방법 논문

EV-ACT(Activated Clotting Time)를 사용한 세포외 소포(EV)의 응고 활성 측정

DOI:

10.3791/65661

⸱

2023년 8월 4일

 ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Post-Neurotrauma Neurorepair and Regeneration in Central Nervous System, Ministry of Education and Tianjin Neurological Institute, Tianjin Medical University General Hospital, 2Department of Neurosurgery, Tianjin Medical University General Hospital, 3Department of Neurosurgery, Tianjin Huanhu Hospital, 4Department of Medical Oncology, Tianjin Medical University General Hospital

이 논문에서

요약

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이 프로토콜은 EV의 응고 능력의 지표로 세포외 소포체(EV)가 풍부한 혈장의 사용을 조사합니다. EV가 풍부한 플라즈마는 차등 원심분리 및 후속 재석회화 과정을 통해 얻어집니다.

초록

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다양한 질병에서 세포외 소포체(EV)의 역할은 특히 강력한 응고 활성으로 인해 점점 더 주목을 받고 있습니다. 그러나 임상 환경에서 EV의 응고 활성을 평가하기 위한 병상 검사가 시급히 필요합니다. 이 연구는 EV의 응고제 활성의 척도로 EV가 풍부한 혈장의 트롬빈 활성화 시간을 사용할 것을 제안합니다. 나트륨 구연산 전혈을 얻기 위해 표준화된 절차를 사용한 후 EV가 풍부한 혈장을 얻기 위해 차등 원심분리를 수행했습니다. EV가 풍부한 플라즈마와 염화칼슘을 테스트 컵에 첨가하고 분석기를 사용하여 점탄성의 변화를 실시간으로 모니터링했습니다. EV-ACT라고 하는 EV가 풍부한 혈장의 자연 응고 시간을 측정했습니다. 그 결과, 건강한 지원자로부터 얻은 혈장에서 EV를 제거했을 때 EV-ACT가 크게 증가한 반면, EV가 농축되었을 때 EV-ACT가 크게 감소한 것으로 나타났습니다. 또한, 자간전증, 고관절 골절 및 폐암의 인간 샘플에서 EV-ACT가 상당히 단축되어 혈장 EV 수치가 상승하고 혈액 과응고가 촉진되었음을 나타냅니다. 간단하고 빠른 시술을 통해 EV-ACT는 혈장 EV 수치가 높은 환자의 응고 기능을 평가하기 위한 병상 검사로서 가능성을 보여줍니다.

서론

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혈액 응고 과잉에 의해 발생하는 혈전증은 뇌 외상(brain trauma)1, 자간전증(pre-eclampsia)2, 종양(tumors)3, 골절 환자(fracture patients)4 등 다양한 질환에서 중요한 역할을 한다. 과응고성의 기전은 복잡하며, 최근에는 응고 장애에서 세포외 소포체(EV)의 역할이 강조되고 있습니다. EV는 직경이 10nm에서 1000nm에 이르는 세포막에서 분리되는 이중층 구조를 가진 소포 모양의 몸체입니다. 이는 다양한 질병 과정, 특히 응고 장애와 관련이 있다5. 여러 연구에서 EV가 혈전증 위험의 유망한 예측 인자로 확인되었습니다 6,7. EV의 응고 활성은 응고 인자, 주로 조직 인자(TF)와 포스파티딜세린(PS)의 발현에 따라 달라집니다. 강력한 프로응고제 활성을 가진 EV는 테나아제와 프로트롬빈 복합체의 촉매 효율을 크게 향상시켜 트롬빈 매개 피브리노겐과 국소 혈전증을 촉진한다8. EV의 높은 ....

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프로토콜

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인체 검체 채취는 천진 의과대학 종합병원 의료윤리위원회의 승인을 받았다. 인간 정맥혈 채취는 중국 국가위생건강위원회에서 발행한 지침, 즉 WS/T 661-2020 정맥혈 표본 채취 지침을 엄격히 따랐습니다. 간단히 말해서, 전방 상완 부위 정맥에서 정보에 입각한 동의를 받은 건강한 개인으로부터 혈액을 수집하고, 샘플을 3.2% 구연산나트륨 항응고제를 1:9의 비율로 혼합했습니다. 구연산나트륨 항응고제 검체만 채취했을 때, 첫 번째 채취 용기는 폐기되었습니다. 처리 흐름은 샘플 수집 후 0.5시간 이내에 시작되었습니다. 건강한 성인 피험자는 정보에 입각한 동의를 얻은 후 샘플 수집을 위해 모집되었습니다. 환자 제외 기준은 (1) 최근 혈관 내 혈전증, (2) 간 및 신장 기능 장애, (3) 고혈압, 고지혈증, 당뇨병 및 기타 만성 질환, (4) 아스피린 또는 항응고제 치료, (5) 월경 및 임신이었습니다.

1. EV가 풍부한 플라즈마의 분리

  1. 샘플을 실온에서 120 x g 에서 20분 동안 원심분리하여 혈액 세포를 제거합니다. 상청액은 혈소판이 풍부한 혈장입니다. 그런 다음 상층액의 상부 1/2을 피펫이 있는 새 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
  2. 혈소판이 풍부한 혈장을 ....

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결과

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EV가 풍부한 혈장의 트롬빈 활성화 시간은 혈장 응고 시간 측정을 위해 점탄성 방법 분석기를 사용하여 측정하였다. 이 기계는 전자 신호 변환기, 프로브, 감지 탱크 및 발열체의 네 가지 주요 구성 요소로 구성됩니다(그림 1A,B). 프로브는 고주파 및 저진폭 진동을 활용하여 플라즈마 점도의 변화를 감지합니다. 일상적인 품질 관리에는 주로 테스트 플랫폼의 안정성을 평가하고 프로브에 대한 물리적 장애를 식별하기 위한 공기 품질 관리가 포함됩니다. 성능 품질 관리에는 프로브에서 감지한 저항 값이 설정 범위 내에 있는지 확인하기 위해 표준 점도 오일로 테스트하는 작업이 포함됩니다.

EV가 풍부한 혈장을 얻은 후 시료 품질 관리를 위해 유세포 분석을 사용하여 EV를 측정했습니다. 비정규화 샘플은 EV의 "게이트" 근처에서 입자 크기가 약간 더 큰 뚜렷한 클러스터를 나타냅니다(

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토론

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이 연구에서는 EV가 풍부한 혈장의 제조를 설명하고 유세포 분석을 사용하여 방법의 합리성을 검증했습니다. 이어서, 재석회화된 혈장 샘플은 점탄성 원리24에 기초한 응고 분석기를 사용하여 ACT 시간 동안 분석하였다. 그림 3A에서 볼 수 있듯이 초원심분리를 통해 얻은 EV의 농도는 EV-ACT 시간을 단축하는 것으로 나타났으며, EV 수준을 감소시킨 초원심분리 후 상층액은 EV-ACT 시간이 연장되는 것으로 나타났습니다. 이러한 결과는 EV-ACT 결과와 EV 수준 사이에 밀접한 관계가 있음을 시사합니다. 그림 3B에서는 자간전증, 고관절 골절 및 폐암 환자의 혈장 샘플의 EV-ACT를 건강한 지원자와 비교하여 질병 그룹에서 EV-ACT 시간이 상당히 짧다는 것을 보여주었습니다. 이전 보고에 따르면 이러한 질병에 대한 혈장 내 응고 촉진 EV 수치가 상승했습니다 27,28,29.<.......

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공개 사항

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모든 저자는 잠재적인 이해 상충이 없다고 선언했습니다.

감사의 글

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이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (보조금 번호 81930031, 81901525)의 보조금으로 지원되었습니다. 또한 기계 및 기술 지침을 제공해 주신 Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd.에 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
AccuCount 울트라 레인보우 형광 입자3.8 미크론; Spherotech, Lake Forest, IL, USA의 정량적 검출을 위해
002000680020 mM
Century Clot analyzerTianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd원리는 점탄성 방법으로 플라즈마 점도를 측정하는 것입니다
일회용 프로브 및 테스트 컵Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd
LSR Fortessa 유세포 분석기BD, 미국검출하는 데 사용
Biocytex, Marseille, France7801Megamix는 선택된 직경의 마이크로비드 혼합물로 구성됩니다: 0.5 &마이크로; m, 0.9 &마이크로; m 및 3 &m.
MP 염화칼슘 Werfen (china) MP Megamix 폴리스티렌 비드를

참고문헌

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  1. Zhang, J., Zhang, F., Dong, J. F. Coagulopathy induced by traumatic brain injury: systemic manifestation of a localized injury. Blood. 131 (18), 2001-2006 (2018).
  2. Han, C., Chen, Y. Y., Dong, J. F. Prothrombotic state associated with preeclampsia. Current Op....

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재인쇄 및 허가

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