방법 논문

고분해능 호흡 측정법을 사용한 초파리 멜라노가스터 PINK1B9-Null 돌연변이의 미토콘드리아 기능 분석

DOI:

10.3791/65664

⸱

2023년 11월 10일

 ,  , 
1Laboratory of Experimental Biochemistry and Toxicology, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Center of Natural and Exact Sciences, Federal University of Santa Maria, 2Graduate Program in Biological Sciences: Toxicological Biochemistry, Federal University of Santa Maria

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

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여기서는 PINK1B9-null 돌연변이 초파리의 생체 에너지를 분석하기 위한 고분해능 호흡 측정 프로토콜을 제시합니다. 이 분석법은 SUIT(Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration) 프로토콜을 사용합니다.

초록

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파킨슨병(PD)을 포함한 신경퇴행성 질환과 암과 같은 세포 장애는 미토콘드리아 기능의 손상과 함께 에너지 대사를 방해하는 질환 중 일부입니다. 미토콘드리아는 세포 소기관으로, 에너지 대사와 세포 생존 및 사멸에 관여하는 세포 과정을 모두 조절합니다. 이러한 이유로 미토콘드리아 기능을 평가하는 접근법은 병리학적 및 생리학적 과정에서 세포 상태에 대한 중요한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 이와 관련하여 고분해능 호흡 측정법(HRR) 프로토콜을 통해 전체 미토콘드리아 호흡 사슬 기능 또는 특정 미토콘드리아 복합체의 활동을 평가할 수 있습니다. 또한 미토콘드리아 생리학 및 생체 에너지학을 연구하려면 Drosophila melanogaster와 같은 유전 및 실험적으로 다루기 쉬운 모델이 필요합니다.

이 모델은 인간 생리학과의 유사성, 빠른 수명 주기, 쉬운 유지 관리, 비용 효율성, 높은 처리량 기능 및 최소화된 윤리적 문제와 같은 몇 가지 이점을 제공합니다. 이러한 특성은 복잡한 세포 과정을 해부하는 데 매우 유용한 도구로 총체적으로 설정됩니다. 본 연구는 Drosophila melanogaster PINK1B9-null 돌연변이를 이용하여 미토콘드리아 기능을 분석하는 방법을 설명한다. pink1 유전자는 미토콘드리아 네트워크에서 기능 장애를 일으키는 미토콘드리아를 제거하는 데 중요한 미토파지로 인식되는 과정을 통해 PTEN에 의해 유도된 추정 키나아제 1을 암호화하는 역할을 합니다. 이 유전자의 돌연변이는 상염색체 열성 조기 발병 가족성 PD와 관련이 있습니다. 이 모델은 PD의 병태생리학과 관련된 미토콘드리아 기능 장애를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

서론

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미토콘드리아는 세포사멸 조절, 칼슘 항상성, 생합성 경로 참여 등 중요한 기능을 조절하는 세포 소기관입니다. 자율적인 유전 물질을 소유함으로써 세포 유지 및 복구 과정에 기여할 수 있습니다. 그들의 구조는 세포 에너지 1,2,3에 중요한 전자 수송 사슬과 산화적 인산화를 수용합니다. 특히, 산화적 인산화(OXPHOS)를 통한 아데노신 삼인산(ATP) 생산을 통해 에너지 제어가 이루어집니다2. 미토콘드리아 기능의 손상과 함께 에너지 대사 장애는 세포의 생존과 사멸 모두에서 발생하며4,5 암과 같은 광범위한 인체 병리학 및 파킨슨병(PD)3,6과 같은 신경퇴행성 질환과 관련이 있습니다.

파킨슨병은 만성, 진행성, 신경학적 장애입니다. 이 질병의 주요 원인은 뇌 세포의 죽음이며, 특히 운동을 조절하는 신경 전달 물질 도파민의 생산을 ....

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프로토콜

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블루밍턴 초파리 스톡 센터(Bloomington Drosophila stock center, ID 번호: 34749)의 w 1118(흰색) 및 w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3(Pink1B9로 지칭)(FlyBase ID: FBgn0029891) 균주를 사용했습니다. 이 연구에서는 수컷 D. melanogaster PINK1B9-null 돌연변이를 대조군(유전적 배경)으로 사용되는 w1118 균주의 수컷 D. melanogaster와 비교합니다. 다른 파라미터는 호흡 측정 실험과 동시에 분석되어야 하며, 이는 분홍색1B9 돌연변이 파리 24,25,26에 대해 잘 설명된 흉부 기형 및 운동 문제와 같은 파리가 올바른 유전자형(Pink1B9/Y)을 갖도록 해야 합니다.

1. 동물과 주거

  1. 파리를 10m....

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결과

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여기서, OXPHOS CI (P = 0.0341) 및 OXPHOS CI &II (P = 0.0392) 상태에서의 O2 플럭스는 대조 파리와 비교할 때 PINK1B9 null fly에서 감소됩니다 (그림 4). 이 결과는 우리 그룹29,30의 이전 결과에서도 관찰되었습니다.

CI와 CII는 전자 수송 시스템(ETS)의 핵심 구성 요소로, CI는 NADH에서 유비퀴논으로 전자를 전달하는 역할을 하는 반면 CII는 석시네이트에서 유비퀴논으로 전자를 전달합니다(31,32,33).

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토론

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HRR은 D. melanogaster 및 기타 유기체의 미토콘드리아 호흡 및 에너지 대사를 연구하는 강력한 기술입니다. 미토콘드리아 기능에 대한 상세하고 정량적인 평가를 제공하여 연구원들이 세포의 생체 에너지학에 대한 통찰력을 얻을 수 있도록 합니다. 여기에 제시된 프로토콜은 D. melanogaster의 SUIT 프로토콜을 사용하여 미토콘드리아 호흡 사슬 기능 및 특정 미토콘드리아 복합체의 활성을 평가하는 방법을 설명합니다. SUIT 프로토콜은 미토콘드리아 호흡의 다양한 측면을 검사하기 위해 다양한 기질, 분리 장치 및 억제제를 체계적으로 조작하는 것을 포함합니다.

설명된 기술을 통해 OXPHOS 또는 ETS에 대한 효과, 탈수소효소 활성(CI 및 CII) 및 막 무결성(OXPHOS의 결합)으로 인한 호흡 억제를 평가할 수 있습니다. 여기서는 PD34,35

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공개 사항

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저자는 상충되는 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

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저자는 브라질 기관인 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pesquisa Pessoal de Nível Superior(CAPES EPIDEMIAS 09 #88887.505377/2020)를 인정합니다. PM(#88887.512821/2020-00) 및 TD(#88887.512883/2020-00)는 연구 펠로우십 수혜자입니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
ADP시그마-알드리치A5285아데노신 5&프라임;-디포스페이트 나트륨 염 (CAS 번호 72696-48-1); ≥ 95%; 분자량 = 501.31g/mol.
&급성; garKasvK25-1800세균학 사용
Antimycin-ASigma-AldrichA8674Antimycin A from Streptomyces sp. (CAS 번호 1397-94-0); 분자량  540 g/mol;
소 혈청 알부민 (BSA)시그마-알드리치A7030소 혈청 알부민 (CAS 번호 9048-46-8); pH 7,0 ≥ 98 %
Datlab 소프트웨어Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria20700데이터 수집 및 분석 용 소프트웨어
DigitoninSigma-AldrichD 5628CAS 번호 11024-24-1
증류수
Drosophila melanogaster strain w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3Bloomington Drosophila stock center
에서 획득Drosophila melanogaster strain  w1118산타마리아 연방 대학교에서
EGTASigma-AldrichE8145에틸렌 글리콜-비스(2-아미노에틸에테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산 (CAS 번호 13638-13-3); ≥ 97%; 분자량 = 468.28 g/mol
FCCPSigma-AldrichC2920카르보닐 시안화물 4- (트리플루오로메톡시)페닐하이드라존  (CAS 번호 370-86-5); &지; 98% (TLC), 분말 
GraphPad Prism 버전 8.0.1.데이터 수집 및 분석을 위한 소프트웨어
HepesSigma-AldrichH40344-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (CAS 번호 7365-45-9); 99,5%(적정), 세포 배양 테스트; 분자량 = 238.30g/mol
고해상도 호흡계 Oxygraph O2KOroboros Instruments, Innsbruck, Austria10022-02Startup O2K 호흡계 키트
KH2PO4Sigma-AldrichP5379인산일칼륨(CAS 번호 7778-77-0); 시약 플러스, 분자 weigt = 136.09 g / mol
KOH시그마 - 알드리치211473수산화 칼륨 (CAS 번호 1310-58-3); ACS 시약, ≥ 85 %, 펠릿
말레이트시그마 - 알드리치M1296말론 산 (CAS 번호 141-82-2); 99 %, 분자량 = 104.06 g / mol). 용액은 pH가 약 7.0으로 조정됩니다.
사과산시그마-알드리치M1000(S)-(&마이너스;)-2- 하이드 록시 숙신산 (CAS 번호 97-67-6); &지; 95% ; 분자량 = 134.09 g/mol
MES시그마-알드리치M36712-(N-모르폴리노)에탄술폰산(CAS 번호 4432-31-9); ≥ 99%(적정); 분자량 = 195.24 g / mol
MgCl2< / sub>Sigma-AldrichM8266염화 마그네슘 (CAS 번호 7786-30-3);무수, ≥ 98%, 분자량 = 95.21 g/mol
마이크로 원심분리기 튜브Eppendorf
O2K-Titration SetOroboros Instruments, Innsbruck, Austria20820-03다양한 용량의 Hamilton 주사기
OligomycinSigma-AldrichO 4876Oligomycin from  스트렙토마이세스 디아스타토크로모겐스(CAS 번호  1404-19-9); &지; 90 % 총 oligomycins 기초 (HPLC)
균질화
ProlineSigma-AldrichP0380L-Proline (CAS 번호 147-85-3); 분말; 99 %; 분자량 = 115.13 g / mol
PyruvateSigma-AldrichP2256나트륨 pyruvate (CAS 번호 113-24-6), ≥ 99%; 분자량 = 110.04 g/mol
로테논시그마-알드리치R8875로테톤(CAS 번호 83-79-4); ≥ 95 %, 분자량 394.42 g / mol
숙시 네이시그마 - 알드리치S 2378나트륨 숙시 네이트 이염기성 육수화물 (CAS 번호 6106-21-4); ≥ 99 %
자당Merck107,651,000미생물학 용 자당 (CAS 번호 57-50-1)
타우린시그마 - 알드리치T0625CAS 번호 107-35-7
획득; :에 Pistil트

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brand, M. D., Orr, A. L., Perevoshchikova, I. V., Quinlan, C. L. The role mitochondrial function and cellular bioenergetics in ageing and disease. Br J Dermatol. 169, 1-8 (2013).
  2. Ramaccini, D., et al. Mitochondrial function and dysfunction in dilated cardi....

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Mitochondrial FunctionHigh Resolution RespirometryDrosophila MelanogasterPINK1 Null MutantOxygen ConsumptionMitochondrial DysfunctionElectron Transfer SystemATP SynthesisNeurodegenerative DiseasesMitochondrial Bioenergetics

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