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방법 논문

Preparation and Immunofluorescence Staining of Bundles and Single Fiber Cells from the Cortex and Nucleus of the Eye Lens(눈 수정체의 피질과 핵에서 다발 및 단일 섬유 세포의 준비 및 면역형광 염색)

3.1K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/65638

⸱

2023년 6월 9일

 , 
1School of Optometry and Vision Science Program, Indiana University

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 복잡한 세포 간 간지화 및 막 구조를 연구하기 위해 면역형광 염색을 위해 말초, 성숙 및 핵 수정체 섬유 세포를 준비하는 방법을 설명합니다.

초록

수정체는 눈의 전방에 있는 투명한 타원체 기관으로, 모양을 바꾸어 빛을 망막에 미세하게 집중시켜 선명한 이미지를 형성합니다. 이 조직의 대부분은 육각형 단면을 가지고 수정체의 전방에서 후방까지 뻗어 있는 전문적이고 분화된 섬유 세포로 구성되어 있습니다. 이 길고 가느다란 세포는 이웃 세포와 밀접하게 대립하며 세포의 길이를 따라 복잡한 간지(interdigitation)를 가지고 있습니다. 특수 연동 구조는 렌즈의 일반적인 생체역학적 특성에 필요하며 전자 현미경 기술을 사용하여 광범위하게 설명되었습니다. 이 프로토콜은 생쥐 렌즈 섬유 세포의 단수 및 다발을 보존하고 면역염색하여 복잡한 모양의 세포 내에서 단백질의 상세한 국소화를 가능하게 하는 첫 번째 방법을 보여줍니다. 대표적인 데이터는 수정체의 모든 영역에 걸쳐 말초, 분화, 성숙 및 핵 섬유 세포의 염색을 보여줍니다. 이 방법은 잠재적으로 다른 종의 렌즈로부터 분리된 섬유 세포에 사용될 수 있습니다.

서론

수정체는 눈의 전방에 있는 투명하고 난형적인 조직으로, 상피 세포와 섬유 세포의 두 가지 세포 유형으로 구성되어있습니다 1(그림 1). 수정체의 전방 반구를 덮고 있는 상피 세포의 단층이 있습니다. 섬유 세포는 상피 세포와 분화되어 수정체의 대부분을 구성합니다. 고도로 전문화된 섬유 세포는 수정체 주변부에서 수정체 중심까지 세포막 형태의 뚜렷한 변화를 특징으로 하는 신장, 분화 및 성숙 프로그래밍을 거칩니다 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 , 수정체 핵이라고도 합니다. 다양한 거리에서 망막으로 들어오는 빛의 초점을 미세하게 맞추는 수정체의 기능은 강성 및 탄성 13,14,15,16,17,18,19를 포함한 생체역학적 특성에 따라 달라집니다. 렌즈 섬유의 복잡한 interdigitations는 가설을 세웠으며20,21 최근에는 렌즈 강성(lens stiffness)22,23에 중요한 것으로 나타났습니다.

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그림 1: 렌즈 해부학적 구조와 렌즈 섬유의 대표적인 주사전자현미경(SEM) 이미지. 이 만화는 상피 세포의 전방 단층(하늘색으로 음영 처리)과 수정체 섬유 세포의 벌크 덩어리(흰색)의 세로(위에서 아래로) 전방 단층을 보여줍니다. 수정체의 중앙(분홍색으로 음영 처리)은 핵으로 알려져 있으며 고도로 압축된 섬유 세포로 구성되어 있습니다. 오른쪽에는 단면 만화가 벌집 패턴으로 포장된 렌즈 섬유의 길쭉한 육각형 세포 모양을 보여줍니다. 섬유 전지에는 2개의 넓은 면과 4개의 짧은 면이 있습니다. 하단의 대표적인 SEM 이미지는 렌즈의 서로 다른 깊이에 있는 렌즈 섬유 셀 사이의 복잡한 막 삽입을 보여줍니다. 오른쪽부터 렌즈 주변부에 새로 형성된 렌즈 섬유는 짧은 면을 따라 작은 돌출부가 있고 넓은 면을 따라 볼과 소켓이 있습니다(빨간색 상자). 성숙하는 동안 렌즈 섬유는 짧은 면을 따라 작은 돌출부(파란색 상자)로 장식된 큰 패들 도메인을 발달시킵니다. 성숙한 섬유 세포는 작은 돌출부로 묘사된 큰 패들 도메인을 가지고 있습니다. 이러한 연동 영역은 렌즈의 생체역학적 특성에 중요합니다. 수정체핵의 섬유세포는 짧은 면을 따라 작은 돌출부가 적고 복잡한 혀와 홈이 있는 인터디지테이션(보라색 상자)이 있습니다. 세포의 넓은 면은 구형막 형태를 나타냅니다. 만화는22,32에서 수정되었으며 축척에 맞게 그려지지 않았습니다. 스케일 바 = 3 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

수정체는 이전 세대의 섬유24,25 위에 겹쳐진 새로운 섬유 세포의 껍질을 추가하여 성장합니다. 섬유 전지는 길쭉한 육각형 단면 모양으로 2개의 넓은 면과 4개의 짧은 면이 있습니다. 이 세포는 수정체의 전방에서 후극까지 뻗어 있으며, 종에 따라 수정체 섬유의 길이는 수 밀리미터에 달할 수 있습니다. 이러한 길고 가느다란 세포의 구조를 지원하기 위해 넓은 면과 짧은 면을 따라 특수한 간지(interdigitation)가 맞물리는 구조를 만들어 수정체 모양과 생체역학적 특성을 유지합니다. 섬유 세포 분화 및 성숙 중 세포막 모양의 변화는 전자 현미경 (EM) 연구 2,3,4,5,6,7,8,9,10,20,26,27,28,29에 의해 광범위하게 문서화되었습니다 . 새로 형성된 섬유 세포는 넓은 면을 따라 볼과 소켓이 있고 짧은 면을 따라 매우 작은 돌출부가 있는 반면, 성숙한 섬유는 짧은 면을 따라 맞물리는 돌출부와 패들이 있습니다. 핵 섬유는 혀와 홈의 간지(tongue-and-groove interdigitations)와 구상막 형태(globular membrane morphology)를 나타낸다. 이러한 복잡한 맞물리는 막에 필요한 단백질에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 섬유 세포의 단백질 국소화에 대한 이전 연구는 복잡한 세포 구조를 명확하게 시각화할 수 없는 렌즈 조직 절편에 의존했습니다.

이 연구는 복잡한 형태를 보존하고 세포막과 세포질 내에서 단백질에 대한 면역염색을 허용하기 위해 수정체 섬유 세포의 단일 및 다발을 고정하는 새로운 방법을 만들고 완성했습니다. 이 방법은 EM 연구의 데이터와 비교할 수 있는 세포막 구조를 충실하게 보존하고 특정 단백질에 대한 1차 항체로 염색할 수 있습니다. 우리는 이전에 분화 및 성숙을 겪는 면역 염색 된 피질 수정체 섬유를 가지고 있습니다22,23. 이 프로토콜에는 수정체 핵에서 섬유 세포를 염색하는 새로운 방법도 있습니다. 이 프로토콜은 섬유 세포 성숙 및 수정체 핵 압축 중 막 삽입의 형성 및 변화를 위한 메커니즘을 이해할 수 있는 문을 열어줍니다.

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프로토콜

생쥐는 인디애나 대학교 블루밍턴(Indiana University Bloomington)의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)에서 승인한 동물 프로토콜에 따라 관리되었습니다. 대표 데이터를 생성하는데 사용된 마우스는 C57BL6/J 배경의 대조군(야생형) 동물, 암컷, 생후 8-12주였다. 수컷과 암컷 쥐 모두 이 실험에 사용할 수 있는데, 이는 생쥐의 성별이 실험 결과에 영향을 미칠 가능성이 매우 낮기 때문이다.

1. 렌즈 해부 및 디캡슐레이션

  1. 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 "실험실 동물의 관리 및 사용 가이드(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)"와 해당 기관에서 승인한 동물 사용 프로토콜에 따라 쥐를 안락사시킵니다.
    참고: 본 연구에서 마우스는 승인된 동물 프로토콜(인디애나 대학교)에 따라 CO2 과다 투여 후 자궁경부 탈구에 의해 안락사되었습니다.
  2. 곡선형 집게를 사용하여 눈의 한쪽 면으로 눈 주위 조직을 눌러 눈을 소켓 밖으로 빼내어 쥐의 눈을 적출시킵니다. 그런 다음 눈 밑에 있는 집게를 닫고 들어 올려 소켓에서 눈을 제거합니다. 눈을 해부 트레이에 있는 신선한 1x 인산염 완충 식염수(PBS)로 옮깁니다.
  3. 초극세 가위로 시신경을 안구에 최대한 가깝게 자릅니다. 끝이 가늘고 곧은 핀셋을 눈 뒤쪽에 있는 시신경의 출구를 통해 안구에 조심스럽게 삽입합니다.
  4. 1.3단계에서 핀셋과 같은 위치에 가위를 조심스럽게 삽입하고 후방에서 각막-공막 접합부를 향해 절개를 시작합니다.
    알림: 설치류 렌즈는 눈의 ~30%를 차지합니다. 핀셋이나 가위를 눈에 너무 깊숙이 삽입하면 우발적인 손상이 발생합니다.
  5. 접합부의 절반 이상이 분리될 때까지 각막-공막 접합부를 따라 계속 절단합니다.
  6. 핀셋을 사용하여 각막을 부드럽게 눌러 수정체가 1.4단계와 1.5단계로 만든 절개를 통해 나올 수 있도록 합니다.
  7. 끝이 가는 직선 핀셋을 사용하여 렌즈에서 큰 조직 조각을 조심스럽게 제거합니다. 렌즈를 검사하여 적도 지역을 찾으십시오.
  8. 끝이 가는 직선 핀셋을 사용하여 렌즈를 얕게 뚫은 다음 렌즈 캡슐을 제거합니다. 수정체 섬유 세포의 질량은 그대로 유지되고 수정체 상피 단층은 수정체 캡슐에 부착된 상태로 유지됩니다. 렌즈 캡슐을 폐기하십시오.

2. 렌즈 단일 섬유 세포 염색

  1. 렌즈 섬유 세포 덩어리를 500μL의 갓 만든 1% 파라포름알데히드(PFA, 1x PBS) 용액이 있는 웰 플레이트에 옮기고 부드러운 너트레이션으로 4°C에서 밤새 샘플을 배양합니다(그림 2A).
    참고: 주어진 용액의 부피는 48웰 플레이트에 최적화되어 있습니다. 다른 크기의 웰 플레이트 또는 튜브를 사용하는 경우 그에 따라 용액의 부피를 조정하십시오. 고정, 차단 및 세척(1x PBS에서 1x PTX, 0.1% Triton X-100) 용액을 10x PBS와 이중 증류수(ddH2O)로 최종 농도 1x PBS로 만들었습니다.
  2. 렌즈 섬유 셀을 PFA가 1%인 60mm 접시에 옮깁니다. 날카로운 메스를 사용하여 전방 후방 축을 따라 섬유 세포 공을 반으로 나눕니다(그림 2B). 같은 축을 따라 반을 다시 반으로 잘라 4등분합니다.
    참고: 전방-후방 축은 조직 덩어리에서 섬유 세포의 방향에 의해 쉽게 인식됩니다.
  3. 직선 핀셋을 사용하여 렌즈 fiber cell quarters에서 핵 영역을 제거합니다(그림 2C).
    참고: 설치류 렌즈에서 수정체 핵 영역은 단단하며 수정체의 중심은 부드러운 피질 섬유에서 쉽게 분리됩니다.
  4. 수정체 피질 영역의 4분의 1을 실온(RT)에서 15분 동안 1% PFA 200μL로 부드럽게 흔듭니다(플레이트 셰이커에서 300rpm).
  5. 750μL의 1x PBS에서 각각 5분 동안 RT에서 부드럽게 흔들면서 조직 4분의 2를 두 번 세척합니다.
  6. 200μL의 차단 용액(5% 혈청, 0.3% Triton X-100, 1x PBS)을 사용하여 RT에서 1시간 동안 부드럽게 흔들면서 샘플을 차단합니다.
    참고: 이 프로토콜의 대표 데이터의 경우, 샘플은 1차 또는 2차 항체로 염색되지 않았습니다. 블로킹 단계 후, 샘플을 밀 배아 응집체(WGA; 1:100) 및 팔로이딘(1:100)(재료 표 참조)으로 RT에서 3시간 동안 부드럽게 흔들고 빛으로부터 보호하면서 배양했습니다. 1차 항체 염색은 이전 간행물22,23에서 입증되었습니다.
  7. 100 μL의 1차 항체 용액을 4°C에서 밤새 부드럽게 흔들어 배양합니다.
    참고: 항체는 차단 용액에 희석됩니다. 조직 절편이 있는 슬라이드와 비교할 때 이러한 유형의 준비에는 더 많은 세포가 있습니다. 더 많은 세포를 염색할 수 있는 충분한 항체를 제공하기 위해 1차 항체 농도를 높여야 합니다. 조직 절편에 사용되는 항체 농도를 두 배로 늘리는 것이 좋습니다. 2차 항체도 마찬가지다.
  8. 1x PTX(0.1% Triton X-100, 1x PBS)로 RT에서 각각 5분 동안 부드럽게 흔들면서 티슈 쿼터를 세 번 세척합니다.
  9. 섬유 세포를 100μL의 2차 항체/염료 용액으로 실온에서 3시간 동안 부드럽게 흔들어 배양합니다. 이 단계와 후속 단계에서 빛을 차단하십시오.
    참고: WGA, 팔로이딘 및 기타 형광 염료를 2차 항체 용액에 첨가하여 세포막, 세포골격 또는 기타 세포 기관을 동시에 라벨링하는 동시에 1차 항체를 라벨링할 수 있습니다.
  10. 섬유 셀을 1x PTX로 RT에서 각각 5분 동안 부드럽게 흔들면서 4번 세척합니다.
  11. 조직 쿼터를 슬라이드로 옮기기 전에 플러스 충전 현미경 슬라이드에 한 방울 또는 50μL의 장착 매체를 추가합니다.
  12. 핀셋을 사용하여 섬유 세포를 서로 부드럽게 분리하고 세포 다발의 겹침을 제한하십시오.
  13. 마운팅 미디어의 샘플 위에 #1.5 커버슬립을 부드럽게 적용합니다. 장착 미디어는 커버슬립의 가장자리까지 퍼져야 합니다. 이것이 발생하지 않으면 커버슬립의 가장자리에 추가 장착 미디어를 추가하십시오. 커버슬립 가장자리 주위에 있는 과도한 장착 매체를 흡입하고 매니큐어를 사용하여 슬라이드의 커버슬립 가장자리를 밀봉합니다.
    참고: 컨포칼 현미경 검사용으로 제조된 모든 유형의 장착 매체를 이러한 실험에 사용할 수 있습니다.

3. 수정체 핵 단일 섬유 세포 염색

  1. 섹션 1에 설명된 해부를 완료합니다.
  2. 수정체 섬유 세포의 볼에서 피질 섬유를 기계적으로 제거하고, 수정체핵을 남겨두고, 섬유 세포 덩어리를 젖은 장갑을 낀 손가락 끝으로 부드럽게 옮기고 조직 덩어리를 부드럽게 굴립니다.
    참고: 마우스 렌즈에서 장갑을 낀 손가락 끝 사이로 수정체 섬유 세포의 볼을 굴리는 것은 경질 수정체 핵(28,30)에서 피질 섬유 세포를 제거하는 효과적인 방법입니다. 이러한 기계적 방법이 효과적이지 않은 렌즈의 경우, 피질 섬유 세포를 제거하기 위해 신중한 해부 또는 와류 방법(29)이 사용될 수 있다.
  3. 렌즈 핵을 웰 플레이트에서 갓 만든 1% PFA 용액에 옮기고 부드럽게 흔들면서 4°C에서 밤새 배양합니다.
  4. 샘플을 PFA 1%가 함유된 60mm 접시에 옮기고 날카로운 메스를 사용하여 전방 후방 축을 따라 수정체 핵을 분할합니다. 조직 샘플을 다시 반으로 줄여 핵 분기를 생성합니다.
  5. 2.4-2.13 단계에 설명된 과정을 따라 면역염색 및 검체 장착을 수행합니다.

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그림 2: 렌즈 섬유 세포의 준비 및 면역염색을 자세히 설명하는 그래픽 요약 . (A) 이 48웰 플레이트는 설명된 방법에 대한 샘플 플레이트 설정을 보여주기 위해 컬럼별로 색상으로 구분되어 있으며, 겸자를 사용하여 부드럽게 취급하여 다양한 면역염색 단계 간에 샘플을 쉽게 이동할 수 있습니다. 이 프로토콜의 대표 데이터는 1차 항체로 배양되지 않지만, 다이어그램에는 1차 항체 배양을 위한 컬럼이 포함되어 있으며, 세척용 웰은 흡인에 의해 사용된 세척 완충액을 제거한 후 재사용할 수 있습니다. (B) 수정체 섬유 세포 덩어리를 고정한 후 세포의 원래 구조를 보존하기 위해 전후 축(빨간색 점선)을 따라 조직을 분할합니다. 조직 덩어리가 반으로 줄어들면 샘플이 회전하고 반쪽이 전방 후방 축(빨간색 점선)을 따라 4등분으로 나뉩니다. (C) 수정체 핵 영역(분홍색)을 제거하는 것은 핀셋을 사용하여 피질 섬유 세포(파란색)에서 조밀한 중앙 조직을 파내는 데 쉽게 수행됩니다. 카툰 다이어그램은 부분적으로 BioRender.com 를 사용하여 만들어졌으며 축척에 맞게 그려지지 않았습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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결과

수정체 섬유 세포는 수정체 피질(섬유와 성숙한 섬유를 분화)과 핵에서 제조되며, 세포는 F-액틴의 경우 팔로이딘으로, 세포막의 경우 WGA로 염색됩니다. 세포 다발 또는 단일 렌즈 섬유의 혼합물(그림 3)을 관찰하고 이미지화합니다. 수정체 피질에서 두 가지 유형의 세포가 발견됩니다(그림 3A). 수정체 주변부의 분화 섬유 세포는 직선이며 짧은 면을 따라 매우 작은 돌출부가 있습니다. 세포가 분화함에 따라 섬유 세포는 작은 맞물리는 돌출부로 물결 모양이 됩니다. 또한, 성숙 과정을 따라 섬유 세포는 작은 맞물리는 돌출부로 장식된 큰 패들을 발달시킵니다. 수정체핵은 마우스 렌즈에서 매우 작고 단단하며, 핵렌즈 섬유의 고정 및 염색 전에 부드러운 수정체 피 질을 기계적으로 제거하여 분리됩니다. 수정체핵에서 직경이 더 작고 저배율 이미지에서는 쉽게 볼 수 없는 미세한 막 구조를 가진 수정체 섬유 다발이 발견됩니다....

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토론

이 프로토콜은 렌즈의 다양한 깊이에서 번들 또는 단일 렌즈 섬유 세포의 3D 멤브레인 형태를 충실하게 보존하는 고정, 보존 및 면역염색 방법을 입증했습니다. 염색된 렌즈 섬유는 렌즈 섬유 세포 형태를 연구하는 데 오랫동안 사용되어 온 SEM 제제와 비교됩니다. 결과는 두 제제 간의 유사한 멤브레인 구조를 보여줍니다. EM은 세포 형태 연구의 황금 표준으로 남아 있지만, 단백질33,34,35의 국소화를 위한 SEM 샘플에서 면역 표지는 더 까다로우며 이미지를 이미지화하려면 전자 현미경이 필요합니다. 이 면역염색 방법의 장점은 여러 표적을 한 번에 라벨링할 수 있고 컨포칼 현미경에서 이미지를 수집할 수 있다는 것입니다.

이 방법은 복잡한 세포 형태를 보존하지만 SEM은 유전적 돌연변이, 노화, 약물 치료 등으로 인해 ...

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 미국 국립안과연구소(National Eye Institute)의 보조금 R01 EY032056(to CC)의 지원을 받았습니다. 저자들은 전자 현미경 이미지에 도움을 준 Scripps Research Core Microscopy Facility의 Theresa Fassel 박사와 Kimberly Vanderpool 박사에게 감사를 표합니다.

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재료

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이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
100% Triton X-100FisherScientificBP151-500
60mm 플레이트FisherScientificFB0875713A
16% 파라포름알데히드Electron Microscopy Sciences15710
10X 인산염 완충 염수ThermoFisher70011-044
1X 인산염 완충 염수ThermoFisher14190136
48웰 플레이트CytoOneCC7672-7548
커버 슬립 (22 x 40 mm)FisherScientific12-553-467
곡선 핀셋World Precision Instruments501981
해부 현미경Carl ZeissStereo Discovery V8
미세 팁 직선 핀셋Electron Microscopy Sciences72707-01
Fisherbrand Superfrost Plus 현미경 슬라이드FisherScientific12-550-15
LSM 800 공초점 현미경 with Airyscan (63X) 및 Zen 3.5 소프트웨어Carl Zeiss
매니큐어
정상 당나귀 혈청Jackson ImmunoResearch017-000-121
Phalloidin (로다민)ThermoFisherR415
일차 항체
Scalpel Feather 일회용, 멸균, No. 11VWR76241-186
이차 항체
직선 포셉World Precision Instruments11252-40
Thermo Scientific Nunc MicroWell MiniTrays (해부 트레이)FisherScientific12-565-154
초 미세 가위World Precision Instruments501778
VECTASHIELD Antifade 실험용 마운팅 미디어 with DAPIVector LaboratoriesH-1200
밀 배아 응집인자 (플루오레세인)Vector LaboratoriesFL-1021-5
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참고문헌

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Preparation and Immunofluorescence Staining of Bundles and Single Fiber Cells from the Cortex and Nucleus of the Eye Lens(눈 수정체의 피질과 핵에서 다발 및 단일 섬유 세포의 준비 및 면역형광 염색)
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