiere 집게직관적인PN1052082-US 10/2021부품 번호: 471049. 18회 사용.
기존 슬라이드Knittel Glass2021Ground/Frosted end
Cryostat microtomeThermo Fisher Scientific---Criostato CryoStar NX50
CryotubesGreiner Bio-One GmbHRef.: 122280.CRYO S. PP, 나사 캡 포함, 멸균. 
Da Vinci 수술 시스템직관적인PN1052082-US 10/2021XI 모델
해부 기구Bayer---두 개의 핀셋과 수술용 칼날 
DPX 유킷 Medizin- und Labortechnik GmbH6.00.01.0001.06.01.01
EosinAgilent157252
Fenestrated bipolar forcepsIntuitivePN1052082-US 10/2021부품 번호: 471205. 14 lives.
Force bipolarIntuitivePN1052082-US 10/2021부품 번호: 471405. 12 용도.
냉동고Thermo ScientificMODEL 907. -80 º C
HematoxylinAgilent157251
Inmunohistochemistry SlidesAgilent-DakoK802021-2
대형 니들 드라이버직관적인PN1052082-US 10/2021부품 번호: 471006. 15회 사용.
메릴랜드 바이폴라 펜치직관적인PN1052082-US 10/2021부품 번호: 471172. 14회 사용.
현미경Olympus---Olympus cx40
마이크로톰 블레이드PFM Medicala35
단극 곡선 가위직관적인PN1052082-US 10/2021부품 번호: 470179. 10회 사용.
OCT 컴파운드NEG-50LOT.117340
PlusSpeed S 일회용 생검 장치와 베벨 팁Peter Pflugbeil GmbH PSS-1825-S
ProGasp 집게직관적인PN1052082-US 10/2021부품 번호: 471093. 18회 사용.
샘플 홀더 디스크Davidson Cryo Chuck. 브래들리제품30 mm 
티슈 잉크Pelikan2021Ink 4001, brilliant black, (301168)
XylolQuimipurRef. 169
, , ,

참고문헌

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