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방법 논문

마우스의 Contusive Spinal Cord Injury Model을 위한 자동 임팩터

3.5K 조회수

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DOI:

10.3791/65656

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2024년 1월 19일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopedics, The First Affiliated Hospital, Jinan University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

여기에 제시된 것은 다양한 정도의 척수 손상 타박상 모델을 정확하게 생성할 수 있는 마우스용 새로운 자동 척수 손상 타박상 장치입니다.

초록

자동차 사고 및 낙상과 같은 외상성 부상으로 인한 척수 손상(SCI)은 영구적인 척수 기능 장애와 관련이 있습니다. 척수에 충격을 가하여 척수 손상의 타박상 모델을 만드는 것은 임상에서 대부분의 척수 손상과 유사한 병리를 초래합니다. 정확하고 재현 가능하며 편리한 척수 손상 동물 모델은 척수 손상을 연구하는 데 필수적입니다. 우리는 정확성, 재현성 및 편의성을 갖춘 척수 손상 타박상 모델을 생성할 수 있는 생쥐용 새로운 자동 척수 손상 장치인 Guangzhou Jinan University 스마트 척수 손상 시스템을 제시합니다. 이 시스템은 자동화된 모바일 플랫폼 및 고급 소프트웨어와 결합된 레이저 거리 센서를 통해 다양한 정도의 척수 손상 모델을 정확하게 생성합니다. 이 시스템을 사용하여 세 가지 수준의 척수 손상 마우스 모델을 만들고, Basso 마우스 스케일(BMS) 점수를 결정하고, 정확성과 재현성을 입증하기 위해 행동 및 염색 분석을 수행했습니다. 우리는이 장치를 사용하여 부상 모델 개발의 각 단계를 보여 주며 표준화 된 절차를 형성합니다. 이 방법은 재현 가능한 척수 손상 타박상 마우스 모델을 생성하고 편리한 취급 절차를 통해 인간의 조작 요인을 줄입니다. 개발된 동물 모델은 척수 손상 메커니즘 및 관련 치료 접근법을 연구하는 데 신뢰할 수 있습니다.

서론

척수 손상은 일반적으로 손상된 부분 아래의 영구적인 척수 기능 장애를 초래합니다. 주로 척추에 부딪히는 물체와 척추의 과신전으로 인해 발생하는데, 교통사고나 낙상 등이 그것이다1. 척수 손상에 대한 효과적인 치료 옵션이 제한되어 있기 때문에 동물 모델을 사용하여 척수 손상의 발병 기전을 설명하는 것은 적절한 치료 접근법을 개발하는 데 도움이 될 것입니다. 척수에 가해지는 충격으로 인한 척수 손상의 타박상 모델은 대부분의 임상적 척수 손상 사례와 유사한 병리를 가진 동물 모델을 개발한다 2,3. 따라서 척수 손상 타박상에 대한 정확하고 재현 가능하며 편리한 동물 모델을 제작하는 것이 중요합니다.

1911년 Allen이 척수 손상의 첫 번째 동물 모델을 발명한 이래, 척수 손상 동물 모델을 확립하기 위한 기구의 개발에 큰 진전이 있었습니다 4,5. 손상 기전에 따라 척수 손상 모델은 타박상, 압박, 산만, 탈구, 절개 또는 화학적6으로 분류된다. 그 중에서도 외력을 사용하여 척수를 변위시키고 손상시키는 타박상 모델은 대부분의 척수 손상 환자의 임상 원인에 가장 가깝습니다. 따라서 타박상 모델은 척수 손상 연구에서 많은 연구자들에 의해 사용되어 왔다 3,7. 척수 손상 타박상 모델을 개발하기 위해 다양한 도구가 사용됩니다. 뉴욕대학교(New York University, NYU)의 다기관 동물 척수 손상 연구(MASCIS) 충격기는 체중 감량 장치(weight-drop device)에 의해 척수 손상 타박상을 일으킨다8. 몇 가지 업데이트된 버전을 거친 후, MASCIS 임팩터는 척수 손상 타박상 동물 모델9을 개발하는 데 널리 사용된다. 그러나 MASCIS의 임팩트로드가 떨어져 척수에 부딪히면 다발성 손상이 발생할 수 있으며, 이는 척수 손상 모델의 손상 정도에 영향을 미칩니다. 또한 기기의 정확성과 제조 모델의 반복성을 보장하기 위해 기계적 정밀도를 달성하는 것도 어렵습니다. 무한 지평선 임팩터는 무거운 낙하가 아닌 척수에 가해지는 힘을 제어하여 타박상을 유발한다10. 센서에 연결된 컴퓨터를 사용하여 충격기와 척수 사이의 충격력을 직접 측정합니다. 임계값에 도달하면 임팩터가 즉시 수축되어 중량 리바운드를 방지하고 정확도를 향상시킵니다10,11. 그러나 이러한 미세한 운동 방식을 사용하여 손상을 입히면 일관성 없는 손상과 기능적 결함이 발생할 수 있습니다6. 오하이오 주립 대학(OSU) 장치는 전자기 드라이버(12,13)에 의해 과도 속도로 척수의 등쪽 표면을 압축한다. 이 장치는 무한 지평선 임팩터와 유사한데, 근거리 압박을 사용하여 척수 손상을 유발하기 때문입니다. 그러나, 영점의 초기 결정은 뇌척수액(6,14)의 존재로 인해 오류를 발생시킨다는 점에서 다양한 한계가 있다. 요약하면, 척수 손상 타박상 동물 모델을 개발하는 데 사용할 수 있는 많은 도구가 있지만 모두 동물 모델의 정확도와 재현성이 불충분한 몇 가지 한계가 있습니다. 따라서 척수 손상의 마우스 타박상 모델을 보다 정확하고 편리하며 재현성 있게 만들기 위해서는 자동화되고 지능적인 척수 손상 임팩터가 필요합니다.

새로운 척수 손상 충격기인 광저우 지난 대학 스마트 척수 손상 시스템(G 스마트 SCI 시스템; 그림 1), 척수 손상 타박상 모델 제작. 이 장치는 레이저 거리 측정기를 포지셔닝 장치로 사용하며 자동화된 모바일 플랫폼과 결합되어 타격 속도, 타격 깊이 및 체류 시간을 포함하여 설정된 타격 매개변수에 따라 타격을 자동화합니다. 자동화된 작동은 인적 요인을 줄이고 동물 모델의 정확성과 재현성을 향상시킵니다.

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프로토콜

동물과 관련된 연구는 지난 대학교 윤리 위원회의 검토와 승인을 받았습니다.

1. 동물의 마취 및 T10 척추 후궁 절제술

  1. 이 연구에는 8주 된 암컷 젊은 성인 C57/6J 마우스를 사용합니다. 케타민(100mg/kg)과 디아제팜(5mg/kg)을 복강내 주사하여 마우스를 마취합니다. 통증 반사 상실로 나타나는 성공적인 마취를 확인하십시오. 마취 후 건조함을 방지하기 위해 눈에 수의사 연고를 바르십시오.
  2. 면도기를 사용하여 쥐 등의 털을 면도하여 피부를 드러냅니다. 요오드와 알코올을 번갈아 세 번 번갈아 가며 피부를 소독합니다.
  3. 메스를 사용하여 등쪽 피부에 2.5cm의 내측 세로를 절개하고 핀셋을 사용하여 T9-T11 높이에서 척추를 노출시킵니다.
  4. 척추 고정기를 사용하여 T10 패싯을 양측으로 고정합니다. 척추가 안정적으로 고정되었는지 확인하십시오. 척추 주위 근육이 벗겨졌는지 확인하고 미세 연삭 드릴을 사용하여 가시돌기와 라미네를 제거하여 T10 세그먼트의 척수를 노출시킵니다.

2. G smart SCI 시스템을 이용한 T10 척수 타박상

  1. 스위치를 켜고 장치가 자동으로 원래 상태로 돌아갈 때까지 기다립니다. 척추 고정기를 G 스마트 SCI 시스템에 넣고 나사를 사용하여 고정합니다.
  2. 작동 터치 스크린(그림 2A)을 사용하여 충격 속도(1m/s), 충격 깊이(3개의 다른 마우스 세트에 대해 0.5mm, 0.8mm 및 1.1mm) 및 체류 시간(500ms)15을 포함한 손상 매개변수를 설정합니다.
  3. 플랫폼을 움직여 노출된 척수의 중앙에 레이저 거리 측정기를 정렬합니다. (그림 2B)
  4. 터치 스크린의 Ready(준비) 단추를 클릭합니다(그림 2C). 임팩트 헤드는 설정 매개변수에 따라 특정 높이로 자동 조정됩니다. 캐리어 테이블은 척수 충격 부위를 충격 머리 아래로 자동으로 이동합니다.
  5. 충격 헤드를 수동으로 눌러 충격 부위를 추가로 결정합니다. 시작 버튼을 클릭하면 임팩트 헤드가 설정된 매개변수에 따라 척수에 부딪힙니다.
  6. 장치에서 마우스를 제거하고 실체현미경(20x)으로 관찰하여 척수 손상을 확인합니다(그림 3). 모델 개발의 성공 여부를 판단하려면 국소 울혈, 붕괴 및 척추막 파열을 관찰합니다.
  7. 근육, 근막 및 피부를 3-0 봉합사를 사용하여 층별로 봉합합니다. 쥐를 따뜻한 상자에 넣고 회복을 기다립니다.

3. 수술 후 관리

  1. 수술 후 7일간 매일 멜록시캠(5mg/kg)을 피하주사한다. 방광 기능이 회복될 때까지 8시간마다 수동으로 방광을 비우십시오.
  2. 수술 후 14일이 지나면 봉합사를 제거하십시오.

4. 척추 손상의 효과 검사

  1. 수술 후 첫 번째 날부터 마우스에 대한 BMS 점수를 계산합니다16,17.
  2. 수술후 30일째 되는 날, 캣워크, 풋폴트, 로타로드16,17 등 동물행동실험을 실시한다. 캣워크: 45cm의 기록 거리; 최대 실행 시간 8초; 카메라 게인 28.02; 강도 임계값 0.01. 발 결함: 각 마우스에 대해 60단계를 기록합니다. 로타로드: 속도 20rpm. 마우스가 떨어지는 시간을 기록하고 120초 이상 동안 120초로 기록합니다.
  3. 수술 후 31일째 되는 날에는 케타민(100mg/kg)과 디아제팜(5mg/kg)을 복강내 주사하여 마우스를 마취한 후 4% PFA를 사용하여 관류하여 마우스를 안락사시킵니다. 척수를 조심스럽게 제거하고 파라핀이 박히기 위해 부상 부위 위아래 5mm를 가로챕니다. 마우스 척수 손상의 중심을 5μm 절편으로 만들고 헤마톡실린 및 에오신 염색17을 수행합니다.
  4. 통계 분석의 경우 상용 소프트웨어를 사용하십시오. 데이터를 평균의 평균 ± 표준 오차(SEM)로 표현하고 일원 분산 분석을 사용하여 비교합니다. P < 0.05는 유의한 것으로 간주되었습니다.

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결과

후궁절제술은 상기한 바와 같이 24마리의 암컷 마우스(생후 8주령)에 대해 수행하였다. 가짜 그룹(n=6)의 마우스는 척수 손상을 입지 않은 반면, 0.5mm 그룹(n=6), 0.8mm 그룹(n=6) 및 1.1mm 그룹(n=6)을 포함한 나머지 마우스는 서로 다른 깊이의 척수 충돌에 노출되었습니다. BMS 점수는 수술 후 1개월까지 정기적으로 기록되었습니다(그림 4). 다른 그룹에서 마우스의 수술 후 BMS 점수에는 상당한 차이가 있었습니다. 1개월 후, 0.5mm 그룹의 마우스는 수술 후 점수가 4-6점이었고 가짜 그룹과 유사한 수준으로 회복되었습니다. 0.8mm와 1.1mm의 마우스는 수술 후 점수가 1-2점이었다. 1개월 후, 0.8mm 그룹의 마우스는 4-6점으로 회복된 반면, 1.1mm 그룹의 마우스는 거의 회복되지 않았습니다.

1개월 후, 발 결함, 로타로드 및 캣워크를 포함한 동물 행동 분석을 수행했습니다. 발 결...

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토론

척수 손상은 감각 및 운동 장애를 일으켜 심각한 신체적, 정신적 장애를 초래할 수 있습니다. 중국에서는 성(省)에 따라 척수 손상 발생률이 100만 명당 14.6명에서 60.6명까지 다양하다18. SCI의 유병률 증가는 의료 시스템에 더 많은 압력을 가할 것입니다. 현재 척수손상, 손상에 대한 효과적인 치료법은 그 병리기전과 회복 과정이 아직 완전히 이해되지 않았기 때문에 제한적이다19. 척수 손상의 병리기전과 회복 과정을 조사하기 위해 정확하고 재현 가능한 척수 손상 동물 모델을 만들 필요가 있습니다. 이를 위해 우리는 정확하고 반복 가능하며 간단한 척수 손상 기구를 개발했습니다.

NYU-MASCIS 임팩터, 무한 호라이즌 임팩터 및 OSU 임팩터를 포함한 많은 장치가 척수 손상의 타박상 모델을 만드는 데 사용됩니다 8,9,12,1...

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공개 사항

저자는 재정적 이익이 상충되지 않는다고 선언합니다.

감사의 글

이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단, Nos. 82102314(ZSJ 소속) 및 32170977(HSL 소속) 및 광둥성 자연과학 재단 Nos. 2022A1515010438(ZSJ 소속) 및 2022A1515012306(HSL 소속)의 지원을 받았습니다. 이 연구는 중국 제남대학교 제1부속병원의 임상 프론티어 기술 프로그램(Nos. JNU1AF- CFTP- 2022-a01206)의 지원을 받았습니다. 이 연구는 광저우 과학 기술 계획 프로젝트, Nos. 202201020018(HSL로), 2023A04J1284(ZSJ로) 및 2023A03J1024(HSL로)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.01M PBS (분말, pH7.2-7.4)Solarbio Life SciencesP1010
2,2,2-TribromoethanolMacklin75-80-9
4% 파라포름알데히드 조직 고정 Biosharp생명 과학BL539A
BiomicroscopeLeicaLCC50 HD
CatWalk Noldus 정보 기술CatWalk XT 9.1
커버 유리CITOTEST Scientific10212432C
임베딩 머신Changzhou Zhongwei Electronic InstrumentBMJ-A
에탄올 절대DAMAO64-17-5
FootFaultScanClever Sys Inc.-
유리 슬라이드CITOTEST Scientific80302-2104
Hematoxylin 및 Eosin 염색 키트Beyotime BiotechnologyC0105S
마이크로 그라인딩 드릴 FEIYUBIO19-7010
마우스 척추 고정기RWD 생명 과학68094
파라핀 마이크로톰Thermoshandon finesse 325
RotaRod for MiceUgo Basile47600
실체 현미경KUY NICESZM-7045
Tert-Amyl alcoholMacklin75-85-4
크실렌중국 국립 제약#10023418

참고문헌

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  22. Bilgen, M. A new device for experimental modeling of central nervous system injuries. Neurorehabilitation and Neural Repair. 19 (3), 219-226 (2005).
  23. Khan, M., et al. GSNOR and ALDH2 alleviate traumatic spinal cord injury. Brain Research. 1758, 147335(2021).

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