방법 논문

신경교종 줄기세포주에서 스페로이드 약물 감수성 스크리닝

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DOI:

10.3791/65655

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2024년 2월 2일

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1Division of Oncology, Children’s Hospital of Philadelphia, 2Department of Pediatrics, Perelman School of Medicine at the University of Pennsylvania, 3School of Medicine, University of Pennsylvania

이 논문에서

요약

체외 약물 감수성 검사는 항암 약물 조합을 발견하기 위한 중요한 도구입니다. 구체에서 성장한 세포는 서로 다른 신호 경로를 활성화하며 단층 세포주보다 in vivo 모델을 더 잘 대표하는 것으로 간주됩니다. 이 프로토콜은 스페로이드 라인에 대한 체외 약물 스크리닝 방법을 설명합니다.

초록

체외 약물 감수성 검사는 항암 약물 조합 요법을 발견하는 데 중요한 도구입니다. 일반적으로 이러한 체외 약물 스크리닝은 단층에서 성장한 세포에 대해 수행됩니다. 그러나 이러한 2차원(2D) 모델은 3차원(3D) 스페로이드 세포 모델에 비해 정확도가 떨어지는 것으로 간주됩니다. 이는 특히 신경교종 줄기세포주에 해당됩니다. 구체에서 성장한 세포는 서로 다른 신호 경로를 활성화하며 단층 세포주보다 in vivo 모델을 더 잘 대표하는 것으로 간주됩니다. 이 프로토콜은 스페로이드 라인의 체외 약물 스크리닝 방법을 설명합니다. 마우스 및 인간 신경교종 줄기세포주가 예로 사용됩니다. 이 프로토콜은 약물 또는 약물 조합이 세포 사멸을 유도하는지 여부와 두 약물이 시너지를 유발하는지 확인하는 데 사용할 수 있는 3D 스페로이드 약물 민감도 및 시너지 분석을 설명합니다. 신경교종 줄기세포주는 RFP를 발현하도록 변형됩니다. 세포는 낮은 부착 원형 웰 바닥 96 플레이트에 도금되며 구체는 하룻밤 동안 형성 될 수 있습니다. 약물을 첨가하고 조직 배양 인큐베이터에 내장된 형광 현미경인 Incucyte 라이브 이미징 시스템을 사용하여 시간 경과에 따른 RFP 신호를 측정하여 성장을 모니터링합니다. 이후 약물 단독 또는 조합 약물에 대한 민감도를 평가하기 위해 절반 최대 억제 농도(IC50), 치사량 중앙값(LD50) 및 시너지 점수를 계산합니다. 이 분석법의 3차원 특성은 생체 내에서 종양 성장, 행동 및 약물 민감성을 보다 정확하게 반영하여 추가 전임상 조사의 기초를 형성합니다.

서론

교모세포종은 5년 전체 생존율이 5%인 파괴적인 고등급 뇌 신생물입니다1. 교모세포종과 같은 고급 신경교종(HGG)은 소아 인구에서 암 관련 사망의 주요 원인이며2 성인에서도 치료하기 가장 어려운 종양 중 하나입니다3. HGG의 분자 동인에 대한 이해가 크게 발전했음에도 불구하고 치료 옵션은 여전히 제한적이며3 이는 임상에서 치료 민감도를 보다 정확하게 예측하는 약물 스크리닝 방법의 필요성을 강조합니다.

3D 세포 배양은 주로 생리학적으로 관련된 세포 행동 모델링에 사용되어 왔습니다4. 또한, 종양 미세환경의 3D 구조는 3D 성장 분석을 확립하여 in vitro로 재현할 수 있습니다5. 스페로이드 성장은 또한 다양한 신호 경로를 활성화하므로 2D 배양에 비해 생체 내 모델 6,7을 더 잘 나타내는 것으로 간주됩니다. 소아 HGG 줄기세포와 마우스 NF1 신경교종 줄기세포주는 자연적으로 신경구로 성장하며, 이러한 마우스 NF1 신경교종 세포주를 중간 처리량의 약물 스크리닝8에 사용했습니다. 여기에 사용된 소아 라인은 반구, 정중선 및 소뇌 소아 HGG에서 파생되었으며 소아 뇌종양 네트워크(돌연변이 및 유전자 발현 프로파일)에서 획득하여 완전히 특성화되었습니다9. 이 라인은 핵 적색 형광 단백질(RFP)을 발현하도록 변형되었으며, 이를 통해 Incucyte 라이브 이미징 시스템을 사용하여 증식 및 생존을 모니터링할 수 있습니다. RFP 신호의 강도는 존재하는 셀의 수를 나타냅니다. 녹색 형광 단백질(GFP)과 같은 다른 형광단도 사용할 수 있습니다.

소아 급성 림프구 백혈병, 림프종, 상피 악성 종양 및 기타 많은 암에 대한 복합 화학 요법은 종양을 근절하고 단일 제제에 대한 약물 내성을 예방하는 효과적인 방법입니다10,11. 그러나 HGG에서 치료 민감성을 달성하기 위해 어떤 약제를 결합해야 하는지에 대한 정보가 제한되어 있어 체외 약물 검사에서 보다 정확한 스페로이드 모델을 사용하도록 권장합니다.

프로토콜

모든 프로토콜 절차는 필라델피아 아동병원 기관 검토 위원회(IRB)의 승인을 받았습니다.

1. 3D 스페로이드 세포 도금

  1. 신경교종 줄기세포 배지 준비: 기본 배지를 만들려면 증식 보충제 50mL와 100x 페니실린-스트렙토마이신 용액(10,000U/mL) 5mL를 기저 배지(500mL)에 추가합니다. 신경교종 줄기세포 배지를 만들려면 제조업체 설명에 따라 표피 성장 인자(EGF)와 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)를 각각 20ng/mL 및 10ng/mL의 최종 농도에 추가합니다.
    참고: 신경교종 줄기세포 배지는 4°C에서 보관 시 1주일 동안 사용할 수 있습니다.
  2. RFP 발현 세포 해리:
    참고: 이 예에서는 마우스 NF1 HGG 줄기세포주 5746이 사용됩니다.
    1. 신경교종 구체를 15mL 원뿔형 튜브로 옮기고 원심분리기에서 신경교종 구체를 스핀다운합니다(150 x g 에서 5분 동안). 상층액을 제거하고 300μL의 accutase를 추가하여 구체를 분리합니다(37°C에서 5분 동안 배양).
    2. 신경교종 줄기세포 배지 1mL를 추가하고 부드러운 피펫팅으로 구체를 파괴합니다. 해리된 세포를 150 x g에서 5분 동안 원심분리하고, 상층액을 흡인하고, 1mL의 신경교종 줄기세포 배지에 펠렛을 용해시킵니다.
  3. 세포 계수기 또는 혈구계를 사용하여 세포의 농도를 측정합니다. 형광 세포 계수기를 사용하는 경우, 2 μL의 Acridine Orange/Propidium Iodide Stain에 18 μL의 세포 현탁액을 첨가합니다. 이 현탁액 12μL를 혈구계에 로드하여 현탁액에 존재하는 살아있는/죽은 세포의 수를 계산합니다.
  4. 신경교종 줄기 세포 배지 100μL당 2,000개의 세포라는 최종 농도로 세포를 희석합니다.
    참고: 세포 농도에 대한 수정은 세포주에 따라 달라질 수 있으며 그에 따라 조정될 수 있습니다.
  5. 멀티채널 피펫을 사용하여 리버스 피펫팅을 통해 96웰 둥근 바닥 하단 낮은 부착 플레이트의 각 웰에 100μL의 셀 현탁액(100μL당 2,000개 셀)을 분주합니다.
    알림: 둥근 바닥의 낮은 부착 플레이트를 사용하십시오. 이 플레이트는 각 웰에서 단일 신경교종 구체의 형성을 자극합니다. 역 피펫팅은 살아있는 세포 분석 시스템의 이미지 캡처를 방해하는 기포 형성을 방지합니다.
  6. 150 x g 에서 5분 동안 플레이트를 원심분리합니다.
    참고: 원심분리는 3D 신경구 형성을 시작하는 중요한 단계입니다.
  7. 각 웰에 하나의 구가 형성될 수 있도록 밤새 배양합니다.

2. 시너지 분석을 위한 약물 추가(그림 1)

  1. 96웰 플레이트의 각 웰이 두 약물 1과 2의 특정 농도를 받는지 확인합니다. 약물 1의 각 농도가 약물 2의 각 농도와 중복으로 결합되는 그리드를 만듭니다.
  2. 신경교종 줄기세포 배지를 사용하여 시너지 효과를 결정할 두 약물(약물 1의 5회 희석 및 약물 2의 7회 희석)을 연속 희석합니다(그림 1A).
    참고: 이 연구에서는 50% 연속 희석 시리즈가 사용됩니다. 그러나 모든 희석 시리즈를 사용할 수 있습니다.
    1. 희석 시리즈는 각 웰에서 원하는 최종 농도보다 7배 더 농축되어야 합니다. 예를 들어, 약물 1에 대한 가장 높은 최종 농도가 1μM인 경우 약물 1, 7μM( 그림 1A의 튜브 B 또는 I)에 대한 희석 시리즈의 첫 번째 농도를 만듭니다.
    2. 500μL의 신경교종 줄기세포 배지를 희석 시리즈의 각 추가 튜브( 그림 1 참조와 같이 튜브 C-H 및 J-M)에 추가합니다.
    3. 희석 시리즈를 만들려면 튜브 B 또는 튜브 I에서 약물 혼합물 500μL를 흡인하고 각각 희석 시리즈 튜브 C 또는 튜브 J의 다음 튜브(500μL의 신경교종 줄기 세포 배지 포함)에 추가합니다. 잘 섞고 희석 시리즈의 다음 튜브에 반복합니다. DMSO 제어(튜브 A)를 만들고 DMSO 농도가 조건 간에 동일한지 확인합니다.
      참고: 약물 농도 및 희석 시리즈를 수정할 수 있습니다. 희석 시리즈가 변경된 경우 보충 파일 1 에 올바른 약물 농도를 나열해야 합니다.
  3. 96개의 웰 플레이트의 각 웰에 그림 1B와 같이 역 피펫팅을 통해 약물 1 20μL와 약물 2 20μL를 추가하여 웰당 140μL의 최종 부피를 얻습니다. 약물 조합은 중복으로 평가됩니다. IC50 및 LD50에 대해 제공된 다운스트림 분석을 사용하는 경우 그림 1B와 같이 약물 레이아웃을 사용합니다.
    1. 이 분석에서는 각 약물 자체(다른 약물이 존재하지 않음)의 효과도 측정됩니다. 각 웰의 최종 부피를 140μL로 만들기 위해 단일 약물 웰에 20μL의 DMSO 제어 매체( 그림 1B의 튜브 A)를 추가해야 합니다.
    2. 우물에 기포가 포함되어 있지 않은지 확인하십시오., 이는 이미징에 영향을 미치므로 합니다.
      참고: 최종 볼륨에 대한 수정이 이루어질 수 있습니다. 그러나 포인트 2.2의 농도를 조정해야 합니다.
  4. 플레이트를 라이브 이미저에 배치하고 스페로이드 모듈, 단일 구 설정, 4배 배율에서 명시야와 RFP를 모두 이미징하여 각 웰에서 각 구의 성장을 모니터링합니다.
  5. 72시간 동안 플레이트를 모니터링하고 일정한 시간 간격(일반적으로 2시간)으로 플레이트의 각 웰을 이미징합니다.
    참고: 올바른 플레이트 맵을 업로드하십시오. 이를 통해 적절한 다운스트림 분석이 보장됩니다(그림 1C).

3. IC50, LD50 및 시너지 점수 계산(그림 2 및 그림 3)

  1. 라이브 이미저 소프트웨어를 사용하여 각 웰 및 각 시점에 대한 RFP 강도를 분석합니다. 사용된 해석 매개변수는 보충 파일(보충 파일 2)에 나열되어 있습니다.
    참고: 다양한 분석 매개변수를 선호하여 사용할 수 있습니다.
  2. RFP 데이터를 각 웰에 대한 Total Red Integrated RFP Intensity로 내보내고, 그룹화되지 않은 원시 데이터를 내보내야 합니다(그림 2A).
    참고: 제공된 템플릿(보충 파일 1)을 사용하여 IC50 및 LD50을 계산하는 경우 3.2항을 준수하는 것이 중요합니다
  3. 원시 데이터를 제공된 엑셀 시트에 붙여넣어 (1) DMSO와 비교한 폴드 변화(이 계산에서는 0h 값이 필요하지 않음) 및 (2) 0h와 비교한 폴드 변화의 Log2의 각 약물 조합에 대한 평균 및 표준 편차를 결정합니다(그림 2B 및 보충 파일 1의 예 참조).
  4. 스프레드시트에서 약물 1과 2의 최대 농도를 조정합니다(그림 2B).
    알림: 약물 1과 2의 농도를 조정해야 합니다. 그렇지 않으면 잘못된 LD50 및 IC50 값이 계산됩니다.
  5. 적절한 데이터 분석 소프트웨어 응용 프로그램(여기서는 GraphPad가 사용됨)을 사용하여 IC50 값을 계산합니다. IC50 값 계산을 위해 3.4단계에서만 측정된 DMSO와 비교하여 평균 폴드 변화 및 표준 편차 폴드 변화를 사용하고, 약물 1 및 2의 IC50 표를 데이터 분석 소프트웨어(Log(inhibitor) vs. normalized response, variable slope)에 복사합니다(그림 3A).
    1. IC50 계산을 위해 단일 컴푼드가 추가된 웰의 데이터만 사용합니다. 제공된 스프레드시트에서 자동으로 계산되는 데이터 분석 소프트웨어에서 약물 농도 값을 기록합니다.
  6. 시너지 점수 계산:
    1. DMSO와 비교한 평균 폴드 체인을 모든 조합에만 사용하여 소프트웨어 패키지 또는 웹 사이트를 사용하여 시너지 점수를 계산할 수 있습니다. 예를 들어, https://synergyfinder.fimm.fi/ 12(매개변수: LL4 곡선 맞춤, 시너지 점수 계산을 위한 ZIP 방법). 보충 파일 1은 SynergyFinder에 업로드할 수 있는 시너지 입력 테이블을 생성하는 데 필요한 값을 자동으로 계산합니다(그림 3B). 시너지 입력 테이블의 예는 보충 파일 3에 제공되어 있습니다.
      참고: 10 이상의 점수는 시너지를 나타내고, -10 미만의 점수는 적대감을 나타내며, -10과 10 사이의 값은 추가 효과를 나타냅니다.
  7. LD50 점수를 계산합니다.
    1. 약물 1의 각 농도에 대해 약물 2의 LD50을 계산합니다. 보조 파일은 각 농도에 대한 Log2 값과 표준 편차를 자동으로 계산합니다(그림 3C).
    2. 데이터 분석 소프트웨어에서 0 h와 비교한 Log2 폴드 변화의 평균 및 표준 편차와 반복 횟수(이 연구에서는 2,)를 입력하고 -1에서 농도를 결정하여 LD50 값과 LD50 표준 편차를 계산합니다(Log2 = -1은 0 h에 비해 신호의 50%가 손실된 log2 값을 나타냄). 이 계산에서는 로그(억제제) 대 응답, 가변 기울기 4 매개변수 모형을 사용합니다.
      참고: 데이터 분석 소프트웨어는 log2 = -1 값에 해당하는 약물 농도를 자동으로 계산하지 않습니다. 그러나 이 값은 데이터 분석 소프트웨어의 보고된 계산에 사용자 정의 방정식으로 추가할 수 있습니다(그림 3C). 제공된 스프레드시트에서 자동으로 계산되는 데이터 분석 소프트웨어의 로그 농도 값을 사용해야 합니다. 보충 파일 4 는 GraphPad 소프트웨어의 IC50 및 LD50 패널을 보여줍니다.

결과

예를 들어, 마우스 신경교종 줄기세포주 5746(RFP 발현)에서 두 개의 RAS 다운스트림 효과기 경로를 억제하는 Trametinib(MEK 억제제)와 GDC-0941(PI3K 억제제)의 시너지 효과를 평가했습니다(그림 4). 그림 4A 는 Trametinib과 GDC-0941의 조합으로 처리된 0시간 및 72시간의 동일한 구를 보여줍니다. 이러한 이미지는 라이브 이미저 소프트웨어에서 직접 내보냈습니다. IC50 및 LD50은 GraphPad (그림 4B, D)에 설명 된대로 계산되었으며, 시너지는 SynergyFinder (그림 4C)를 사용하여 계산되었습니다. 그림 4B 는 IC50 계산의 출력을 보여줍니다. LogIC50, Hillslope 및 IC50 값은 두 약물 모두에 대해 표시되며 95% 신뢰 구간 및 적합도도 표시됩니다. 그림 4C 는 각 약물 단독에 대한 용량-반응 곡선(약물 농도 대 억제율 백분율), 각 약물 조합에 대한 성장 억제 비율을 보여주는 색상으로 구분된 매트릭스, 두 약물 간의 시너지 점수의 3D 그래프를 보여주며, 이 경우 시너지 점수는 22.356입니다. 그림 4D 는 단독으로 또는 조합된 약물의 LD50 값에 대한 출력을 보여줍니다. 중요한 것은 LogLD50 및 LD50 값과 각각의 95% 신뢰 구간입니다. 예상대로 Trametinib의 LD50은 GDC-0941 농도가 낮을수록 낮습니다. LD50은 세포 사멸 마커이며 분석 시작점과 비교하여 50%의 세포 사멸을 나타낸다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

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그림 1: 2-약물 시너지 96-웰 플레이트 설정. (A) 약물 1 및 2의 1/2 희석 계열의 개략도. 약물 농도는 각 웰의 최종 농도보다 7배 높아야 합니다. (B) 5746개의 RFP 구가 있는 96웰 플레이트의 0시간 포인트 이미지. 약물 1 희석 계열은 총 7개의 희석액 및 DMSO 대조군에 대해 표시된 대로 각 행에 추가됩니다. Drug 2 희석 시리즈는 총 5개의 희석액과 DMSO 대조군에 대해 표시된 대로 2개의 컬럼에 매번 추가됩니다. (C) 라이브 이미저 소프트웨어에 업로드된 플레이트 맵의 예. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: 수집된 데이터의 내보내기. (A) 72시간의 측정 후, 각 웰 및 각 시점에 대해 Total Red Object Integrated Intensity 를 내보냅니다. 그룹화 가 None으로 설정되어 있습니다. 내보내기 옵션(오른쪽)의 경우 Organize by Replicates 및 Destination to Clipboard(클립보드로 대상)를 선택합니다. (B) 내보낸 데이터를 스프레드시트의 표시된 셀(Supplementary File 1)에 붙여넣습니다. 표시된 대로 각 약물의 최고 농도를 업데이트합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3: 수집된 데이터 처리. (A) 분석을 위해 데이터 분석 소프트웨어에 복사할 수 있는 IC50 입력 테이블(보충 파일 4, IC50 패널). 이러한 테이블은 보충 파일 1에서 자동으로 생성됩니다. (B) SynergyFinder 프로그램에 대한 시너지 입력 테이블은 생존 가능성 테이블을 보충 파일 3에 복사하여 생성할 수 있습니다. 이 파일은 표시된 선택 항목과 함께 https://synergyfinder.fimm.fi/ 에 업로드됩니다. 시너지 점수와 매트릭스가 자동으로 계산됩니다. (C) 분석을 위해 데이터 분석 소프트웨어(보충 파일 4, LD50 패널)에 복사할 수 있는 LD50 입력 테이블. 이러한 테이블은 보충 파일 1에서 자동으로 생성됩니다. 하단은 LD50이 데이터 분석 소프트웨어에서 보고된 값에 어떻게 추가되었는지 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4: 5746 신경교종 줄기세포 구체에서 트라메티닙과 GDC-0941의 시너지 연구 결과의 예. (A) 10nM 트라메티닙 및 1000nM GDC-0941로 처리된 5746 RFP 구체의 0시간 및 72시간 후처리 이미지. (B) IC50 값과 IC50의 표준 편차를 보여주는 IC50 계산의 출력. (C) SynergyFinder 프로그램의 출력. 왼쪽: 억제 곡선, 가운데: 억제 백분율 표, 오른쪽: 트라메티닙과 GDC-0941의 시너지 점수는 22.3임을 보여주는 시너지 맵. (D) LD50에서 계산된 LD50 값과 표준 편차를 보여주는 LD50 계산의 출력. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 1: Incucyte에서 RFP 신호를 분석하는 데 사용되는 매개변수. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 2: 생성된 데이터가 처리되고 GraphPad 및 SynergyFinder에 대한 입력 테이블이 생성되는 스프레드시트입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 3: SynergyFinder 입력 테이블의 스프레드시트. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 4: IC50 및 LD50 값을 계산하기 위한 GraphPad 파일 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

이 프로토콜은 신경교종8의 스페로이드 모델에서 약물 취약성을 평가하는 데 효과적으로 사용된 3D 약물 스크리닝 분석에 대해 설명합니다. 이 3D 스페로이드 분석 시스템은 구체에서 성장한 신경교종 세포주에 대한 조합 화학요법의 보다 정확한 전임상 조사를 가능하게 하도록 특별히 설계되었습니다. HGG의 경우 이 방법은 이 파괴적인 질병에 대한 잠재적인 약물 취약성을 식별하기 위한 프레임워크를 제공합니다. 그러나 이 시스템의 잠재적 응용 분야는 신경교종에 국한되지 않으며 이 프로토콜은 다양한 다른 조건의 3D 모델에서 새로운 치료법을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

이 연구의 목표는 체외 약물 스크리닝의 예측 가능성을 높여 전임상 연구와 궁극적으로 클리닉에서 성공 가능성이 가장 높은 약물 조합의 우선 순위를 정하는 것입니다. 특히 신경교종의 경우, 임상에 잘 전달되는 체외 약물 스크리닝을 사용하여 강력한 약물 조합을 식별하는 것은 여전히 제한적입니다. 이는 부분적으로 덜 이상적인 혈청 성장 신경교종 세포주(13)를 사용하고, 2D 단층 분석법4을 사용하며, LD50(분석 시작 대비 50% 적은 세포) 값14 대신 IC50(50% 성장 감소)에 초점을 맞추기 때문입니다. 신경교종 줄기세포의 체외 스페로이드 성장 분석은 전임상 모델에서 평가할 약물 조합의 우선 순위를 정하는 데 사용됩니다. 약물 조합의 우선순위를 정할 때 몇 가지 측정이 고려됩니다: 1) 낮은 LD50 값, 증식 감소보다는 세포 사멸에 초점을 맞추는 것이 잠재적인 성공을 높입니다. 2) 이상적으로, 이러한 LD50 값은 Cmax 값, 즉 가능한 경우 임상 시험을 위한 약동학 약물 연구 중에 안전하게 얻을 수 있는 최대 혈청 농도보다 낮습니다. 3) 높은 시너지 점수, 두 약물이 모두 시너지 효과를 낸다면 이는 두 약물 간의 기계론적 협력을 나타냅니다. 이 마지막 요점은 강력한 약물 조합을 식별하는 데 필요하지는 않지만, 시너지 효과는 약물 독성을 증가시키지 않고 약물 효능을 향상시킬 수 있습니다.

중요한 것은 약물 민감도에 대한 체외 평가가 종양을 축소할 수 있는 새로운 치료법이나 약물 조합을 발견하기 위한 중요한 도구로 남아 있다는 것입니다. 여기에 제시된 프로토콜을 통해 전임상 모델에서 평가할 약물 조합의 우선 순위를 지정하는 데 사용할 수 있는 3D 스페로이드 성장 분석 시스템과의 약물 민감도 및 시너지 효과를 결정할 수 있습니다.

이 프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 포함됩니다. 우리는 96개의 웰 플레이트의 각 웰에서 단일 콜로니의 성장을 측정하고 있습니다. 부착성이 낮은 둥근 바닥 웰 플레이트를 사용하는 것은 세포가 웰에 부착되지 않고 구 형성이 자극되도록 하는 데 중요합니다. 둥근 바닥 웰은 단일 구가 항상 96웰 플레이트의 동일한 지점에 위치하도록 합니다.

셀을 도금한 후 플레이트를 원심분리하여 도금된 모든 셀이 둥근 바닥 웰의 가장 낮은 지점에서 함께 모이고 단일 3D 구가 형성되도록 해야 합니다. 각 웰의 총 부피는 140μL여야 합니다. 이렇게 하면 각 웰에서 각 약물의 정확한 최종 농도를 확인할 수 있습니다.

96웰 플레이트에 피펫팅할 때 역 피펫팅 기법을 사용하면 웰에서 기포가 발생할 위험을 줄일 수 있습니다. 기포는 라이브 이미저가 각 웰을 올바르게 이미징하는 것을 방해하고 형광 강도가 정확하지 않아 결과의 다운스트림 분석에 영향을 미칩니다.

제공된 플레이트 레이아웃 및 스프레드시트는 설명된 프로토콜에 따라 다릅니다. 도금에서 벗어나면 잘못된 IC50 및 LD50 값이 계산됩니다. 스프레드시트는 가장 높은 농도가 제공될 때 희석액을 자동으로 계산합니다. 각 실험에 대해 가장 높은 농도를 업데이트하지 않으면 잘못된 IC50 및 LD50 값이 계산됩니다.

Graphpad는 로그 농도를 사용하여 IC50 및 LD50 값을 계산합니다. 이러한 로그 농도는 제공된 스프레드시트에서 자동으로 계산되며 소프트웨어에 직접 복사할 수 있습니다. 로그 농도를 사용하지 않으면 IC50 및 LD50 값이 잘못됩니다.

우리는 자연적으로 구체로 자라는 세포주를 사용하고 있습니다. 이 프로토콜을 사용하여 부착 세포를 구로 강제할 수 있습니다. 그러나 그들이 증식할 수 있다는 보장은 없습니다. 각 웰에 도태된 세포의 수는 세포주에 따라 달라질 수 있으며 쉽게 조정할 수 있는 개별 세포주의 고유한 성장 특성에 의존할 수 있습니다. 제안된 희석 곡선은 제안 사항일 뿐입니다. 약물 농도 및 희석 시리즈에 대한 수정이 이루어질 수 있습니다. 그러나, 희석 계열이 변경되는 경우 보충 파일 1 에 올바른 약물 농도를 나열하는 것이 중요합니다. 그렇지 않으면 계산된 IC50 및 LD50 값이 올바르지 않습니다. 다른 플레이트 레이아웃을 사용하도록 선택할 수 있습니다. 예를 들어, 반복실험을 두 번이 아닌 한 번만 사용합니다. 이를 위해 사용자는 이 변경 사항을 반영하도록 스프레드시트를 업데이트해야 합니다.

도금 후에는 드문 경우지만 여러 개의 3D 구가 단일 웰에 형성됩니다. 이러한 경우 원심분리 단계(150 x g)를 반복하면 이러한 구가 단일 구로 병합됩니다. 도금 오류가 발생하여 플레이트 레이아웃이 다른 경우 제공된 스프레드시트를 수정하여 새 플레이트 맵을 반영할 수 있습니다. 데이터 포인트가 이상치이고 분석에서 제거해야 하는 경우 제공된 스프레드시트를 업데이트할 수 있습니다.

이 시스템의 주요 한계는 단층에서 성장한 부착 라인이 아닌 구체로 자연적으로 성장한 세포주를 사용한다는 것입니다. 세포주가 구를 형성할 수 없는 경우 기존의 2D 증식 분석을 사용해야 합니다. 기존 2D 단층과 비교할 때 이와 같은 3D 오가노이드 유사 성장 분석을 활용하는 이점은 아키텍처와 활성화된 신호 경로가 인간 질병의 생체 내 모델에서 관찰된 것을 더 정확하게 반영하여 이러한 방법의 번역 잠재력과 적용 가능성을 강조한다는 것입니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
15 mL 원심분리 튜브CELLTREAT22941115 mL 폴리프로필렌 원심분리 튜브, 멸균
96-웰플레이트 S-bioMS9096UZ96-웰 둥근 바닥 초저 부착 플레이트
AccutaseSTEMCELL Technologies7922세포 분리 용액
아크리딘 오렌지/프로피듐 요오드화물 염색로고 BiosystemsF23001Live/dead 세포 계수를 위한 염색
bFGFSTEMCELL Technologies78003.2인간 재조합 bFGF
세포 계수기로고 BiosystemsL20001LUNA-FL 이중 형광 세포 계수기
원심분리기Eppendorf5810R원심분리 세포 및 플레이트
DMSOPierce20688화합물용 용매
EGFSTEMCELL Technologies78006.2인간 재조합 EGF
Eppendorf 튜브Costar07-200-534마이크로 원심분리기 튜브
ExcelMicrosoftMicrosoft Excel
GDC-0941SelleckchemS1065Drug 1
GraphPadGraphPadGraphPad Prism 9IC50 및 LD50
혈구계로고 계산 조직
배양 인큐베이터에 내장된IncucyteSartoriusS3
Incucyte 소프트웨어SartoriusIncucyte 2022B증식 데이터 분석
미디어STEMCELL Technologies5702NeuroCult (Mouse and Rat) 증식 키트에는 기초 배지 및 성장 보충제
Penicillin-Streptomycin이 포함되어 있습니다.Gibco15140122매체에 첨가하는 항생제
TrametinibSelleckchemS2673약물 2
Luna PhotonSlide 형광 현미경을 LGBD10008 Biosystems는 특정 시간 간격으로 모든 웰을 이미징합니다.

참고문헌

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