Preparation and Immunofluorescence Staining of Bundles and Single Fiber Cells from the Cortex and Nucleus of the Eye Lens(눈 수정체의 피질과 핵에서 다발 및 단일 섬유 세포의 준비 및 면역형광 염색)

요약

이 프로토콜은 복잡한 세포 간 간지화 및 막 구조를 연구하기 위해 면역형광 염색을 위해 말초, 성숙 및 핵 수정체 섬유 세포를 준비하는 방법을 설명합니다.

초록

수정체는 눈의 전방에 있는 투명한 타원체 기관으로, 모양을 바꾸어 빛을 망막에 미세하게 집중시켜 선명한 이미지를 형성합니다. 이 조직의 대부분은 육각형 단면을 가지고 수정체의 전방에서 후방까지 뻗어 있는 전문적이고 분화된 섬유 세포로 구성되어 있습니다. 이 길고 가느다란 세포는 이웃 세포와 밀접하게 대립하며 세포의 길이를 따라 복잡한 간지(interdigitation)를 가지고 있습니다. 특수 연동 구조는 렌즈의 일반적인 생체역학적 특성에 필요하며 전자 현미경 기술을 사용하여 광범위하게 설명되었습니다. 이 프로토콜은 생쥐 렌즈 섬유 세포의 단수 및 다발을 보존하고 면역염색하여 복잡한 모양의 세포 내에서 단백질의 상세한 국소화를 가능하게 하는 첫 번째 방법을 보여줍니다. 대표적인 데이터는 수정체의 모든 영역에 걸쳐 말초, 분화, 성숙 및 핵 섬유 세포의 염색을 보여줍니다. 이 방법은 잠재적으로 다른 종의 렌즈로부터 분리된 섬유 세포에 사용될 수 있습니다.

서론

수정체는 눈의 전방에 있는 투명하고 난형적인 조직으로, 상피 세포와 섬유 세포의 두 가지 세포 유형으로 구성되어^{있습니다 1}(그림 1). 수정체의 전방 반구를 덮고 있는 상피 세포의 단층이 있습니다. 섬유 세포는 상피 세포와 분화되어 수정체의 대부분을 구성합니다. 고도로 전문화된 섬유 세포는 수정체 주변부에서 수정체 중심까지 세포막 형태의 뚜렷한 변화를 특징으로 하는 신장, 분화 및 성숙 프로그래밍을 거칩니다 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12

프로토콜

생쥐는 인디애나 대학교 블루밍턴(Indiana University Bloomington)의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)에서 승인한 동물 프로토콜에 따라 관리되었습니다. 대표 데이터를 생성하는데 사용된 마우스는 C57BL6/J 배경의 대조군(야생형) 동물, 암컷, 생후 8-12주였다. 수컷과 암컷 쥐 모두 이 실험에 사용할 수 있는데, 이는 생쥐의 성별이 실험 결과에 영향을 미칠 가능성이 매우 낮기 때문이다.

1. 렌즈 해부 및 디캡슐레이션

1. 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 "실험실 동물의 관리 및 사용 가이드(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)"와 해당 기관에서 승인한 동물 사용 프로토콜에 따라 쥐를 안락사시킵니다.
   참고: 본 연구에서 마우스는 승인된 동물 프로토콜(인디애나 대학교)에 따라 CO₂ 과다 투여 후 자궁경부 탈구에 의해 안락사되었습니다.
2. 곡선형 집게를 사용하여 눈의 한쪽 면으로 눈 주위 조직을 눌러 눈을 소켓 밖으로 빼내어 쥐의 눈을 적출시킵니다. 그런 다음 눈 밑에....

결과

수정체 섬유 세포는 수정체 피질(섬유와 성숙한 섬유를 분화)과 핵에서 제조되며, 세포는 F-액틴의 경우 팔로이딘으로, 세포막의 경우 WGA로 염색됩니다. 세포 다발 또는 단일 렌즈 섬유의 혼합물(그림 3)을 관찰하고 이미지화합니다. 수정체 피질에서 두 가지 유형의 세포가 발견됩니다(그림 3A). 수정체 주변부의 분화 섬유 세포는 직선이며 짧은 면을 따라 매우 작은 돌출부가 있습니다. 세포가 분화함에 따라 섬유 세포는 작은 맞물리는 돌출부로 물결 모양이 됩니다. 또한, 성숙 과정을 따라 섬유 세포는 작은 맞물리는 돌출부로 장식된 큰 패들을 발달시킵니다. 수정체핵은 마우스 렌즈에서 매우 작고 단단하며, 핵렌즈 섬유의 고정 및 염색 전에 부드러운 수정체 피 질을 기계적으로 제거하여 분리됩니다. 수정체핵에서 직경이 더 작고 저배율 이미지에서는 쉽게 볼 수 없는 미세한 막 구조를 가진 수정체 섬유 다발이 발견됩니다........

토론

이 프로토콜은 렌즈의 다양한 깊이에서 번들 또는 단일 렌즈 섬유 세포의 3D 멤브레인 형태를 충실하게 보존하는 고정, 보존 및 면역염색 방법을 입증했습니다. 염색된 렌즈 섬유는 렌즈 섬유 세포 형태를 연구하는 데 오랫동안 사용되어 온 SEM 제제와 비교됩니다. 결과는 두 제제 간의 유사한 멤브레인 구조를 보여줍니다. EM은 세포 형태 연구의 황금 표준으로 남아 있지만, 단백질^33,34,35의 국소화를 위한 SEM 샘플에서 면역 표지는 더 까다로우며 이미지를 이미지화하려면 전자 현미경이 필요합니다. 이 면역염색 방법의 장점은 여러 표적을 한 번에 라벨링할 수 있고 컨포칼 현미경에서 이미지를 수집할 수 있다는 것입니다.

이 방법은 복잡한 세포 형태를 보존하지만 SEM은 유전적 돌연변이, 노화, 약물 치료 등으로 인해 .......

재료

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이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
100% Triton X-100	FisherScientific	BP151-500
60mm 플레이트	FisherScientific	FB0875713A
16% 파라포름알데히드	Electron Microscopy Sciences	15710
10X 인산염 완충 염수	ThermoFisher	70011-044
1X 인산염 완충 염수	ThermoFisher	14190136
48웰 플레이트	CytoOne	CC7672-7548
커버 슬립 (22 x 40 mm)	FisherScientific	12-553-467
곡선 핀셋	World Precision Instruments	501981
해부 현미경	Carl Zeiss	Stereo Discovery V8
미세 팁 직선 핀셋	Electron Microscopy Sciences	72707-01
Fisherbrand Superfrost Plus 현미경 슬라이드	FisherScientific	12-550-15
LSM 800 공초점 현미경 with Airyscan (63X) 및 Zen 3.5 소프트웨어	Carl Zeiss
매니큐어
정상 당나귀 혈청	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
Phalloidin (로다민)	ThermoFisher	R415
일차 항체
Scalpel Feather 일회용, 멸균, No. 11	VWR	76241-186
이차 항체
직선 포셉	World Precision Instruments	11252-40
Thermo Scientific Nunc MicroWell MiniTrays (해부 트레이)	FisherScientific	12-565-154
초 미세 가위	World Precision Instruments	501778
VECTASHIELD Antifade 실험용 마운팅 미디어 with DAPI	Vector Laboratories	H-1200
밀 배아 응집인자 (플루오레세인)	Vector Laboratories	FL-1021-5

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